一组Protegrin‑1抗菌肽衍生物及其制备方法与应用与流程

文档序号：11803071阅读：440来源：国知局

本发明属于医药技术领域，特别涉及在医学中应用的新型抗菌肽衍生物及其制备方法。此外，本发明还涉及用于杀死微生物如细菌或真菌的制剂或复合制剂。

背景技术：

随着传统抗生素的大规模和不恰当使用，细菌耐药性问题变得日益严重，在临床上已经出现了大量能够广泛耐受抗生素的微生物与细菌，已有的抗生素对这些病原微生物与致病菌无能为力。抗菌肽(Antibacterial Peptides)，又叫抗微生物多肽(Antimicrobial Peptides)或宿主防御肽(HostDefense Peptides)，是机体先天免疫的重要组成成分，是许多生物体抵御外来致病菌侵袭的第一道屏障。由于其独特且多样的生物学功能和作用机制引起了科学界的广泛关注和研究，一方面研究抗菌肽在先天免疫中发挥作用的生物学机制，另一方面将其作为设计新型抗菌、抗感染制剂的分子模板。抗菌肽是自然进化的产物，和微生物一起已经存在了亿万年，尽管经过长期的共同进化，但抗菌肽并没有丢失其杀灭或抑制微生物的能力，或产生使微生物逃逸抗菌肽的能力，充分说明抗菌肽是研发新型高效抗生素替代品的重要突破。然而，现有研究表明，许多天然抗菌肽活性并不高，或者对真核细胞存在较高的细胞毒性，因此在作为新型抗生素替代品之前需要通过分子改良进一步提高其活性，或降低其毒性。

抗菌肽Protegrin-1(PG-1)是从猪中性粒细胞中分离得到的由18个氨基酸残基组成的猪源抗菌肽，序列中含有4个半胱氨酸，形成两对二硫键，整个分子具有二级结构β-发夹型(β-hairpin)构象，4个半胱氨酸形成2个二硫键对其二级结构的维持及抗微生物学活性起着非常重要的作用。此类化合物主要作用于靶细胞的细胞膜，通过对膜上带负电的磷脂头部的吸引而聚集在膜表面，进而传入膜中，影响膜的完整性，或是形成通道而使细胞膜破裂。已有研究表明Protegrin-1对革兰氏阴性菌、部分革兰氏阳性菌、真菌以及少数囊膜病毒具有非常强的杀菌活性，而且对许多临床耐药细菌同样具有杀菌作用。

但是，天然抗菌肽在体内易受蛋白酶影响而迅速降解失去活性，难以发挥其抗菌活性。同时天然抗菌肽资源有限，难以实现产业化应用。

技术实现要素：

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有针Protegrin-1抗菌肽衍生物、制备方法及用途中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明其中一个目的是提供一组在猪中性粒细胞分泌的抗微生物多肽Protegrin-1的基础上，利用分子改造方法设计改造而来的一组抗菌肽衍生物。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一组Protegrin-1抗菌肽衍生物，具有如(1)～(8)所示的任一氨基酸序列：

(1)如序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；

(2)如序列表SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；

(3)如序列表SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；

(4)如序列表SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；

(5)如序列表SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；

(6)如序列表SEQ ID No.6所示的氨基酸序列；

(7)如序列表SEQ ID No.7所示的氨基酸序列；

(8)如序列表SEQ ID No.8所示的氨基酸序列或，它们药学上可以接受的盐。。

作为本发明所述Protegrin-1抗菌肽衍生物的一种优选方案，其中：所述(1)～(8)所示的任一氨基酸序列，其氨基酸序列第5位和第14位Cys、第7位和第12位Cys形成2对二硫键。

本发明其中另一个目的是提供Protegrin-1抗菌肽衍生物的制备方法。

为解决上述技术问题，根据本发明的另一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种Protegrin-1抗菌肽衍生物的制备方法，包括，以多肽合成起始树脂为载体，以Fmoc保护L-氨基酸，Fmoc保护D-氨基酸为原料进行缩合，三氟乙酸/苯甲硫醚/乙二硫醇/苯甲醚裂解体系脱除保护基合成如(1)～(8)所示的任一氨基酸序列的线性多肽；将所述线性多肽合成环化多肽，其中，所述环化多肽中氨基酸序列第5位和第14位Cys、第7位和第12位Cys形成2对二硫键。

作为本发明所述Protegrin-1抗菌肽衍生物的制备方法的一种优选方案，其中：所述形成2对二硫键，包括，空气氧化第一对二硫键：将所述线性多肽溶于碳酸氢铵水溶液，调节pH至8～9，室温反应18～24h后，调节溶液至酸性，反应完全后纯化，将制备得到的液体冷冻干燥得到一环多肽；碘氧化第二对二硫键：将所述一环多肽溶于甲醇，加入碘单质，室温反应0.5～1.5h，加入抗坏血酸至溶液澄清，反应完全后纯化，将制备得到的液体冷冻干燥得到二环多肽。

作为本发明所述Protegrin-1抗菌肽衍生物的制备方法的一种优选方案，其中：所述空气氧化第一对二硫键，其中，所述碳酸氢铵水溶液为0.5～1.5mol/L；采用氨水调节pH至8～9；所述调节溶液至酸性，是待反应完全后，加入醋酸将溶液调制5≤pH＜7。

作为本发明所述Protegrin-1抗菌肽衍生物的制备方法的一种优选方案，其中：所述碘氧化第二对二硫键，其中，所述碘单质的添加量相对于所述一环多肽的添加量为1：2～3。

本发明再一个目的是提供一种Protegrin-1抗菌肽衍生物或其复合制剂在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或真菌感染引起的疾病的药物与抗菌剂方面的应用。

作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述复合制剂为所述Protegrin-1抗菌肽衍生物与聚赖氨酸的复合制剂，其中，所述Protegrin-1抗菌肽衍生物含量为40～60μg/ml，所述聚赖氨酸含量为450～550μg/ml。

作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述复合制剂为所述Protegrin-1抗菌肽衍生物与甲壳素的复合制剂，其中，所述Protegrin-1抗菌肽衍生物含量为40～60μg/ml，所述甲壳素含量为450～550μg/ml。

作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述复合制剂为所述Protegrin-1抗菌肽衍生物与壳聚糖的复合制剂，其中，所述Protegrin-1抗菌肽衍生物含量为40～60μg/ml，所述壳聚糖含量为450～550μg/ml。

本发明通过替换相应位置的氨基酸，对天然Protegrin-1抗菌肽进行分子改良，通过大量活性实验筛选出抗菌活性强、溶血活性低、在蛋白酶中更稳定的抗菌肽衍生物，且该组抗菌肽人工合成简单且成本更低，有利于工业化生产，这为研发新型抗菌剂提供了优良的候选肽。

具体实施方式

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

根据一般约定书写本文提及的所有的肽序列，其中N端氨基酸在左边，而C端氨基酸在右边，除非另外指出。在两个氨基酸残基之间的短线指示肽键。当氨基酸具有同分异构形式时，其是表示的氨基酸的L形式，除非另外特别指出。

本发明的化合物可以以药用盐的形式提供。优选的盐的实例是与药用有机酸以及聚合酸形成的那些和与无机酸形成的盐，所述有机酸如乙酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、水杨酸、甲磺酸、甲苯磺酸、三氟乙酸或双羟萘酸，所述聚合酸如鞣酸或羧甲基纤维素，所述无机酸如氢卤酸(例如，盐酸、硫酸或磷酸等)。可以使用本领域技术人员已知的获得药用盐的任何方法。

为了描述本发明的方便，使用各种氨基酸残基的常规和非常规缩写。这些缩写是本领域技术人员熟悉的，但是为了清楚在下面列出：

Asp＝D＝天冬氨酸；Ala＝A＝丙氨酸；Arg＝R＝精氨酸；

Asn＝N＝天冬酰胺；Gly＝G＝甘氨酸；Glu＝E＝谷氨酸；

Gln＝Q＝谷氨酰胺；His＝H＝组氨酸；Ile＝I＝异亮氨酸；

Leu＝L＝亮氨酸；Lys＝K＝赖氨酸；Met＝M＝甲硫氨酸；

Phe＝F＝苯丙氨酸；Pro＝P＝脯氨酸；Ser＝S＝丝氨酸；

Thr＝T＝苏氨酸；Trp＝W＝色氨酸；Tyr＝Y＝酪氨酸；

Val＝V＝缬氨酸。

本发明的其中一个目的在于提供一组具有突出抗菌活性的Protegrin-1抗菌肽衍生物。而该组Protegrin-1抗菌肽衍生物的制备方法是通过固相合成，依序偶联氨基酸，合成肽经反向高压液相色谱脱盐、纯化，采用乙腈/水/三氟乙酸系统洗脱，使得最终合成肽的样品纯度>95％，并采用电喷雾质谱(ESI-MS)测定其分子量。

本发明通过抗菌活性检测实验发现，该组Protegrin-1抗菌肽衍生物和该组Protegrin-1抗菌肽衍生物与聚赖氨酸的复合制剂以及该组Protegrin-1抗菌肽衍生物与甲壳素的复合制剂的均对革兰氏阳性与阴性菌、真菌都有很强的抑制作用，对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、链球菌(Streptococcus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aerugiNosa)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria goNorrhoeae)、白色念珠菌(Candida albicans)等标准菌株和临床分离菌株都有的很强杀灭作用。因此本发明抗菌肽可应用于制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或真菌感染引起的疾病的药物与抗菌剂。

为方便说明，本发明列举试剂名称缩写如下：

DMF：N，N-二甲基甲酰胺

DCM：二氯甲烷

NMP：N-甲基吡咯烷酮

DIC：N，N’-二异丙基碳二亚胺

TFA：三氟乙酸

DIPEA：N，N’-二异丙基乙胺

NMM：N-甲基吗啉

HOBt：1-羟基苯并三唑

HOAt：N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑

HOOBt：3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮

Cl-HOBt：6-氯-1-羟基苯并三氮唑

HBTU：苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯

HATU：2-7(偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯

PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷

PyAOP：(3H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基磷六氟磷酸盐

PPTS：对甲苯磺酸吡啶盐

DMP：2，2-二甲氧基丙烷

EDT：1，2-乙二硫醇

PIP：哌啶

TIS：三异丙基硅烷

下面以合成Protegrin-1抗菌肽衍生物SEQ No.5及其复合制剂为例进行具体说明，其余合成Protegrin-1抗菌肽衍生物SEQ No.1～4、6～8及其复合制剂的方法与SEQ No.5基本相同。

实施例1：合成Protegrin-1抗菌肽衍生物SEQ No.5

(1)合成SEQ No.5的线性多肽

称取2g替代度为0.76mmol/g的Rink Amide树脂于固相反应器中，加入DCM溶胀20min，随后加入20％PIP/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基(即：以Rink Amide树脂为载体，Fmoc保护L-氨基酸，Fmoc保护D-氨基酸为原料)，分别用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，抽干。向固相反应器中加入Fmoc-Arg(pbf)-OH(1.53mmol)、HOBt(0.25g，1.83mmol)、DIC(0.28mL，1.83mmol)、DMF(10mL)，20℃反应40min。将树脂洗涤抽干，即得Fmoc-Arg(pbf)-Rink Amide树脂，测得树脂替代度为0.35mmol/g。向树脂中加入封闭试剂8mL(醋酸酐(mmol)：DIPEA(mmol)＝1：1)，反应2h，封闭剩余的氨基，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤。加入20％PIP/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤，得H-Arg(pbf)-Rink Amide树脂；

取2g上一步得到的H-Arg(pbf)-Rink Amide树脂于固相反应器中，加入Fmoc-Gly-OH(2.1mmol)、HOBt(0.344g，2.52mmol)、DIC(0.39mL，2.52mmol)、DMF(10mL)，30℃反应2h。偶联完成度可以使用Kaiser测试检测；检测通过后，用20％PIP/DMF溶液脱除Fmoc保护基5+15min，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤。以此方法依次偶联剩余的氨基酸，得到侧链全保护多肽树脂4.68g。

将此侧链全保护多肽树脂用20％PIP/DMF溶液5mL反应5min，DMF洗涤一次，再加入20％PIP/DMF溶液5mL反应15min，抽干，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤，抽干；配置裂解液，其各组分体积比为TFA：EDT：苯甲醚：苯甲硫醚：水＝90：2.5：2.5：2.5：2.5；将裂解液加入固相反应器中，与脱除了N端保护基的产物在室温下震荡反应2h后，将反应液注入乙醚中，沉淀，离心后收集白色固体沉淀，经HPLC纯化、冷冻干燥，即合成得到SEQ No.5的线性多肽。

(2)合成SEQ No.5的环化多肽

1.空气氧化第一对二硫键：称取100mg步骤(1)中得到的SEQ No.5的线性多肽，溶于200mL 0.2M的NH₄HCO₃(3.16g)水溶液，用氨水调节pH至8-9，室温反应24h，加入醋酸调节溶液至酸性，反应完全后使用制备型HPLC纯化，将制备得到的液体冷冻干燥得到SEQ No.5的一环多肽；

2.碘氧化第二对二硫键：取一环纯品(100mg)溶于20mL甲醇，加入50mg碘单质，室温反应1h，加入适量抗坏血酸至溶液澄清，反应完全后使用制备型HPLC纯化，将制备得到的液体冷冻干燥得到SEQ No.5的二环多肽，其结构简式为：

H₂N-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys-{D-Tyr}-Cys-Arg-Gly-Arg-Phe-Cys-{D-Val}-Cys-Val-Gly-Arg-CONH₂，其氨基酸序列第5位和第14位Cys、第7位和第12位Cys形成2对二硫键。

基于上述技术方案，获得的SEQ No.1～10结构简式如下：

(1)SEQ No.1

H₂N-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys-{D-Tyr}-Cys-Arg-Gly-Arg-Phe-Cys-Val-Cys-Val-Gly-Arg-CONH₂；

(2)SEQ No.2

H₂N-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys-Tyr-Cys-Arg-Gly-Arg-{D-Phe}-Cys-Val-Cys-Val-Gly-Arg-CONH₂；

(3)SEQ No.3

H₂N-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys-Tyr-Cys-Arg-Gly-Arg-Phe-Cys-{D-Val}-Cys-Val-Gly-Arg-CONH₂；

(4)SEQ No.4

H₂N-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys-{D-Tyr}-Cys-Arg-Gly-Arg-{D-Phe}-Cys-Val-Cys-Val-Gly-Arg-CONH₂；

(5)SEQ No.5

H₂N-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys-{D-Tyr}-Cys-Arg-Gly-Arg-Phe-Cys-{D-Val}-Cys-Val-Gly-Arg-CONH₂；

(6)SEQ No.6

H₂N-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys-Tyr-Cys-Arg-Gly-Arg-{D-Phe}-Cys-{D-Val}-Cys -Val-Gly-Arg-CONH₂；

(7)SEQ No.7

H₂N-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys-{D-Tyr}-Cys-Arg-Gly-Arg-{D-Phe}-Cys-{D-Val}-Cys-Val-Gly-Arg-CONH₂；

(8)SEQ No.8

H₂N-Arg-Gly-Gly-{D-Leu}-Cys-{D-Tyr}-Cys-Arg-Gly-Arg-{D-Phe}-Cys-{D-Val}-Cys-{D-Val}-Gly-Arg-CONH₂。

(9)SEQ No.9

H₂N-Arg-Gly-Gly-Leu-{D-Cys}-Tyr-Cys-Arg-Gly-Arg-Phe-Cys-Val-Cys-Val-Gly-Arg-CONH₂；

(10)SEQ No.10

H₂N-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys-Tyr-Cys-{D-Arg}-Gly-Arg-Phe-Cys-Val-Cys-Val-Gly-Arg-CONH₂。

且上述氨基酸序列第5位和第14位Cys、第7位和第12位Cys形成2对二硫键。

实施例2：SEQ No.1～10及其复合制剂的杀菌实验

1.主要实验材料

BaCl₂(AR)，H₂SO₄(AR)，KH₂PO₄，Na₂HPO₄，SEQ No.1～8(试验浓度为40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml)，营养琼脂培养基、沙氏琼脂培养基等。

实验菌株：金色葡萄球菌(ATCC 6538)、大肠杆菌(CMCC 8099)、白色念珠菌(ATCC 10231)

2.主要实验仪器

BT125D天平，BSA224s天平，DT-1001A天平，JC101型电热鼓干燥箱，UPT-1-10T优普纯化机，LD2M-40KCS立式压力蒸汽灭菌器，YSEI永生霉菌培养箱，苏净安泰洁净工作台SW-CJ-1FD，离心机，移液枪，微孔滤头等。

3.实验步骤

(1)染菌样片的制备：取菌株3代-14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养(18-24h)，用5ml 0.03mol/LPBS缓冲液洗下菌苔，后用上述PBS稀释至所需浓度。

(2)取100微升滴于样片(2*3cm)上，使回收菌数达1*10⁴cfu/片-9*10⁴cfu/ 片。

(3)取被试样液5ml和已灭菌的PBS对照样液5ml各4管，分成4组置于4个无菌大试管内，标为实验组和对照组。

(4)用无菌镊子将染菌样片取出放入试样液和对照样液中。

(5)均匀混合，开始计时，分别作用2.5、5.0、7.5min后取出染菌样片将样片移入PBS液中，用电动混合器混合20s，使菌片上的细菌被洗脱入PBS中，取1ml离心，弃去上清液。

(6)加入1mlPBS混合均匀后加入9mlPBS试管中。

(7)作适当稀释，然后取其中2-3个稀释度，分别吸取0.5mL，置于两个平皿，用凉至40-45℃的营养琼脂培养基(细菌)或沙氏琼脂培养基(真菌)20mL作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35℃±2℃培养48h(金葡，大肠)或72h(白色念珠菌)，做活菌菌落计数。

试验重复3次，计算杀菌率：X3＝(A-B)/A×100

式中：X3——杀菌率(或抑菌率)，％；

A——对照样品平均菌落数；

B——被试样品平均菌落数。

评价标准：

杀菌率≥90％，产品有杀菌作用；

抑菌率≥50％-90％，产品有抑菌作用，抑菌率≥90％，产品有较强抑菌作用。

4.实验结果

4.1对金黄色葡萄球菌的杀菌作用

通过培养计数可知，金黄色葡萄球菌杀菌试验中，阳性对照组的平均菌落数为4.77×10⁴cfu/片。分别将8种多肽的3个不同浓度试样按照“3.实验步骤”中杀菌能力检测方法进行试验。以试验组的菌落数与阳性对照组的菌落数按照公式计算杀菌率，平均杀菌率结果如表1所示。试验结果显示，8个试样在40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml浓度下的杀菌率均>90％，根据评价标准可知，40～60μg/ml的SEQ No.1～10对金黄色葡萄球菌均具有杀菌作用。

表1 SEQ No.1～10对金黄色葡萄球菌的杀菌效果

4.2对大肠杆菌的杀菌作用

通过培养计数可知，大肠杆菌杀菌试验中，阳性对照组的平均菌落数为5.02×10⁴cfu/片。分别将8种多肽的3个不同浓度试样按照“3.实验步骤”中杀菌能力检测方法进行试验。以试验组的菌落数与阳性对照组的菌落数按照公式计算杀菌率，平均杀菌率结果如表2所示。试验结果显示，8个试样在40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml浓度下的杀菌率均>90％，根据评价标准可知，40～60μg/ml的SEQ No.1～10对大肠杆菌均具有杀菌作用。

表2 SEQ No.1～8对大肠杆菌的杀菌效果

4.3对白色念珠菌的杀菌作用

通过培养计数可知，白色念珠菌试验中，阳性对照组的平均菌落数为3.23×10⁴cfu/片。分别将8种多肽的3个不同浓度试样按照“3.实验步骤”中杀菌能力检测方法进行试验。以试验组的菌落数与阳性对照组的菌落数按照公式计算杀菌率，平均杀菌率结果如表3所示。试验结果显示，8个试样在40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml浓度下的杀菌率均>90％，根据评价标准可知，40～60μg/ml的SEQ No.1～10对白色念珠菌均具有杀菌作用。

表3 SEQ No.1～8对白色念珠菌的杀菌效果

实验结论

SEQ No.1～8对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及白色念珠菌的杀菌率均>90％，表面不同浓度的8种多肽均具有杀菌作用，而SEQ No.9和SEQ No.10杀菌效果很差，即不是所有位点的氨基酸用D型氨基酸替换后都会有好的杀菌效果。

SEQ NO.5及其复合制剂的杀菌实验

1.试验试样

选取SEQ NO.5制作复合试剂：

复方制剂1为SEQ No.5与聚赖氨酸的复合制剂；

复合制剂1配比(SEQ No.5 50μg/ml，聚赖氨酸500μg/ml)。

复方制剂2为SEQ NO.5与甲壳素的复合制剂；

复合制剂2配比(SEQ No.5 50μg/ml，甲壳素500μg/ml)。

复合制剂3为SEQ No.5与壳聚糖的复合制剂；

复合制剂3为配比(SEQ No.5 50μg/ml，壳聚糖500μg/ml)。

对照试样：

聚赖氨酸(550μg/ml)；

甲壳素(550μg/ml)；

壳聚糖(550μg/ml)。

2.实验步骤

同“SEQ No.1～8的杀菌实验中实验步骤的方法”

3.实验结果后续补充

各试样的平均杀菌率结果如表4所示。试验结果显示，复合制剂1、复合制剂2及复合制剂3的杀菌率均>94％，根据评价标准可知，三种复合制剂对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌均具有杀菌作用，且杀菌作用非常强；而聚赖氨酸和壳聚糖均在作用5.0min后，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌的杀菌率为90％左右；甲壳素也均在作用7.5min后，对三种致病菌的杀菌率为90％左右。对比复合制剂1、复合制剂2、复合制剂3、聚赖氨酸、甲壳素以及壳聚糖的实验结果可知，复合制剂1、复合制剂2和复合制剂3的杀菌效果明显强于单独的聚赖氨酸或是甲壳素或是壳聚糖的杀菌作用。

表4 复合制剂对3种致病菌的杀菌效果

实验结论

该复合制剂1、复合制剂2以及复合制剂3对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌具有杀菌作用。且杀菌效果明显强于单独的聚赖氨酸、壳聚糖以及甲壳素。

SEQ No.1～8、复合制剂1、复合制剂2以及复合制剂3的急性眼刺激实验

1、实验材料

健康成年白色家兔30只，体重2.0kg～3.0kg，由四川省实验动物专委会养殖场提供，合格证号SCXK(川)2013-14号。

试验试样：

SEQ No.1～8；复合制剂1；复合制剂2。

2、实验步骤

(1)动物适应性喂养，并确认家兔无眼疾，一个试验试样3只家兔。

(2)家兔的一侧眼结膜囊中滴入0.1ml的试验试样，被动闭合4s，30s后用生理盐水冲洗。

(3)另一侧以生理盐水作正常对照。

(4)于滴眼后1h、24h、48h和72h，肉眼观察家兔眼结膜、虹膜、角膜的刺激反应和恢复情况，并按有关标准计算眼刺激积分之树，作出评价。

(5)如果72h内未出现刺激反应，可提前终止试验。

(6)整个实验过程中，动物自由摄食饮水，室温20℃～22℃，相对湿度46％～50％。

3、评价标准

无刺激性：

3只动物的平均评分：角膜损害<1、虹膜损害<1、结膜充血<2和结膜水肿<2，或3只动物中至少有两只动物的平均评分符合上述标准。另外1只动物的刺激反应在21d内完全恢复。

轻刺激性：

3只动物中有2只动物的平均评分：角膜损害≧1；虹膜损害≧1；结膜充血≧2；结膜水肿≧2，且7d内全部动物的刺激反应完全恢复。

刺激性：

3只动物中有2只动物的平均评分：角膜损害≧1；虹膜损害≧1；结膜充血≧2；结膜水肿≧2，且21d内全部动物的刺激反应完全恢复。

4、实验结果

由表5～12的试验结果可知，SEQ No.1～8对家兔眼睛急性刺激反应的平均评分均为0，根据评价标准，该8个多肽对家兔眼睛无刺激性。表13～15为复合制剂1、复合制剂2和复合制剂3对家兔眼刺激实验结果，结果显示该复合制剂1和复合制剂2试样对家兔眼睛急性刺激反应的最高平均评分为0.33，复合制剂3对家兔眼睛急性刺激反应的平均评分均为0，根据评价标准，复合制剂1、复合制剂2和复合制剂3均对家兔眼睛无刺激性。

表5 SEQ No.1对家兔眼刺激试验结果