本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种米格列奈与左卡尼汀偶联化合物(I)及其制备方法。
背景技术：
随着人类生活水平的普遍提高，糖尿病的发病率也随之不断上升。糖尿病作为一种综合性疾病，在患者发病期间，伴有多种并发症，最常见的有糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy，DR)及糖尿病肾病等。有研究报道证明，糖尿病程超过5年的，DR发病率可达44.4％，糖尿病程超过7年的，糖尿病患者DR发病率高达56％。
米格列奈(Mitiglinide)，化学名为S-2-苄基-3-(cis-六氢化异吲哚啉-2-羰基)-丙酸，作为一种降糖药能够有效的促进胰岛素分泌，在临床上广泛的用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病。米格列奈是治疗II型糖尿病的新型药物，与传统磺酰脲类药物相比，给药后起效迅速且作用时间短，可抑制II型糖尿病特征性的餐后高血糖，安全性高，耐受性好；与同属美格列脲类药物的瑞格列奈、那格列奈相比，疗效更强。相关专利文献包括：美国专利US6133454、US5202335，以及欧洲专利EP 0967204。
左卡尼汀是哺乳动物能量代谢中需要的体内天然物质，其主要功能是促进脂类代谢。在缺氧、缺血时，脂酰-CoA堆积，线粒体内的长链脂酰卡尼汀也堆积，游离卡尼汀因大量消耗而减低。缺血缺氧导致ATP水平下降，细胞膜和亚细胞膜通透性升高，堆积的脂酰-CoA。
左卡尼汀(L-carnitine，LC)又名左旋肉碱，是哺乳类动物体内能量代谢所必须的天然物质，主要于肝脏、肾脏、心脏等组织内由三甲赖氨酸转化成γ-丁酰甜菜碱，再由肝脏、肾及脑组织将其转化成卡尼汀而合成，参与体内脂类代谢，对机体细胞能量代谢产生及转运起重要作用，是心、脑、肾等组织器官代谢所需能量的主要来源之一。同时LC还具有促进蛋白质降解、抗氧化、保护细胞膜等功能。左卡尼汀目前已广泛应用于心肌病、肝脏疾病、透析病人、糖尿病、男性不育、神经肌肉疾病、肾脏疾病等疾病的治疗。正常情况下，LC可将长链脂肪酸通过位于线粒体外膜的卡尼汀脂酰转移酶-I及内膜的卡尼汀脂酰转移酶-II将其转运到线粒体中，然后在线粒体酶的作用可将脂酰辅酶A(CoA)在线粒体中进行β-氧化。
缺血、缺氧时脂类代谢发生障碍，可导致长链脂酰卡尼汀在线粒体中堆积及脂酰-CoA的堆积，致使游离的卡尼汀被大量消耗减少，而堆积的脂酰-CoA可导致膜结构的改变、膜相崩解致细胞死亡。如体内有足量的游离卡尼汀，则可使堆积的脂酰-CoA进入线粒体中在线粒体酶的作用下进行β-氧化，从而纠正脂类代谢障碍所致的能量失衡，防上脂质过氧化。
另外有研究表明，LC除了可以促进脂肪酸通过β-氧化进行氧化利用外，它还可作为一种氧自由基清除剂有效的清除体内的氧自由基，其在增强机体氧化应激、防止脂质过氧化等方面具有明显保护作用。但是，在现有技术中，尚无结合米格列奈与左卡尼汀的化合物，亦即，传统的降糖药物在抑制血糖的同时无法有效的抑制糖尿病视网膜病变的发生，存在治疗效果单一的问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于公开一种米格列奈与左卡尼汀偶联化合物(I)及其制备方法，用以实现协同发挥米格列奈与左卡尼汀的药理活性，达到既减低血糖又抑制糖尿病视网膜病变的发生。
为实现上述第一个发明目的，本发明提供了一种米格列奈与左卡尼汀偶联化合物(I)，其分子结构式为：
为实现上述第二个发明目的，本发明还提供了一种米格列奈与左卡尼汀偶联化合物(I)的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：向有机溶剂中加入一定比例的米格列奈和左卡尼汀充分混合以形成悬浊液，向悬浊液中加入一定比例的催化剂以进行酯化偶联反应，
步骤二：抽滤得到滤饼；
步骤三：滤饼使用有机溶剂洗涤后，加入重结晶试剂以进行重结晶。
作为本发明的进一步改进，所述步骤一中的机溶剂包括：二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、四氢呋喃、二氧六环、DMF、DMSO。
作为本发明的进一步改进，步骤一中米格列奈与左卡尼汀的摩尔比为1:1～10:1。
作为本发明的进一步改进，步骤一中米格列奈与左卡尼汀的摩尔比为2.5:1。
作为本发明的进一步改进，步骤一中催化剂与悬浊液的摩尔比为1:100～1:1000。
作为本发明的进一步改进，步骤一中催化剂由DCC、DMAP、EDCI、HOBT或者硫酸中的一种或者两种任意比例的混合物组成。
作为本发明的进一步改进，步骤三中用于对滤饼进行洗涤的有机溶剂由二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、四氢呋喃或者二氧六环中的一种或者两种任意比例的混合物组成；所述步骤三中重结晶试剂由甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、氯仿、乙腈、四氢呋喃、水或者乙酸乙酯中的一种或者两种任意比例的混合物组成。
作为本发明的进一步改进，所述步骤三中重结晶试剂由乙腈与水组成，其中，乙腈与水的摩尔比为1:10～10:1。
作为本发明的进一步改进，所述步骤一中的酯化偶联反应的反应温度为0℃至回流温度，反应时间为12小时～24小时。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：通过动物实验表明，该米格列奈与左卡尼汀偶联化合物(I)实现了协同发挥米格列奈与左卡尼汀的药理活性的目的，既能够减低血糖又实现了有效抑制糖尿病视网膜病变的发生。
具体实施方式
下面结合各实施方式对本发明进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。除非说明书中有特殊说明，本发明中的各个实施例中的组分、原料均采用分析纯级别。另外，各实施例中的“g”为重量单位“克”；“h”为时间单位“小时”；“ml”为体积单位“毫升”；“室温”为23℃。
在详细描述各实施例之前，首先对本说明书所涉及的各专有技术名词作解释。
DCC：二环己基碳二亚胺，一种失水剂(也可称之为缩合剂)，化学式为C13H22N2，分子量为206。
DMAP：4-二甲氨基吡啶，可用于酰化反应的一种催化剂，化学式为C7H10N2，分子量为122.17。
EDCI：碳化二亚胺，主要用于多肽、蛋白质、核苷酸合成中的脱水剂，主要用于活化羧基，促使酰胺和酯的生成。
HOBT：1-羟基苯并三唑，化学式为C6H5N3O，分子量为135.13，基于将单个N-α保护氨基酸反复加到生长的氨基成份上，通常从合成链的C端氨基酸开始，接着的单个氨基酸的连接通过用DCC混合炭酐或N-carboxy酐方法实现。
DMF：二甲基甲酰胺，可作为有机溶剂。
DMSO：含硫有机化合物，常温下为无色无臭的透明液体，是一种吸湿性的可燃液体，具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物。
TLC检测：薄层色谱检测。
一种米格列奈与左卡尼汀偶联化合物(I)的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：向有机溶剂中加入一定比例的米格列奈和左卡尼汀充分混合以形成悬浊液，向悬浊液中加入一定比例的催化剂以进行酯化偶联反应，
其中，步骤一中的机溶剂包括：二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、四氢呋喃、二氧六环、DMF、DMSO，并最优选为四氢呋喃。米格列奈与左卡尼汀的摩尔比为1:1～10:1，并最优选为2.5:1。催化剂与悬浊液的摩尔比为1:100～1:1000，并最优选为1:80。催化剂包括：由DCC与DMAP所组成的任意比例的混合物、由EDCI与HOBT所组成的任意比例的混合物或者硫酸。所述步骤一中的酯化偶联反应的反应温度为0℃至回流温度，反应时间为12小时～24小时，并进一步优选为12小时。
步骤二：抽滤得到滤饼。
步骤三：滤饼使用有机溶剂洗涤后，加入重结晶试剂以进行重结晶。其中，步骤三中用于对滤饼进行洗涤的有机溶剂由二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、四氢呋喃或者二氧六环中的一种或者两种任意比例的混合物组成；所述步骤三中重结晶试剂由甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、氯仿、乙腈、四氢呋喃、水或者乙酸乙酯中的一种或者两种任意比例的混合物组成。优选的，该重结晶试剂由乙腈与水组成，其中，乙腈与水的摩尔比为1:10～10:1，并进一步优选为2:3。
实施例一：
向250ml三颈瓶中先后加入四氢呋喃100ml，米格列奈78.5g和左卡尼汀14.7g。将三颈瓶放置于磁力搅拌仪中通过磁力搅拌形成悬浊液。在悬浊液中再加入催化剂HOBT26.5g和催化剂EDCI38.2g，在三颈瓶中进行酯化偶联反应12小时。在此过程中，将三颈瓶内的温度控制在室温(23℃)。该米格列奈与左卡尼汀均为分析纯级别。然后，通过TLC检测反应结束，将反应液在真空抽滤装置中进行抽滤从而得到滤饼。滤饼用50ml四氢呋喃洗涤后，加入40ml由乙腈与水所组成的重结晶试剂进行重结晶，以得呈白色晶体的米格列奈与左卡尼汀偶联化合物(I)32.5g，其物理常数为：1H NMR(400MHZ,D2O)：7.05-7.16(5H,m)，5.48(2H,s)，3.35(9H,s)，2.40-2.99(6H，m)，1.45-1.88(15H,m)。m/z：444.55[M+1,[α]D20-17.60(c 10H2O)。其中，重结晶试剂中乙腈与水的摩尔比为2:3。
实施例二：
向250ml三颈瓶中先后加入DMSO100ml，米格列奈15.6g和左卡尼汀56.9g。将三颈瓶放置于磁力搅拌仪中通过磁力搅拌形成悬浊液。在悬浊液中再加入催化剂DCC11.9g和催化剂DMAP23.9g，在三颈瓶中进行酯化偶联反应24小时。在此过程中，将三颈瓶内的温度控制在室温(23℃)。该米格列奈与左卡尼汀均为分析纯级别。然后，通过TLC检测反应结束，将反应液在真空抽滤装置中进行抽滤从而得到滤饼。滤饼用50ml乙酸乙酯洗涤后，加入40ml由丙酮组成的重结晶试剂进行重结晶，以得呈白色晶体的米格列奈与左卡尼汀偶联化合物(I)26.1g，其物理常数为：1H NMR(400MHZ,D2O)：7.03-7.14(5H,m)，5.47(2H,s)，3.34(9H,s)，2.39-2.31(6H，m)，1.45-1.89(15H,m)。m/z：444.55[M+1,[α]D20-17.50(c 10H2O)。
实施例三：
向250ml三颈瓶中先后加入二氯甲烷100ml，米格列奈25.9g和左卡尼汀25.9g。将三颈瓶放置于磁力搅拌仪中通过磁力搅拌形成悬浊液。在悬浊液中再加入催化剂DCC16.9g、催化剂HOBT20.1g及催化剂硫酸10ml，在三颈瓶中进行酯化偶联反应16小时。硫酸的浓度为25wt％。在此过程中，将三颈瓶内的温度控制在室温(23℃)。该米格列奈与左卡尼汀均为分析纯级别。然后，通过TLC检测反应结束，将反应液在真空抽滤装置中进行抽滤从而得到滤饼。滤饼用40ml由二氯甲烷与氯仿所组成的混合溶液洗涤后，加入40ml由乙醇及乙酸乙酯所组成的重结晶试剂进行重结晶；其中，乙醇与乙酸乙酯摩尔比为1:3，以得呈白色晶体的米格列奈与左卡尼汀偶联化合物(I)20.1g，其物理常数为：1H NMR(400MHZ,D2O)：7.05-7.17(5H,m)，5.44(2H,s)，3.38(9H,s)，2.41-2.31(6H，m)，1.46-1.90(15H,m)。m/z：444.55[M+1,[α]D20-17.70(c 10H2O)。其中，重结晶试剂中乙醇及乙酸乙酯的摩尔比为1:1。
以下通过动物实验对本说明书中实施例一至实施例三所制备得到的米格列奈与左卡尼汀偶联化合物(I)的对降低血糖及抑制DP的临床效果及临床数据作详细说明。
临床研究表明，本发明所示出的米格列奈与左卡尼汀偶联化合物(I)疗效确切，安全性高。临床试验进行了多中心、随机、双盲双模拟、阳性对照研究，以评价米格列奈与左卡尼汀偶联化合物(I)治疗糖尿病周围神经病变的有效性和安全性，并进行了健康人体单次、多次给药的药代动力学研究。本发明的米格列奈与左卡尼汀偶联化合物(I)通过口服或静脉给药，通过简单扩散被空肠吸收后，经主动转运机制传输到细胞组织，直到在肉碱乙酰转移酶的作用下使它们的血药浓度水平达到平衡。米格列奈与左卡尼汀偶联化合物(I)的口服和静脉给药都能相应增加其在脑脊液中的浓度，说明它可以迅速通过血脑屏障。
米格列奈与左卡尼汀偶联化合物(I)单次和多次给药后，在体内吸收迅速，消除较快。性别间体内药物代谢过程无明显差异；多次给药后药物在体内血药浓度明显大于单次给药的血药浓度，但未引起不良事件的明显增多与加重。试验剂量下，药物安全，人体耐受性好。
实验动物：
选择出生1-3天的标准普通级SD大鼠。
将出生1-3天的SD大鼠浸泡至75％酒精中进行消毒5min，超净工作台内无菌取眼球，于冰浴PBS(含青霉素100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素)洗3遍，显微镜下自角巩膜缘后约1mm处作环形切口，去除眼前节组织及玻璃体，钝性分离出视网膜神经上皮层，冰浴PBS漂洗2遍。显微眼科剪将取出的视网膜神经上皮层剪成约1mm2大小的组织块，收集于离心管内。加入约10倍体积的0.125％胰蛋白酶，37℃消化10-15min。含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化，吸管轻轻反复吹打成单细胞悬液后400目不锈钢滤网过滤，1000r/min离心5min，收集细胞沉淀，含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬细胞。细胞计数板进行细胞计数，调整细胞密度为1×106个/ml。
实验分组及方法：
A组(对照组-1)：正常细胞培养组；
B组(对照组-2)：高糖损伤组(HG)；
C组(对照组-3)：米格列奈保护组(100μmol/L)；
D组(对照组-4)：左卡尼汀保护组(100μmol/L)；
E组(对照组-5)：米格列奈与左卡尼汀偶联化合物(I)(100μmol/L)，并采用实施例一所示出的米格列奈与左卡尼汀偶联化合物(I)的制备方法所制备得到的米格列奈与左卡尼汀偶联化合物(I)。
第A组取原代视网膜神经细胞正常培养，B组取高糖模型的视网膜神经细胞进行培养，C组、D组及E组取高糖模型的视网膜神经细胞并加入相应的保护剂进行培养，培养时间在24h和48h时进行台盼蓝拒染实验计算细胞存活率。具体步骤为：首先消化离心收集细胞，根据细胞量用适当的细胞重悬液重悬细胞，吸取100μl重悬的细胞至离心管中，加入100μl台盼蓝染色液，轻轻混匀，染色3min。吸取少量已染色的细胞，用细胞计数板计数，每个样品至少计数500个细胞。
细胞存活率＝(细胞总数-蓝色细胞数)/细胞总数×100％。
统计学处理：
实验数据以Y±s表示，Y代表均值。采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。统计学方法采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义，P<0.01为差异具有显著统计学意义。
该实验结果显示：高糖作用下视网膜神经细胞凋亡率显著升高(P<0.01)，左卡尼汀保护组细胞凋亡率低于高糖损伤组(P<0.05)，提示左卡尼汀能够抑制高糖损伤所致的细胞凋亡；但三种摩尔比的左卡尼汀和左卡尼汀的协同保护组细胞凋亡率明显低于高糖损伤组(P<0.01)，提示米格列奈与左卡尼汀偶联化合物(I)中的米格列奈与左卡尼汀发挥了协同增效的作用。
由于左卡尼汀对视网膜神经细胞具有保护作用，其作为一种抗氧剂，左卡尼汀能够减少氧自由基的生成、增加细胞的抗氧化作用，稳定线粒体膜电位、改善线粒体功能，从而抑制高糖状态下氧化应激所造成的细胞凋亡。为了降低糖尿病视网膜病变的发病率，我们把米格列奈和左卡尼汀偶联成一个化合物，以期在临床应用中能够同时协同发挥二者的药理活性，达到既减低血糖，又减少糖尿病视网膜病变(DR)的发生，从而避免患者同时服用两种不同治疗效果的药物，降低了患者的经济负担。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。