一种抗IL‑4R单链抗体与蛇毒L‑氨基酸氧化酶融合蛋白及应用的制作方法

本发明涉及一种抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白及其应用，属于生物技术领域的领域。

技术背景

肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，对人类生命和健康有着非常大威胁，是恶性肿瘤死亡的首位原因，其发病率仍呈持续上升趋势。对早期肺癌最有效的治疗方法是手术切除，但因手术后病人出现较高全身和局部的复发率。传统的细胞毒性药物的化疗效果已经达到了一个平台期，其进一步发展的空间极小，而且传统的细胞毒性化疗药物的毒副反应也限制其应用和发展。放射治疗对已发生的原发肿瘤就不再适合。放疗结合化疗可以通过增加肿瘤疗效，但不良反应也相应的增加，从而限制了其临床的应用。

随着分子生物学的进一步发展，分子靶向治疗必然会为肺癌的治疗开辟广阔的应用前景。靶向治疗为肺癌的治疗提供了新的策略。近二十年来，免疫毒素已成为寻找新型抗肿瘤药物一个十分活跃的研究领域。免疫毒素是将生物毒素与抗体或细胞因子连接起来的导向药物，又称作生物导弹或导向毒素。导向药物的概念最早由德国药物化学家Paul Erhlich提出，它由两部分组成：能识别并结合肿瘤细胞表面标志物的导向部分和在导向部分的引导下进入细胞并发挥细胞毒作用的效应部分。由于导向性治疗药物可特异性杀伤肿瘤细胞，具有副作用低、高效的特点，因此对一些难治愈和多药耐药的恶性肿瘤尤其有着重要意义。现在FDA已经批准的分子靶向药物如Hereeptin，Rituximab，ZD1839都成功地对那些常规疗法无效的肿瘤患者显现出惊人的疗效。白喉毒素与IL-2重组的免疫毒素也经FDA批准作为人皮肤T细胞淋巴瘤的抢救药物上市，还有很多已呈现出显著的抗肿瘤作用的其它免疫毒素和靶向药物，目前正在进行I/II期临床试验。

利用分子技术和基因技术进行肿瘤的免疫治疗的研究也日益增多，其中一些针对肺癌分子的靶向药物己经在临床前研究和临床应用上显示出一定抗癌活性。如针对表皮生长因子受体，蛋白激酶C，血管内皮生长因子，环氧化酶-2，法尼基转移酶等调节转录的启动和与转录因子发生相互作用，参与肿瘤的发生、发展和转移有关的靶目标都可能作为肺癌治疗的分子靶向目标。

以往的研究已经证实IL-4R也表达于许多正常的造血细胞和非造血细胞。Puri等报道了IL4-PE(PE:假单胞杆菌外毒素)对T细胞、B细胞和CD34+前体细胞等静止性的造血细胞仅有很小的敏感性，因为这些细胞表达的IL-4R水平很低。IL4-PE对高水平表达的IL-4R的成纤维细胞、内皮细胞等非造血细胞没有表现出明显的毒性反应，与同样高表达IL-4R的肿瘤细胞相反。他们通过毒理学研究，当IL4-PE静脉注射断尾猴(其体内细胞可以与人IL-4R结合)，只有在非常大的剂量时(200μg/kg)才会对肝脏产生毒性反应，而对其它器官及血液系统不会产生毒性反应。这些研究成果表明IL-4R有高度的肿瘤细胞表达特异性，具备作为免疫毒素作用靶点的要求，其配体或抗体易于获得、便于实验，作为免疫毒素的载体它们无需人源化改造。

免疫毒素是近年来新兴的一种肿瘤导向治疗方法。它利用抗肿瘤单抗与肿瘤细胞的特异性结合，将生物毒蛋白与抗体偶联，去定向攻击肿瘤细胞，而其对正常组织的杀伤较小，故被形象地称为“生物导弹”。免疫毒素的导向载体部分与毒素“弹头”部分的连接方式有两种，包括化学偶联法和基因工程融合法。通过将毒素和单克隆抗体在体外进行化学偶联途径制备的免疫毒素称为第一代免疫毒素。而通过将毒素的编码基因与肿瘤细胞表面特异性分子的配体基因进行克隆重组，然后在大肠杆菌中高效表达，从而制备出的免疫毒素称为第二代免疫毒素。但第一代免疫毒素存在分子量大，稳定性不好等缺点。

自20世纪80年代，Huston和Bird等分别利用基因工程技术在体外获得具有与天然抗体分子相似的抗原亲和力及特异性的单链Fv蛋白，被称为单链抗体(single chain variable fragment，scFv)，其最重要的进展是噬菌体抗体库技术的建立，被誉为又一次革命性进展。噬菌体展示技术将表型和基因型联系在一起，不经人体免疫，绕过杂交瘤技术，通过几轮“吸附-洗脱-扩增”的体外筛选富集过程，即可得到人源的基因工程抗体。scFv具有分子质量小，免疫原性低，无Fc端，不易与具有Fc受体的靶细胞结合，对肿瘤组织的穿透力强，可以与其他效应分子连接成抗肿瘤融合蛋白等特点，是保持抗体亲和性和特异性的最小功能性抗体片段。因此，scFv还可作为载体与药物、放射性同位素、细胞毒素、破坏细胞结构的酶及细胞因子等结合，而形成对肿瘤细胞有特异性杀伤作用的复合物用于肿瘤的导向治疗。目前报道较多的是构建重组单链免疫毒素，重组单链免疫毒素是将单链抗体基因与毒素基因相连，原核表达scFv与毒素的融合蛋白，利用抗体的特异性将毒素带到指定部位，而发挥杀伤作用，这种重组单链免疫毒素去除了毒素原有的受体结合位点，毒性低，还具有免疫原性低、易于穿透肿瘤组织、分子稳定性好、靶向性好等优点，在肿瘤等疾病的导向治疗中比完整抗体更 具优势和潜力。

肿瘤靶向治疗具有特异性载体的优越性，能将药物或其它具有杀伤肿瘤细胞活性的物质，有选择性地运送到肿瘤部位，最大限度地杀伤肿瘤细胞，而不影响正常细胞的功能，从而提高疗效、减少毒副作用，它是一种有异于传统手术、放疗、化疗的新的治疗模式。现在靶向治疗己成功应用于乳癌、淋巴瘤、胃肠道间质瘤、黑色素瘤、卵巢癌和大肠癌等恶性肿瘤的治疗。

由单一的抗原决定簇刺激机体免疫系统产生的抗体为单克隆抗体，是第二代抗体。但由于鼠源单克隆抗体对人体而言是异源蛋白抗原，可诱发人体免疫系统产生人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody,HAMA)，加上鼠源性单克隆抗体在人体的半衰期短(1-2d)，因而临床应用受到了限制。

完整抗体由两条完全相同的重链(heavy chain,H)和两条完全相同的轻链(light chain,L)构成，相对分子质量较大。通过对抗体基因进行人工改造，使其只表达可变区(variable region,V)，即通过采用人工合成的连接肽(linker)基因将抗体重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)连接成重组基因，由重组基因表达的抗体称为单链抗体(single chain Fv,ScFv)。到目前为止，scFv是分子量最小的抗体，相对分子质量约为25000，仅为完整抗体的1/6。ScFv有众多的优势，如分子量小，穿透力强，与抗原结合能力较好等，也克服了单克隆抗体的异源等方面弱点，因此具有广阔的应用前景和推广价值。

竹叶青蛇毒LAAO对多种癌细胞具有直接杀伤和诱导调亡的作用，但对肿瘤杀伤作用没有选择性；白介素-4受体(IL-4R)在癌细胞上特异性过度表达，是抗癌药物作用的良好靶标。但目前尚未有构建抗IL-4R单链抗体与竹叶青蛇毒LAAO的融合蛋白用于靶向治疗肺癌的相关报道。

技术实现要素：
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本发明的目的在于，提供一种抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白及其应用。本发明采用分子生物学技术抗IL-4R单链抗体基因(scFv)与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合基因的表达载体，在体外进行体外表达，重组抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，所述抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白可用于治疗肺癌，疗效好，基本无副作用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案实现：

一种抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，所述融合蛋白制备方法：通过 重叠延伸PCR技术方法将抗IL-4R单链抗体与竹叶青蛇毒LAAO基因连接成scFv-LAAO融合基因，构建重组质粒pET28a-scFv-LAAO，转入BL21(DE3)原核表达菌，诱导表达scFv-LAAO融合蛋白，即得。

前述的抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，所述融合蛋白的制备具体包括以下步骤：

(1)选择酶切位点为EcoRⅠ和XhoⅠ的scFv基因序列，将scFv与LAAO两段基因通过重叠延伸PCR技术进行连接，连接前将scFv基因序列的XhoⅠ酶切位点去掉，并在LAAO基因的3’端加上XhoⅠ酶切位点，在竹叶青蛇毒LAAO基因序列5’端加上带有一段与抗IL-4R单链抗体scFv基因序列相同的重叠序列，以及一段连接肽连接基因，另外在“重叠序列”基因序列的3’端加上XhoⅠ酶切位点；

其中，设计引物F1和引物F2去除抗IL-4R单链抗体scFv基因序列的Xho I酶切位点；

(2)设计引物F1和F3，通过SOE-PCR技术连接抗IL-4R单链抗体scFv基因与竹叶青蛇毒LAAO基因，得融合基因scFv-LAAO；

(3)pET-28a载体/scFv-LAAO基因片段的双酶切与目的片段回收：设计反应体系：scFv-LAAO基因片段5-15μL，XhoⅠ、EcoRⅠ各1-3μL，10×Buffer Tango 2-3μL，ddH₂O 30-40μL；以上成分加入PCR管中，于35-40℃酶切3-5h，78-82℃下灭活XhoⅠ酶18-22min后；冷却至10-14℃，再加入1.5-2.5μL EcoRⅠ内切酶，35-40℃酶切3-5h，60-70℃，灭活18-22min；取scFv-LAAO基因片段进行1％琼脂糖凝胶电泳，分别回收目的片段；按照同样方法对pET-28a载体进行双酶切和回收目的片段；

(4)重组质粒pET-28a-scFv-LAAO的构建与转化：取经过XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切的pET-28a载体目的片段5-15μL、scFv-LAAO双酶切目的片段35-45μL、Rapid T4DNA ligase 1-3μL、快速连接缓冲液5-25μL、ddH₂O 15-20μL，14-18℃过夜；参照《分子克隆实验指南》中的质粒转化方法，将构建的pET-28a-scFv-LAAO重组质粒导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，复苏后进行培养；所述快速缓冲液含Tris-HCl 0.1mol/L、MgCl₂20mmol/L、二硫苏糖醇DTT20mmol/L、三磷酸腺苷ATP 0.4mmol/L、盐酸亚精胺1mmol/L和牛血清白蛋白BSA 0.1mg/mL；

(5)重组质粒酶切鉴定和蛋白质分子量大小预测：取10个单菌落用装有15mL的TB培养液(卡那霉素50μg/mL)的100mL培养瓶中，于36-38℃环境下震荡培养至0D₆₀₀＝0.6～0.8，用高纯质粒小量制备试剂盒提取质粒；依次用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ对该质粒进行双酶切鉴定；将成功酶切的质粒送进行测序，并对测序结果进行蛋白质氨基酸序列翻译，并对 翻译结果进行预测分析；

(6)重组毒素scFv-LAAO抗体蛋白的诱导表达：取平板上的单个菌落接种至装有8-12mL的含卡那霉素45-55μg/mL的TB培养基的50mL锥形瓶中，于35-40℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.2～0.4；取菌液3500-4500rpm离心10-20min，重复三次，转移菌液至装有100mL含卡那霉素50μg/mL的TB培养基的500mL锥形瓶中，于35-40℃下振荡培养至OD₆₀₀＝0.4～0.6，加入浓度为0.5-1.5mM的IPTG，于35-40℃振荡培养诱导重组蛋白表达2-4h，即得。

前述的抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，其特征在于：所述scFv基因序列为：

GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCTGCAG.CAGTCCGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTCCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCCTCACCAGCTACTATATGTACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCCACCAATGGTGGTTCTAACTTCAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACATCATACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGTCCCTGGGATGGGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAAAGGAGTAGTTACCCGTACACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCGGCCGCAGAATGACTCGAG。

前述的抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，所述引物F1为：

5’-GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCT-3’。

前述的抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，所述引物F2为：

5’-GCTGAAACGGGCGGCCGCAGAA-3’。

前述的抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，所述引物F3为：

5’-ATGACGATGAACTTTAACTCGAG-3’。

前述的抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，所述步骤(2)为：去除XhoⅠ酶切位点的scFv基因片段15μL，LAAO基因片段15μL，1μL引物F1，1μL引物F3，8μL ddH₂O； 反应程序：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min重复30个循环；72℃延伸10min；PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳并用胶回收试剂盒回收基因片段。

前述的抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，所述步骤(3)为：pET-28a载体/scFv-LAAO基因片段的双酶切与目的片段回收：设计反应体系：scFv-LAAO基因片段10μL，XhoⅠ、EcoRⅠ各2μL，10×Buffer Tango 2.5μL，ddH₂O 35.5μL；以上成分加入PCR管中，于37℃酶切4h，80℃，20min灭活XhoⅠ酶；待冷却至12℃，再加入2μL EcoRⅠ内切酶，37℃酶切4h，65℃，灭活20min；取scFv-LAAO基因片段进行1％琼脂糖凝胶电泳分别回收目的片段；按照同样方法对pET-28a载体进行双酶切和回收目的片段。

前述的抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，所述步骤(6)为：重组毒素scFv-LAAO抗体蛋白的诱导表达：挑取平板上的单个菌落接种至装有10mL的含卡那霉素50μg/mL的TB培养基的50mL锥形瓶中，于37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.2～0.4；取菌液4000rpm离心15min，重复三次，转移菌液至装有100mL含卡那霉素50μg/mL的TB培养基的500mL锥形瓶中，于37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.4～0.6，加入浓度为1mM的IPTG，于37℃快速振荡培养诱导重组蛋白表达3h，即得。

一种前述的抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白的应用，包括用于治疗肺癌及其并发症。

蛇毒中的LAAO成分是一种有潜力的抗肿瘤制剂，将其开发为一种新型的抗肿瘤药，具有广阔的生产和临床应用前景。竹叶青蛇毒LAAO具有诱导癌细胞凋亡和抗菌作用；王鸿程将抗白介素-4受体单克隆抗体与眼镜蛇毒细胞毒素构建的免疫毒素靶向治疗胰腺癌，取得很好的效果；重组竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶蛋白对肿瘤细胞有显著的抑制殖作用。然而，竹叶青蛇毒LAAO对多种癌细胞具有直接杀伤和诱导调亡的作用，但对肿瘤杀伤作用没有选择性，白介素-4受体(IL-4R)在癌细胞上特异性过度表达，是抗癌药物作用的良好靶标。故本研究成功制备抗IL-4R单链抗体与竹叶青蛇毒LAAO的融合蛋白，并具有一定靶向抗肿瘤作用，研究结果为开发利用scFv-LAAO融合蛋白提供实验依据，为进一步研制新型的抗肿瘤药物打基础。

本发明采用分子生物学手段将编码抗IL-4R单链抗体片段基因(scFv)和编码竹叶青蛇毒的基因LAAO构建成复合基因(scFv-LAAO)，插入载体pET-28a使其通过BL21(DE3)原核表达菌表达融合蛋白，并对此重组蛋白进行靶向治疗肺癌的实验研究，旨在研制新型的肺癌的靶向治疗药物。

申请人进行了下列实验，可证明本发明具有有效的效果；

实验例

1实验材料

E.coli BL21(DE3)由本实验室保存。pET-28a，由上海英骏生物公司提供。Anti-6×His抗体[GT359](HRP)(批号：GR212114-6)与Rabbit anti-mouse antibody(批号：990150311)购自Abcam公司。卡那霉素(批号：4240320)购自北京索莱宝生物科技有限公司，XhoⅠenzyme(批号：00238777)与EcoRⅠenzyme(批号：00189088)购自美国Thermo Scientific公司。SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(批号：0020150129)考马斯亮蓝R250(批号：416B035)与ECL Plus荧光检测试剂(ECL超敏发光液)(批号：20150128)，蛋白Marker PR1800(22KD-120KD)(批号：PR1800)，4×蛋白上样缓冲液(含DTT)(批号：20150224)购自北京索莱宝生物科技有限公司。快速DNA连接试剂盒(T4连接酶)(批号：20150423)购自北京索莱宝科技有限公司，PVDF膜(批号：K4CA1978G)购自Millipore公司；健康昆系小鼠(4-6周龄、体重18～20g的雄性清洁级)；人肺腺癌细胞株H460，购自中科院生物化学与细胞生物学研究所。

2方法

2.1竹叶青蛇毒LAAO基因设计与合成

scFv基因的制备已经完成。scFv基因序列选择的酶切位点为EcoRⅠ和XhoⅠ，在将scFv与LAAO两段基因通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)进行连接前将scFv的XhoⅠ酶切位点去掉，并在LAAO基因的3’端加上XhoⅠ酶切位点。SOE-PCR成功后将保持EcoRⅠ和XhoⅠ以适用于pET-28a载体。在LAAO序列5’端加上带有一段与抗IL-4R单链抗体scFv基因序列相同的重叠序列(40bp)，以及一段连接肽(linker)基因，委托上海英俊生物公司合成，将其在命名为“重叠序列-linker-LAAO”，并在该基因序列的3’端加上XhoⅠ酶切位点。委托上海英俊生物公司合成的scFv基因序列如下：

GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCTGCAG.CAGTCCGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTCCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCCTCACCAGCTACTATATGTACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCCACCAATGGTGGTTCTAACTTCAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACATCATACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGTCCCTGGGATGGGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGACAT TGAGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAAAGGAGTAGTTACCCGTACACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCGGCCGCAGAATGACTCGAG。

“重叠序列-linker-LAAO”基因序列如下：

CTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCGGCCGCAGAAAAGCTTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGTCGACATGAATGTCTTCTTTATGTTGTCACTGCTGTTCTCGGCTGCCTTGGGACGCTGTGCAGATGACAGAAACCCCCTAGAGGCATGCTTCCGAGAAACTGACTATGAAGTTTTTCTAGAGATCGCCAGAAATGGTCTGACCGCGACATCAAACCCAATTCATGTTGTGATTGTAGGTGCAGGAATGTCTGGGCTTAGTGCAGCCTATGTTCTTGCAGGGGCTGGACATGAGGTGACAGTTCTTGAAGCCAGTGAACGTGCGGGAGGACGAGTGAGGACTTATCGAAATGACGAAGAAGGCTGGTATGCCAATCTCGGGCCCATGCGTTTACCTGAGAAACACAGGATTGTCCGGGAATATATCAGAAAGTTTAATCTGCAGTTGAATGAATTTTCTCAGGAATTTGACAATGCCTGGCATTTTGTCAAAAACATCAGGAAGACAGTAGGGGAAGTCAAGATTGACCCTGGCGTCTTGAAATATCCCGTGAAGCCTTCAGAAGAAGGCAAAAGTGCTGAACAGCTATATGAAGAGTCCCTCAGAAAGGTTGAAAAAGAATTAAAAAGGACTAACTGCAGTTACATACTAAATAAATATGACACCTACTCAACGAAGGAGTATCTAATTAAAGAAGGAAATCTGAGCCCTGGAGCTGTAGATATGATTGGAGACTTAATGAATGAAGATGCTGGCTATTATGTGTCTTTTATTGAGAGCATGAAACATGATGATATCTTCGCTTATGAAAAAAGATTCGATGAAATTGTTGATGGAATGGATAAGTTGCCAACATCCATGTATCGAGCCATTGAGGAAAAGGTGCATTTCAATGCCCAAGTAATCAAGATACAGAAGAATGCCGAGGAAGTCACAGTGACATATCATACCTTAGAACCGGACACGTCGTTTGTGACAGCCGATTATGTCATTGTATGCACTACGTCAAGGGCCGCCCGTCGCATCAAGTTTGAACCACCCCTTCCGCTAAAGAAAGCGCATGCTCCGAGGTCTGTCCACTACAGAAGTGGCACCAAGATCTTCCTCACTTGCACTAAGAAATTTCGGGAGGATGAAGGCATTCATGGTGGGAAGTCCACAACTGATCTTCCATCCCGATTCATCTACTTCCCTAACCATAACTTTACTAGTGGCGTTGGGGTTATTATAGCCTATGGCATTGGTGATGATGCCAATTTCTTTCAAGCTCTTGATTTGAAGGACTGTGGTGATATTGTCATTAATGACCTTTCATTGATCCATCAGCTGCCCAGGGAAGAGATCCAGACCTTCTGTTATCCCTCAATGATTCAAATTTGGAGCCTGGATAAGTATGCTATGGGTGGTATAACCACCTTCACTCCCTACCAGTTTCAACATTTTAGTGAAGCGCTCACTTCACATGTAGACAGAATCTACTTTGCAGGCCAGTATACGGCCCATGCTCATGGTTGGATTGACAGCTCAATTATGTCAGGGCTGACAGCAGCAAGAGATGTGAATCGTGCTTCTGAGAATCCATCAGGAATCCACCTGAGCAATGACGATGAACTTTAACTCGAG。

重叠区碱基序列：CTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCGGCCGCAGAA。

2.2引物设计

设计引物F1和引物F2去除抗IL-4R单链抗体scFv基因序列的Xho I酶切位点；根据抗IL-4R单链抗体scFv基因序列与合成的“重叠序列-linker-LAAO”基因序列，设计引物F1和F3，通过SOE-PCR技术连接抗IL-4R单链抗体(scFv)与竹叶青蛇毒LAAO基因成融合基因scFv-LAAO。委托上海英俊生物公司合成的引物序列如下：

引物F1：5’-GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCT-3’；

引物F2：5’-GCTGAAACGGGCGGCCGCAGAA-3’；

引物F3：5’-ATGACGATGAACTTTAACTCGAG-3’。

2.3抗IL-4R单链抗体(scFv)与竹叶青蛇毒LAAO基因的连接

设计反应体系为：去除XhoⅠ酶切位点的scFv基因片段15μL，LAAO基因片段15μL，1μL引物F1，1μL引物F3，8μL ddH₂O。反应程序：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min重复30个循环；72℃延伸10min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳并用胶回收试剂盒回收基因片段。

2.4pET-28a载体/scFv-LAAO基因片段的双酶切与目的片段回收

设计反应体系：scFv-LAAO基因片段10μL，XhoⅠ/EcoRⅠ各2μL，10×Buffer Tango 2.5μL，ddH₂O 35.5μL。将以上成分加入PCR管中，于37℃酶切4h，80℃，20min灭活XhoⅠ酶。待冷却至12℃，再加入2μL EcoRⅠ内切酶，37℃酶切4h，65℃，灭活20min。取scFv-LAAO基因片段进行1％琼脂糖凝胶电泳分别回收目的片段。按照同样方法对pET-28a载体进行双酶切和回收目的片段。

2.5重组质粒pET-28a-scFv-LAAO的构建与转化

按照北京索莱宝科技有限公司的快速DNA连接试剂盒(T4连接酶)说明书进行连接pET-28a-scFv-LAAO融合基因，pET-28a载体双酶切目的片段：10μL；scFv-LAAO双酶切目的片段：40μL；Rapid T4DNA ligase：2μL；2快速连接缓冲液：20μL；ddH₂O：18μL。将该反应体系置于16℃过夜；参照《分子克隆实验指南》，将pET-28a重组质粒scFv-LAAO 导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，复苏后进行培养。

2.6重组质粒酶切鉴定鉴定和蛋白质预测

挑取10个单菌落用装有15mL的TB培养液(卡那霉素50μg/mL)的100mL培养瓶中，于37℃环境下震荡培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，用高纯质粒小量制备试剂盒提取质粒。先后用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ对该质粒进行双酶切鉴定；将成功酶切的质粒送上海英骏生物公司测序，利用DNAStar7.10软件对测序结果进行蛋白质氨基酸序列翻译，并对翻译结果进行预测分析。

2.7重组毒素scFv-LAAO抗体蛋白的诱导表达

挑取平板上的单个菌落接种至装有10mL的TB培养基(含卡那霉素50μg/mL)的50mL锥形瓶中于37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.2～0.4。取菌液4000rpm离心15min，反复三次。转移菌液至装有100mL的TB培养基(卡那霉素50μg/mL)的500mL锥形瓶中，于37℃快速振荡培养至OD₆₀₀＝0.4～0.6，加入终浓度为1mM的IPTG，于37℃快速振荡培养诱导重组蛋白表达3h。

2.8SDS-PAGE及Western-Blot检测表达蛋白

将诱导重组蛋白表达3h的菌液进行离心，将上清和菌体分别进行SDS-PAGE分析，确定为可溶性表达后，取100μL表达菌上清取加入20μL的4×蛋白上样缓冲液(含DTT)混合，于沸水中加热使蛋白变性，冷却至常温后进行离心，取上清液用SDS-PAGE方法分离样品中的蛋白，并进行考马斯亮蓝染色和Western-Blot分析。

2.9MTT法测定scFv-LAAO融合蛋白对人肺腺癌细胞株H460的抑制作用

用低血清1640培养基将培养的人肺腺癌细胞株H460稀释至1～2×10⁵个/mL，每孔100μL接种96孔培养板，在5％的CO₂浓度培养箱中于37℃培养至细胞贴壁后弃培养液。实验设置空白对照组、环磷酰胺组和高、中、低融合蛋白组(融合蛋白组用低血清1640培养基配置成终浓度分别为4.0、2.0、1.0mg/mL)。空白对照组加入等量的低血清1640培养基。每组每个浓度设3个平行孔，培养4h取出培养板，每孔加入50μL的MTT(1mg/mL),4h后弃MTT，加入DMSO 100μL/孔溶解formazan结晶。环磷酰胺组用药剂量终浓度为2.0mg/mL，处理方法同融合蛋白组。用酶标仪检测各组每孔的OD₄₉₀值，根据OD₄₉₀值计算不同浓度的融合蛋白对肺癌细胞的增殖抑制率。增殖抑制率(IR)(％)＝[(对照组OD值-药物作用组OD值)/对照组OD值]×100％。

2.10抗IL-4R单链抗体与LAAO融合蛋白对人肺腺癌细胞株H460荷瘤小鼠抑瘤率和生 命延长率影响

将健康昆系小鼠动物随机分5组，每组15只。融合蛋白组包含高、中、低剂量三个小组(100、50和20mg/kg)；其余3组分别为小鼠肺癌实体瘤模型组和环磷酰胺组(腹腔注射(0.1mL/10g体重))。模型组制备方法：将人肺癌细胞复苏后进行培养，调整活细胞数至1×106个/mL，在小鼠右腋下注射接种0.2mL/只，3周后，荷瘤肺癌小鼠出现肿块。

所有动物按照各组剂量每天给药1次，连续10d。停药第7d后，每组处死5只小鼠，剖取瘤块进行称重。根据计算公式，肿瘤抑制率(％)＝(对照组平均瘤重－给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100，计算抑瘤率。

每组余下小鼠5只停药后，继续观察小鼠存活天数，计算小鼠生命延长率。生命延长率(％)＝(给药组平均存活天数－对照组平均存活天数)/对照组平均存活天数×100。

2.11数据统计

用SPSS16.0软件进行分析，统计结果用“x^_±s”来表示。

3结果

3.1SOE-PCR结果

通过SOE-PCR连接的scFv-LAAO基因进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图1，在2000～3000bp之间有一条明显的条带，与预期2355bp长度相似，表明scFv与LAAO两段基因连接成功。

3.2筛选后scFv-LAAO酶切鉴定

用限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ对重组质粒进行双酶切鉴定，通过1％琼脂糖凝胶进行电泳后在2000～3000bp之间有一条明显的条带，符合插入的scFv-LAAO片段大小(图2)。

3.3scFv-LAAO序列分析

将成功酶切的质粒送上海英骏生物公司测序，测序结果进行通过Geneious9.1.2软件分析scFv-LAAO序列共计2355bp，利用DNAStar7.10软件对测序结果进行蛋白质氨基酸序列翻译，scFv-LAAO序列能编码785个氨基酸，蛋白分子量约在86KD左右。

scFv-LAAO序列为：

GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCCGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTCCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCCTCACCAGCTACTATATGTACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCCACCAATGGTGGTTCTAACTTCAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACATCATACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGTCCCTGGGATGGGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACC GTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAAAGGAGTAGTTACCCGTACACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCGGCCGCAGAAAAGCTTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGTCGACATGAATGTCTTCTTTATGTTGTCACTGCTGTTCTCGGCTGCCTTGGGACGCTGTGCAGATGACAGAAACCCCCTAGAGGCATGCTTCCGAGAAACTGACTATGAAGTTTTTCTAGAGATCGCCAGAAATGGTCTGACCGCGACATCAAACCCAATTCATGTTGTGATTGTAGGTGCAGGAATGTCTGGGCTTAGTGCAGCCTATGTTCTTGCAGGGGCTGGACATGAGGTGACAGTTCTTGAAGCCAGTGAACGTGCGGGAGGACGAGTGAGGACTTATCGAAATGACGAAGAAGGCTGGTATGCCAATCTCGGGCCCATGCGTTTACCTGAGAAACACAGGATTGTCCGGGAATATATCAGAAAGTTTAATCTGCAGTTGAATGAATTTTCTCAGGAATTTGACAATGCCTGGCATTTTGTCAAAAACATCAGGAAGACAGTAGGGGAAGTCAAGATTGACCCTGGCGTCTTGAAATATCCCGTGAAGCCTTCAGAAGAAGGCAAAAGTGCTGAACAGCTATATGAAGAGTCCCTCAGAAAGGTTGAAAAAGAATTAAAAAGGACTAACTGCAGTTACATACTAAATAAATATGACACCTACTCAACGAAGGAGTATCTAATTAAAGAAGGAAATCTGAGCCCTGGAGCTGTAGATATGATTGGAGACTTAATGAATGAAGATGCTGGCTATTATGTGTCTTTTATTGAGAGCATGAAACATGATGATATCTTCGCTTATGAAAAAAGATTCGATGAAATTGTTGATGGAATGGATAAGTTGCCAACATCCATGTATCGAGCCATTGAGGAAAAGGTGCATTTCAATGCCCAAGTAATCAAGATACAGAAGAATGCCGAGGAAGTCACAGTGACATATCATACCTTAGAACCGGACACGTCGTTTGTGACAGCCGATTATGTCATTGTATGCACTACGTCAAGGGCCGCCCGTCGCATCAAGTTTGAACCACCCCTTCCGCTAAAGAAAGCGCATGCTCCGAGGTCTGTCCACTACAGAAGTGGCACCAAGATCTTCCTCACTTGCACTAAGAAATTTCGGGAGGATGAAGGCATTCATGGTGGGAAGTCCACAACTGATCTTCCATCCCGATTCATCTACTTCCCTAACCATAACTTTACTAGTGGCGTTGGGGTTATTATAGCCTATGGCATTGGTGATGATGCCAATTTCTTTCAAGCTCTTGATTTGAAGGACTGTGGTGATATTGTCATTAATGACCTTTCATTGATCCATCAGCTGCCCAGGGAAGAGATCCAGACCTTCTGTTATCCCTCAATGATTCAAATTTGGAGCCTGGATAAGTATGCTATGGGTGGT ATAACCACCTTCACTCCCTACCAGTTTCAACATTTTAGTGAAGCGCTCACTTCACATGTAGACAGAATCTACTTTGCAGGCCAGTATACGGCCCATGCTCATGGTTGGATTGACAGCTCAATTATGTCAGGGCTGACAGCAGCAAGAGATGTGAATCGTGCTTCTGAGAATCCATCAGGAATCCACCTGAGCAATGACGATGAACTTTAACTCGAG。

3.4SDS-PAGE分析

考马斯亮蓝染色结果表明，经过不同条件的表达实验，确定scFv-LAAO以可溶性形式表达。诱导表达的最佳方案为IPTG浓度1mM，37℃环境下保持一定通气量振荡培养3h(图4)。

3.5Western-Blot检测scFv-LAAO蛋白

scFv-LAAO蛋白在X光胶片下成像的结果也显示出了如预期设想的含有His-tag的目的蛋白的成功表达(图5)，位置与预期的大小86KD相符，呈可溶性表达。

3.6scFv-LAAO融合蛋白在体外对人肺腺癌细胞株H460的活性测定

MTT法检测scFv-LAAO融合蛋白对人肺腺癌细胞株H460生长的影响结果显示，scFv-LAAO对肺癌细胞有明显抑制作用，高、中、低浓度融合蛋白组与模型对照组差异极显著(P<0.01)，剂量的增加后抑制作用迅速增强，呈明显的剂量依赖性(表1)。

表1融合蛋白对人肺腺癌细胞株的影响(n＝5)

注：与模型组比较，^##P<0.01。

3.7scFv-LAAO融合蛋白对人肺腺癌细胞株H460荷瘤小鼠抑瘤率和生命延长率的影响

荷瘤小鼠注射scFv-LAAO融合蛋白后，高、中、低各组(100、50、20mg/kg体重)对小鼠实体瘤均有明显的抑制作用。结果表明：在对荷瘤小鼠抑瘤方面，高、中、低各组融合蛋白与模型对照组相比为差异极显著(P<0.01)(表2)；对肺癌荷瘤小鼠生命延长的影响方面，各纯化融合蛋白组与模型对照组差异极显著(P<0.01)(表3)。

表2融合蛋白对肺癌荷瘤小鼠抑瘤率的影响(n＝5)

注：与模型组比较，^##P<0.01；整个过程有小鼠死亡，因此，每组取5只。

表3融合蛋白对肺癌荷瘤小鼠生命延长率的影响(n＝5)

注：与模型组比较，^##P<0.01；整个过程有小鼠死亡，因此，每组取5只。

将两段基因连接形成新的融合基因最常用的和效果最好的方法为重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)，这项技术在医学和分子生物学研究等领域得到广泛应用。SOE-PCR的主要原理是用PCR方法将两段基因扩增出一段长约40bp的碱基序列重叠区，再通过两段基因的上、下游引物进行连接与扩增。因竹叶青蛇毒LAAO基因是由人工合成的，故在5’-端设计了抗IL-4R单链抗体(scFv)的3’-端的重叠区用于两段基因的连接桥梁，同时在基因序列时在3’-端加上了XhoⅠ酶切位点，并加上了一条连接肽用于蛋白形成时的正确空间折叠。其目的是简化SOE-PCR的操作过程和引物设计，其中40bp碱基序列重叠区的长度有利于两段基因的成功连接^[14]。单链抗体(scFv)是噬菌体抗体库技术的建立，被誉为又一次革命性进展，其产生依赖于反转录PCR扩增全套免疫球蛋白可变区基因、大肠杆菌表达分泌功能性免疫球蛋白分子片段的成功和噬菌体表面展示技术的建立。scFv对肿瘤组织的穿透力强，可以与其他效应分子连接成抗肿瘤融合蛋白等特点，是保持抗体亲和性和特异性的最小功能性抗体片段，广泛应用于医学和生物技术研究领域。

附图说明

图1是SOE-PCR产物琼脂糖电泳检测；其中，M:Marker DNA2000；1:scFv与LAAO连接的PCR产物；

图2是重组质粒的XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切；(M:Marker DNA10000；1：XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后的质粒)；

图3是scFv-LAAO蛋白序列预测分析；

图4是融合蛋白scFv-LAAO考马斯亮蓝染色(M:Marker PR1800(22KD-120KD)；1,2：诱导3h蛋白表达产物上清液)；

图5 scFv-LAAO蛋白在X光胶片下Western-Blot检测(M:Marker PR1800(22KD-120KD)；1：诱导3h蛋白表达产物上清液)。

结论，本发明制备的抗IL-4R单链抗体与竹叶青蛇毒LAAO的融合蛋白，具有一定靶向抗肿瘤作用，可用于治疗肺癌。

与现有技术相比，本发明采用分子生物学技术抗IL-4R单链抗体基因(scFv)与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合基因的表达载体，在体外进行体外表达，重组抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，所述抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白可用于治疗肺癌，疗效好，无副作用。

下面结合实施例对发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

具体实施方式：

实施例1.

一种抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，所述融合蛋白的制备具体包括以下步骤：

(1)选择酶切位点为EcoRⅠ和XhoⅠ的scFv基因序列，将scFv与LAAO两段基因通过重叠延伸PCR技术进行连接，连接前将scFv基因序列的XhoⅠ酶切位点去掉，并在LAAO基因的3’端加上XhoⅠ酶切位点，在竹叶青蛇毒LAAO基因序列5’端加上带有一段与抗IL-4R单链抗体scFv基因序列相同的重叠序列，以及一段连接肽连接基因，另外在“重叠序列”基因序列的3’端加上XhoⅠ酶切位点；

其中，设计引物F1和引物F2去除抗IL-4R单链抗体scFv基因序列的Xho I酶切位点；

(2)设计引物F1和F3，去除XhoⅠ酶切位点的scFv基因片段15μL，LAAO基因片段15μL，1μL引物F1，1μL引物F3，8μL ddH₂O；反应程序：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min重复30个循环；72℃延伸10min；PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳并用胶回收试剂盒回收基因片段；

(3)pET-28a载体/scFv-LAAO基因片段的双酶切与目的片段回收：设计反应体系：scFv-LAAO基因片段10μL，XhoⅠ、EcoRⅠ各2μL，10×Buffer Tango 2.5μL，ddH₂O 35.5μL；以上成分加入PCR管中，于37℃酶切4h，80℃，20min灭活XhoⅠ酶；待冷却至12℃，再加入2μL EcoRⅠ内切酶，37℃酶切4h，65℃，灭活20min；取scFv-LAAO基因片段进行1％ 琼脂糖凝胶电泳分别回收目的片段；按照同样方法对pET-28a载体进行双酶切和回收目的片段；

(4)重组质粒pET-28a-scFv-LAAO的构建与转化：取经过XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切的pET-28a载体目的片段5-15μL、scFv-LAAO双酶切目的片段35-45μL、Rapid T4DNA ligase 1-3μL、快速连接缓冲液5-25μL、ddH₂O 15-20μL，14-18℃过夜；参照《分子克隆实验指南》中的质粒转化方法，将构建的pET-28a-scFv-LAAO重组质粒导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，复苏后进行培养；所述快速缓冲液含Tris-HCl 0.1mol/L、MgCl₂20mmol/L、二硫苏糖醇DTT 20mmol/L、三磷酸腺苷ATP 0.4mmol/L、盐酸亚精胺1mmol/L和牛血清白蛋白BSA0.1mg/mL；

(5)重组质粒酶切鉴定和蛋白质分子量大小预测：取10个单菌落用装有15mL的TB培养液(卡那霉素50μg/mL)的100mL培养瓶中，于36-38℃环境下震荡培养至0D₆₀₀＝0.6～0.8，用高纯质粒小量制备试剂盒提取质粒；依次用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ对该质粒进行双酶切鉴定；将成功酶切的质粒送进行测序，并对测序结果进行蛋白质氨基酸序列翻译，并对翻译结果进行预测分析；

(6)重组毒素scFv-LAAO抗体蛋白的诱导表达：挑取平板上的单个菌落接种至装有10mL的含卡那霉素50μg/mL的TB培养基的50mL锥形瓶中，于37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.2～0.4；取菌液4000rpm离心15min，重复三次，转移菌液至装有100mL含卡那霉素50μg/mL的TB培养基的500mL锥形瓶中，于37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.4～0.6，加入浓度为1mM的IPTG，于37℃快速振荡培养诱导重组蛋白表达3h，即得。

所述scFv基因序列为：

GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCTGCAG.CAGTCCGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTCCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCCTCACCAGCTACTATATGTACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCCACCAATGGTGGTTCTAACTTCAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACATCATACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGTCCCTGGGATGGGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGA TGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAAAGGAGTAGTTACCCGTACACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCGGCCGCAGAATGACTCGAG；

所述引物F1为：5’-GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCT-3’；

所述引物F2为：5’-GCTGAAACGGGCGGCCGCAGAA-3’；

所述引物F3为：5’-ATGACGATGAACTTTAACTCGAG-3’；

所述的抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白用于治疗肺癌及其并发症。