一种红外降解海洋硫酸多糖的方法与流程

本发明属于生物制剂领域，尤其涉及一种活性低分子量海洋硫酸多糖的制备方法。

背景技术：

天然海洋硫酸多糖聚合度高，粘度大，导致人体吸收性差，生物活性低。然而，将天然海洋硫酸多糖降解成低分子海洋硫酸多糖后，则具有抗凝血、抗癌、抗病毒等多种生物活性，可用于生物医药、保健食品等产品开发。例如，水解后的岩藻聚糖(390-2200kDa)比天然岩藻聚糖(5100kDa)表现出更强的抗癌活性(Chen et al.,2008)；王莹等(2013)将低分子量岩藻聚糖作用于小鼠氧化损伤的动物模型，其抗氧化能力显著高于未降解的岩藻聚糖。因此，高效降解海洋硫酸多糖是当前产业化开发海洋硫酸多糖亟待解决的关键技术难题。

目前，海洋硫酸多糖降解方法主要有化学降解法、生物降解法和物理降解法。(1)化学降解法：采用酸、碱水解法及氧化法等化学降解法制备低分子海洋硫酸多糖是目前国内外普遍采用的方法。这些方法虽然能够降低海洋硫酸多糖的分子量，但化学反应强烈，其后果是改变了多糖的立体结构，同时引起硫酸基团的部分脱落，最终降低了产品的生物活性甚至活性完全丧失。例如，吴永沛等(2007)在80℃的水浴条件下用0.2mol/L的HCl对从海带中提取的岩藻聚糖进行降解，4h后产物中便已有49.58％低聚糖片段的分子量低于3kDa，但硫酸根保留率仅为19.80％，且水解时间越长，硫酸根脱落的越严重。(2)生物降解法：生物降解法主要是利用酶的高效催化，是当前研究最多的方法。比如专利ZL200710008673.1采用酸法和酶法(蛋白酶和果胶酶)制备低分子量岩藻聚糖，得到分子量1000-5000Da的岩藻聚糖的方法；此方法在一定程度上能够实现高分子岩藻聚糖的低聚化，但专一性较差，产率较低，且酸降解的过程对硫酸根也存在一定程度的破坏。专利ZL201310572750.1采用β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶水解岩藻聚糖的方法。此方法虽然能够有效水解岩藻聚糖，但β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的价格高，导致产业化生产低分子岩藻聚糖的成本高昂。(3)物理降解法：物理降解法具有无酸碱或酶等化学试剂的添加，降解后不需要纯化等优势。例如，采用超声波法降解马尾藻岩藻聚糖，可使其分子量迅速下降，降解后多糖中的硫酸基团含量基本没有变化甚至有所升高(陈亚静等，2012)；然而，超声降解必须将岩藻聚糖溶解于水中，且有严格的浓度要求，生产效率低。Choi等(2013)采用γ-辐照降解岩藻聚糖可使其分子量降至7kDa，且硫酸基团含量基本不变，同时，降解后的岩藻低聚糖的抗癌活性明显提高。辐照降解岩藻聚糖虽然高效，但对安全性要求极高，存在辐射残留等缺陷，推广困难。专利ZL2010105373166采用高压水蒸汽法降解海洋硫酸多糖，实现了零添加降解硫酸多糖，保证了安全性。然而，同样受多糖溶解性的限制，多糖水溶的浓度最大为20％，并需要后续干燥等加工环节。

红外加热技术是利用其辐射传热形式，由电磁波传递能量，使物体内部分子和原子发生“共振"使物体温度升高，达到加热目的。采用红外降解海洋硫酸多糖，不仅不需要添加任何化学或生物制剂，减少了后续纯化工艺步骤；以固体粉末状态进行降解，加工时间短，无需后续的浓缩、干燥等单元操作，具有低成本、绿色环保的优势，是产业化降解海洋硫酸多糖的理想方法。然而，尚未见相关技术在制备低分子多糖，特别是在制备低分子海洋硫酸多糖中的应用。有鉴于此，本发明人研究和设计了一种红外降解海洋硫酸多糖的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种高效环保型的低分子海洋硫酸多糖的生产工艺。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种红外降解海洋硫酸多糖的方法，包括以下步骤：

将海洋硫酸多糖干粉平铺在洁净的不锈钢托盘上，其厚度为0.1-0.2cm，然后放入装有2200w红外灯的干燥箱中，保证红外灯距离岩藻聚糖粉末的高度为10-30cm，打开红外干燥箱开关，加热2-16h，即得到不同粘度值的低分子海洋硫酸多糖干粉。

作为实施例的优选方式，所述海洋硫酸多糖来源于海洋褐藻，包括海带、裙带菜、羊栖菜、鼠尾藻。

作为实施例的优选方式，所述海洋硫酸多糖来源于海洋动物，包括海参硫酸软骨素、鲨鱼硫酸软骨素、海参岩藻聚糖或鲍鱼硫酸多糖。

作为实施例的优选方式，所述的低分子海洋硫酸多糖具有抗菌活性。

作为实施例的优选方式，所述经红外加热16h的低分子海洋硫酸多糖经溶解后，过分子截留量为80000Da的超滤膜，分子量<80000Da的海洋硫酸多糖的比例达到了78.43％。

与现有的降解硫酸多糖的方法相比，本发明采用红外加热法降解海洋硫酸多糖具有如下优点：(1)不引入任何化学及生物制剂，绿色环保，减少了后续的纯化工艺；(2)以干粉状态进行降解，不受多糖溶解性限制，生产效率高，减少了溶解、干燥等单元操作；(3)操作简便，设备简单，生产成本低；(4)具有很好的生物活性，经红外降解16h后得到的低分子海带岩藻聚糖显示了良好的抑菌活性，1.0重量％浓度的低分子海带岩藻聚糖对大肠杆菌的抑菌率达到了100％。

附图说明

图1是本发明所涉及的红外降解海带岩藻聚糖的粘度值变化；

图2是本发明所涉及的未降解海带岩藻聚糖的抑菌效果；

图3是本发明所涉及的红外降解海带岩藻聚糖的抑菌效果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：

将100g海带岩藻聚糖干粉平铺在洁净的不锈钢托盘上，其厚度为0.1cm，然后放入装有2200w红外灯的干燥箱中，红外灯距离海带岩藻聚糖粉末的高度为10cm，打开红外干燥箱开关，加热2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h，即得到相对粘度值分别为84.3％、65.2％、61.3％、57.6％、44.8％、36.2％、21.4％的低分子海带岩藻聚糖干粉。如图1所示。

实施例2：

将100g海参岩藻聚糖干粉平铺在洁净的不锈钢托盘上，其厚度为0.15cm，然后放入装有2200w红外灯的干燥箱中，红外灯距离海参岩藻聚糖粉末的高度为20cm，打开红外干燥箱开关，加热2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h，即得到相对粘度值分别为81.7％、59.2％、55.3％、50.2％、42.1％、33.5％、18.2％的低分子海参岩藻聚糖干粉。

实施例3：

将100g鲨鱼硫酸软骨素干粉平铺在洁净的不锈钢托盘上，其厚度为0.2cm，然后放入装有2200w红外灯的干燥箱中，红外灯距离鲨鱼硫酸软骨素粉末的高度为30cm，打开红外干燥箱开关，加热2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h，即得到相对粘度值分别为85.6％、70.1％、65.2％、60.4％、46.3％、39.9％、26.4％的低分子鲨鱼硫酸软骨素干粉。

实施例4：低分子海带岩藻聚糖的抗菌活性

本发明为了验证所制备的低分子海洋硫酸多糖具有生物活性，采用平板涂布法评价了所得低分子海洋硫酸多糖的抑菌活性。本实验所涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株(菌种编号为ACCCNO.01623，保藏日期为2006年5月22日)由中国农业微生物菌种保藏管理中心提供。

1.实验方法

a.按实施例1的方法，制备低分子海带岩藻聚糖。

b.准确称取一定量的低分子海带岩藻聚糖(步骤a制得)及未经降解的海带岩藻聚糖分别配制浓度为6.0重量％的多糖水溶液，备用。

c.培养基的配制

采用双层培养基培养细菌。按质量百分比，培养基的配方如下：

底层培养基：蛋白胨1重量％，牛肉提取物0.3重量％，Nacl 0.5重量％，琼脂1.5重量％，配好后用4.0mol/L的NaOH溶液调pH至7.0～7.2，121℃高温灭25min，得底层培养基。

上层培养基：蛋白胨1重量％，牛肉提取物0.3重量％，Nacl 0.5重量％，琼脂1重量％，配好后用4.0mol/L的NaOH溶液调pH至7.0～7.2，121℃高温灭25min，得上层培养基。

d.菌悬液的制备

用灭过菌的接种环挑取已经活化的待测菌，放入装有10mL灭过菌的去离子水的试管中，充分震荡摇匀，逐步稀释至细菌浓度约为10⁶-10⁸cfu/mL。

e.抗菌活性的检测

将步骤b配制的海带岩藻聚糖水溶液分别加到灭菌后的培养基中混合均匀，使其最终浓度为1重量％，之后倒入平板中进行冷却。冷却后用无菌吸管吸取稀释倍数为10^-4的菌悬液100μL于培养基中，并用无菌涂布棒将菌悬液在平板上涂抹均匀，平放20min后在37℃条件下恒温倒置培养24h，培养好后进行拍照。其中以培养基中未加岩藻聚糖的作为阴性对照，加未降解岩藻聚糖的作为空白对照。采用菌落计数法计算抑制率。

2.实验结果与讨论

表1 1％浓度下不同红外降解时间的海带岩藻聚糖的抗菌活性

本实施例对比了红外降解前后以及不同降解时间的海带岩藻聚糖的抗菌活性，结果表明，未经降解的海带岩藻聚糖对大肠杆菌没有抑菌活性，如图2所示；当海带岩藻聚糖经2200w的红外灯降解2h-16h后，海带岩藻聚糖显示了抗菌活性，且随着加热时间的延长，抗菌活性越好。当降解时间达到16h时，在1.0重量％浓度下，海带岩藻聚糖对大肠杆菌的抑菌率达到了100％，如图3所示。说明经本发明方法降解的海洋硫酸多糖具有生物活性。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。