本发明属于猪分子标记制备技术领域，具体涉及猪初生重性状相关hai-1基因分子标记的克隆及其应用。本发明的分子标记克隆自hai-1基因。
背景技术：
在养猪生产过程中，如何提高母猪的生产性能、降低生产成本成了养猪生产者关注的焦点，也是猪育种工作者的研究重点。猪的初生重作为一个重要的繁殖性状，对猪出生后的成活率及生长速度都具有重要的影响，与猪场经济效益有非常强的正相关关系。
有文献报道初生重是影响断奶前死亡率的最重要影响因素(mesah等，geneticandphenotypicrelationshipsoffarrowingandweaningsurvivaltobirthandplacentalweightsinpigs[j].janimsci.2010)。gondret,f.l.等(gondret,f.l.等，lowbirthweightisassociatedwithenlargedmusclefiberareaandimpairedmeattendesnessofthelongissimusmuscleinpigs.j.anim.sci.2006)和wolter等(wolter,b.f.等theeffectofbirthweightandfeedingofsupplementmilkreplacertopigletsduringlactationonpreweaningandpostweaninggrowthperformanceandcarcasscharacteristic.j.anim.sci.2002)研究报道称初生重小的胎儿比初生重大的胎儿更弱，出生后需要更好地环境条件来保证它的存活。尤其是近年来随着育种技术的提高，母猪产仔数有了一定提高，然而初生重的下降使得断奶前死亡率不断增加，严重影响了有效的断奶仔猪数(rootweltv等,postpartumdeaths:piglet,placental,andumbilicalcharacteristics[j].janimsci.2013)，从而制约了养猪业的经济效益。
另外最近有很多研究报道了初生重对猪出生后生长速度的影响。李剑豪(李剑豪.长白猪初生重对生长速度及哺育率的影响.仔猪生产[j].2006.18)通过对长白猪35、60日龄重与初生重的研究发现：35日龄重与60日龄重都与初生重呈正相关，而且初生重与生长速度呈正相关。另外poore等(poorek.r.等，theeffectsofbirthweightandpostnatalgrowthpatternsonfatdepthandplasmaleptinconcentrationsinjuvenileandadultpigs.j.physiol.2004)和beaulieu等(beaulieuad等，impactofpigletbirthweight,birthorderandlittersizeonsubsequentgrowthperformance,carcassquality,musclecompositionandeatingqualityofpork[j].janimsci.2010)也研究报道了初生重较低的猪生长速度较慢。所以如何在提高母猪产仔数的同时保证仔猪的初生重是养猪企业和育种工作者需要重视的问题。
因此，对影响猪初生重相关基因的功能研究可为解释猪和其它哺乳动物胎儿生长发育的遗传机制提供重要线索，并为猪的繁殖性状遗传改良提供理论依据。研究基因突变位点在群体中的多态性，并对其进行性状关联分析是研究基因功能的一个非常有力的手段，也是进行标记辅助选择的基础。hai-1基因编码的蛋白是一种kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制因子，在多种上皮组织中表达，如小肠上皮、唾液腺上皮、肺上皮和胎盘，对调控细胞迁移、分化、组织重塑及胎盘发育具有重要作用(kirchhoferd等，tissueexpression,proteasespecificity,andkunitzdomainfunctionsofhepatocytegrowthfactoractivatorinhibitor-1b(hai-1b),anewsplicevariantofhai-1[j].jbiochem,2003)。hai-1能够通过调节肝细胞生长因子激活因子(hepatocytegrowthfactoractivator，hgfa)、matriptase、hepsin等的活性来调控组织重塑与再生，细胞的分化与迁移等生物学过程，对小鼠以及人胎盘发育具有重要调控作用(herters等，hepatocytegrowthfactorisapreferredinvitrosubstrateforhumanhepsin,amembrane-anchoredserineproteaseimplicatedinprostateandovariancancers[j].biochemicaljournal,2005)。以上研究证明，hai-1基因对哺乳动物妊娠过程中胎盘的发育发挥重要作用，可能与胎盘效率的调节有关，从而影响母体与胎儿间营养物质的运输效率。因此，申请人对hai-1基因进行了多态性研究和关联分析，以期获得一种与猪初生重性状相关的分子标记。
技术实现要素：
发明的目的在于从hai-1基因中克隆一种与猪初生重性状相关的分子标记，为猪初生重性状检测提供一种标记辅助选择的方法。
本发明的技术方案如下：
申请人从猪基因hai-1克隆得到与猪初生重性状相关基因的部分dna片段，它的dna序列如序列表seqidno：1和图2所述。在序列表seqidno：1的第36位碱基处有一个t36-c36的等位基因的突变，该突变导致alu1-rflp多态性。这个碱基突变位于hai-1基因3’utr区。另外申请人检测了hai-1mrna在不同品种和不同妊娠时期猪胎盘组织中转录水平的表达情况，发现hai-1基因在不同妊娠期胎盘中具有不同的时空表达模式，说明其可能对猪胎盘发育发挥重要作用，从而影响胎儿在胎盘中的生长发育。
本发明所述的分子标记的制备方法如下：
(1)用ncbi公布的猪hai-1基因参考序列(序列号：nm_001244422.2)为模板设计引物，所用引物的序列如下所示：
正向引物：5'-actggttcctgagaaagagca-3'，
反向引物：5'-cgctgaaccaaaagcaaaactc-3'(见seqidno：2和3)
(2)提取猪基因组dna，通过pcr扩增、pcr产物纯化和测序，获得如序列表seqidno：1和图2所示的核苷酸序列。
(3)应用常规的pcr-rflp的方法对seqidno：1和图2所示所示的第36位碱基突变进行了检测，并初步进行其基因型与猪初生重性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
(4)另外，为进一步探讨该基因与猪胎盘发育的关系，申请人还检测目的基因hai-1mrna在猪胎盘组织中转录水平的表达，设计用于检测目的基因hai-1mrna表达水平的引物对以及作为内参基因gapdh的引物对，其序列分别如下所示：
目的基因hai-1的引物对：
正向引物：5'agacaccggccactgcttg3'，
反向引物：5'gctttcccgccgtagaccaaa3'，(见序列表seqidno：4，5)
内参基因gapdh的引物对：
正向引物：5'cctccaaggagtaagagcc3'，
反向引物：5'gtctgggatggaaactgg3'；(见序列表seqidno：6，7)
更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》及《具体实施方式》中的实施例。
附图说明
序列表seqidno：1是本发明克隆的猪初生重性状相关基因hai-1的部分dna序列，序列全长为110bp，在该序列的的第36位碱基处存在一个t36-c36的碱基突变(等位基因突变)。
序列表seqidno：2-7是本发明设计的引物序列(这些引物序列与说明书正文中所述的序列顺序一致)。
图1：本发明技术流程框图。
图2：是本发明克隆猪hai-1基因的部分dna序列(与seqidno：1所示的序列对应)，在图2所示序列的36位碱基处存在一个等位基因的突变，记为“r”,“r”之后的括号即(t/c)为突变位点(用加粗斜体字显示)，该扩增的片段的首尾显示的引物序列用下划线显示。在该序列的碱基的下划线是设计的正、方向引物序列。
图3：本发明中猪hai-1基因3’utr区的alu1-rflp的三种基因型的电泳结果，分别为tt、tc和cc基因型，其中tt和cc为纯合子，tc为杂合子。tt基因型含有两个片段，大小分别是34bp和76bp；cc基因型含有一个片段，大小为110bp，tc基因型含有三个片段，大小分别为34bp、76bp和110bp。附图标记说明：在图3中，泳道m：dna分子量标准(dl500ladder)。
图4：本发明中猪hai-1基因正向测序和反向测序发现的t-c(反向测序为a-g)突变。
图5：猪胎盘组织hai-1mrna表达量qpcr检测结果。附图标记说明：纵坐标表示目的基因hai-1mrna转录水平的相对表达量，横坐标表示不同妊娠时间。品种分别为大白猪(yorkshire，约克夏，一种常见的外来猪品种)，梅山猪(meishan，一种常见中国地方猪品种)。用sas软件中的混合线性模型进行差异分析，不同字母代表有显著性差异(p<0.05)，纵坐标数字表示为：mean±sd。
具体实施方式
实施例1：猪hai-1基因部分dna序列扩增
(1)提取大白猪血样基因组dna的方法按照常规苯酚/氯仿抽提法(参考j.萨姆布鲁克和d.w.拉塞尔著，黄培堂等翻译的分子克隆实验指南第三版(2002)，科学出版社，463-470页)，其具体步骤如下所述：
第一步：过夜消化：2ml全血+2ml裂解液(tris/edta/sds)+20μl蛋白酶k，55℃，摇床水浴，过夜消化。
第二步：酚仿醇抽提
1)tris-饱和酚抽提：4mltris-饱和酚，轻轻地上下颠倒混匀10分钟，离心(4℃,5000r/min，15min)，用剪掉尖嘴的大口径枪头转移上清至一新的离心管。
2)重复抽提：4mltris-饱和酚，轻轻地上下颠倒混匀10分钟，离心(4℃,5000r/min，15min)，用剪掉尖嘴的大口径枪头转移上清至一新的离心管。
3)酚仿醇抽提：4ml酚/仿/醇(体积比为25：24：1)，轻轻地上下颠倒混匀10分钟，离心(4℃,5000r/min，15min)，用剪掉尖嘴的大口径枪头转移上清至一新的离心管。
4)氯仿/异戊醇抽提：4ml酚/仿(体积比为24：1)，轻轻地上下颠倒混匀10分钟，离心(4℃,5000r/min，15min)，用剪掉尖嘴的大口径枪头转移上清至一新的离心管。
5)沉淀dna：4ml无水乙醇，轻微震荡，析出絮状dna，-20℃放置1h-3h。
6)洗涤dna：用剪口黄枪头将dna吸至1.5ml离心管中，加入1-1.5ml75％乙醇，洗涤，离心(4℃，3000rpm，5min)，弃乙醇。
7)重复洗涤：加入1-1.5ml75％乙醇，洗涤，离心(4℃，3000rpm，5min)，弃乙醇。
8)自然晾干。
(2)引物设计：
以ncbi公布的猪hai-1基因作为参考序列(登陆号nm_001244422.2)为模板设计引物，利用生物学引物设计软件oligo7，设计扩增hai-1基因的引物，该引物对的序列如下：
正向引物：5'-actggttcctgagaaagagca-3'，
反向引物：5'-gagttttgcttttggttcagcg-3'，(与seqidno：2，3的序列对应)
扩增得到110bp的片段。
(3)pcr扩增反应：
pcr反应总体积20μl，其中猪基因组dna约100ng，含1倍的缓冲液(购自promega公司)，1.5mmol/lmgcl2，dntp终浓度为150μmol/l，引物终浓度为0.4μmol/l，2utaqdna聚合酶(购自promega公司)。pcr扩增程序是：94℃3min，循环35次94℃30s，60℃30s，然后72℃25s，最后72℃延伸5min。pcr反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。得到110bp的特异扩增片段，该片段位于3’utr区(编码区)，(见图2和seqidno:1所示的序列)。测序的结果发现在该110bp片段中存在一个alu1酶切位点(ag↓ct)，其中第36位碱基处为多态性位点(如图4所示)。
(4)pcr产物的纯化和测序
pcr产物的纯化：pcr纯化回收试剂盒(dp214)购自天根(北京)生物技术有限公司，方法按试剂盒说明书进行操作。
pcr产物测序：测序服务由上海invitrogen公司完成，基因片段测正反两个反应。
实施例2：pcr-rflp诊断方法的建立
(1)pcr-rflp引物序列(该引物也是扩增hai-1基因3’utr的引物)，
正向引物：5'-actggttcctgagaaagagca-3'，
反向引物：5'-gagttttgcttttggttcagcg-3'，(序列见seqidno：2和3)
扩增得到110bp的片段。
(2)pcr扩增条件
pcr扩增体系为20μl。其中，正向引物0.4μl，反向引物0.4μl，2×pcrmix10μl，dna模板1.0μl，其余ddh2o补充到20μl。pcr扩增程序是：94℃3min，循环35次94℃30s，60℃30s，然后72℃25s，最后72℃延伸5min。pcr反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。
(3)rflp检测
pcr产物酶切反应体积是10μl，其中1×buffer1μl，pcr产物3-5μl，限制性内切酶alu1为0.2μl(10u)，用h2o补足10μl，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。酶切产生三种基因型：其中，cc基因型只有110bp一条带，tt基因型有34bp和76bp两条带，杂合子ct基因型有34bp，76bp和110bp的三条带，具体胶图见图3。
实施例3：本发明的分子标记在猪繁殖性状关联分析中的应用
本实施例猪群来自大白猪群体，共400头仔猪个体，记录仔猪个体初生重等性状。根据采集样品的群体结构，申请人运用混合模型来统计分析hai-1基因第3’utr区c/t多态性位点的基因型效应及其与初生重性状的关系。
其模型如下：
yijkl＝μ+genei+sexj+parityk+batchl+littesizer+eijkl
yijkl为性状值，μ为总体均数，genei为基因型效应，sexj为性别效应，parityk为胎次效应，batch为批次效应(每批饲养员不同)；littersize为总产仔数，作为协变量，eijkl为随机误差。采用sas(version8.0)软件中mixedmodels程序进行统计分析。
猪hai-1基因alu1-rflp多态性位点在大白猪群体中进行性状关联分析，其结果见表，此基因突变位点在400头仔猪个体中，cc基因型个体有3个，tc基因型个体有46个，tt基因型个体有351个。应用sas统计分析软件对此突变位点的多态性进行性状关联分析，该突变位点的多态与仔猪初生重有显著影响(p<0.05)，其中cc基因型个体的仔猪初生重显著高于tt基因型和tc基因型个体的仔猪初生重(见表1。
表1hai-1snp性状关联分析结果
表1中性状值为平均值±标准误，p<0.05代表有显著性差异。
实施例4hai-1基因在胎盘组织中mrna表达量的荧光定量检测
(1)猪胎盘组织样品采集
选取纯种大白猪和梅山猪青年母猪为研究对象，在妊娠的第26天、50天、95天(每个时期的妊娠母猪各3头)分别进行屠宰采集猪胎盘组织样品。
(2)胎盘组织总rna的提取
胎盘组织总rna提取采用动物组织总rna提取试剂盒(天根生化(北京)科技有限公司，dp431)抽提，具体操作步骤详见该试剂盒说明书。提取的rna用thermoscientific公司的nanodrop2000核酸蛋白测定仪测定总rna浓度。
(3)第一链cdna的合成
在depc处理过的无rnase污染的的0.2ml的离心管中加入2μg的总rna与0.4μg的oligo(dt)引物和0.1μg的随机引物，70℃温育5min以解开总rna的二级结构，迅速置于冰上以防二级结构复性。然后一次加入：10μl5×反转录缓冲液，2.5μl10mmol/ldntpmix，1μlrnaseinhibitor，1.5μlm-mlv反转录酶(200u/μl)，用无核酸酶水将终体积补至50μl，混匀离心后于37℃温育10min，42℃温育50min，在85℃温育5min以灭活反转录酶。反转录后的cdna可于－20℃保存3个月。
(4)用于荧光定量pcr检测的引物设计
以ncbi公布的猪hai-1基因序列(收录号：nm_001244422.2)和猪gapdh(收录号：nm_001206359.1)的基因序列为模板，采用oligo7设计引物，其核苷酸序列分别如下所述：
目的基因hai-1的引物对：
正向引物：5'agacaccggccactgcttg3'，
反向引物：5'gctttcccgccgtagaccaaa3'，(序列见seqidno：4和5)
内参基因gapdh的引物对：
正向引物：5'cctccaaggagtaagagcc3'，
反向引物：5'gtctgggatggaaactgg3'，(序列见seqidno：6和7)
(5)荧光定量pcr检测
在roche荧光定量96孔板中加入荧光定量pcr反应体系，体系如下：2×sybrgreeni染料10μl，0.4μl的reverseprimer，0.4μl的forwardprimer，1μl的cdna模板，加ddh2o补至总体积20μl，每一个样品三个技术重复，每一次扩增均要设置内参基因gapdh为对照组。反应程序为95℃3min，40个循环，94℃20s，60℃30s，72℃20s，最后做融解曲线从55℃－90℃每分钟上升0.5℃。
(6)定量pcr数据分析
目的基因hai-1的各个样品都与内参基因gapdh的引物同时扩增，反应的相对量以目标基因hai-1与内参基因gapdh的ct值(取三个重复的平均值)的差值δct计算，再选取δct最大作为参照，用其它样品的δct减去参照δct得到δδct。最后各基因的相对表达水平用2-δδct值来表示。
(7)荧光定量pcr结果
结果表明(如图5所述)，hai-1基因表达量在不同妊娠期有显著差异。hai-1基因在妊娠50天胎盘组织中的表达量显著高于在妊娠26和95天胎盘中的表达量。hai-1基因在不同妊娠期胎盘中具有不同的时空表达模式，说明其可能对猪胎盘发育发挥重要作用，从而影响胎儿在胎盘中的生长发育。