本发明涉及药物制备与应用技术领域，具体涉及非肽类小分子化合物作为mc4r激动剂及其特异突变体药物伴侣的应用。所述的非肽类小分子化合物命名为bms-470539，利用bms-470539作为制备mc4r激动剂以及特异mc4r突变体药物伴侣的应用。
背景技术：
黑皮质素受体家族包含5个不同生理功能g蛋白偶联受体(黑皮质素受体1-5)1。黑皮质素受体-1主要作用于黑色素细胞的着色和抗炎，黑皮质素受体-2主要作用类固醇生成，黑皮质素受体-3主要作用于采食效率和营养分配，黑皮质素受体-4主要调节食物摄入和能量调节，黑皮质素受体-5则作用于外分泌，特别是皮质腺分泌2-7。近年来，成人肥胖率的快速增长已成为影响全世界范围内人类健康的重要问题。有证据表明黑皮质素受体-4(melanocortin-4receptor,mc4r)敲除小鼠和mc4r突变人类表现出早期性肥胖并伴随食欲过盛、高血糖和超高胰岛素血症8-10。另外，人类遗传学研究表明mc4r编码区突变代表了最频繁出现的单基因突变导致肥胖的病例11-14。基于体外功能研究，mc4r突变体被分为五类：第一类为无效突变受体；第二类为细胞膜定位缺陷受体；第三类为配体亲和缺陷受体；第四类为信号激活缺陷受体；第五类为功能正常突变受体15。
大多数非活性mc4r突变体都有不同程度的细胞膜定位缺陷，配体亲和力缺陷，camp信号或perk1/2信号缺陷。因此，如何挽救mc4r突变体的这些功能缺陷成为治疗肥胖的研究热点。如热休克蛋白hsp70作为分子伴侣能指导mc4r正确折叠从而挽救那些不能正确折叠的突变体16。还有药物伴侣pba17、小分子激动剂thiq18、小分子拮抗剂ml00025376419都有一定程度的基因治疗作用。然而这些分子或药物伴侣都只针对某些特异mc4r缺陷突变体，因此，有必要进一步挖掘挽救mc4r缺陷突变体的药物伴侣，为开发新的个性化抗肥胖药物奠定基础。
非肽类小分子化合物bms-470539的化学名称为1-[1-(3-甲基-l-组氨酰基-o-甲基-d-酪氨酰)-4-苯基-4-哌啶基]-1-丁酮，分子量为559.697，该化合物最早是针对mc1r受体开发的激动剂16。基于mc4r与mc1r能结合相同的配体，并激活相似的信号通路。提示可以针对bms-470539进行其作为mc4r新激动剂的药理特性研究以及其作为药物伴侣分子本身对被挽救mc4r突变体的功能研究20。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种非肽类小分子化合物，编号为bms-470539作为黑皮质素受体-4(简称mc4r)激动剂的应用。
本发明的另一个目的是提供一种编号为bms-470539作为制备特异mc4r突变体药物伴侣的应用。
上述bms-470539化合物的化学名称为1-[1-(3-甲基-l-组氨酰基-o-甲基-d-酪氨酰)-4-苯基-4-哌啶基]-1-丁酮，它的化学结构式如图1所示,其分子量为559.697。
为了筛选挽救mc4r缺陷突变体的有效药物，申请人对非肽类小分子化合物bms-470539进行了研究。申请人首先研究了bms-470539对mc4r野生受体作用，发现它能与mc4r特异性结合并激活其下游信号通路。接着，为开发其对mc4r突变体的挽救作用，申请人选择了10个mc4r的第二类突变体(n62s，i69r，p78l，c84r，g98r，y157s，m161t，w174c，p260q和c271y)，6个mc4r的第三类突变体(g55v，δ88-92，i102t，l106p，d126y和a219v)和4个mc4r的第四类突变体(d90n，s136f，a175t和c326r)进行了相关药物挽救靶向筛选试验。发现bms-470539能特异性的挽救其中某些缺陷突变体的信号转导功能。
具体地，本发明通过以下技术方案实现：
申请人通过配体亲和力测试、camp和perk1/2信号分子的激活检测，发现bms-470539与mc4r具有高亲和力(如图2和表1所示)，bms-470539还以剂量依赖的形式诱导mc4r产生信号分子camp(如图3和表1所示)，并诱导mc4r产生高水平的perk1/2(如图4、5所示)。从而发现bms-470539是mc4r的激动剂。
申请人通过对camp信号激活的检测，发现bms-470539能较好恢复mc4r二类突变体中n62s、c84r、m161t、p260q，三类突变中g55v，i102t、l106p，以及四类突变中a175t、c326r产生camp信号分子的能力(如图6、7、8及表2、3所示)。
申请人通过对perk1/2蛋白的wb检测，发现bms-470539能较好恢复三类突变g55v，δ88-92，i102t，l106p，d126y，a219v，以及四类突变体s136f，a175t，c326r产生perk1/2信号分子的能力(如图9、10和表3所示)。
更详细的技术方案如《具体实施方式》所述。
附图说明
图1：是非肽类小分子化合物bms-470539的化学结构式。
图2：是bms-470539诱导下mc1r、mc3r、mc4r和mc5r产生信号分子camp的水平。
图3：是mc1r、mc3r、mc4r和mc5r分别与bms-470539配体亲和力结果。
图4：是mc4r在不同时间bms-470539诱导下产生信号分子perk1/2水平的wb结果图。
图5：是mc4r在不同浓度bms-470539诱导下产生信号分子perk1/2水平的wb结果图。
图6：是第二类mc4r突变体在10-5mbms-470539诱导下产生信号分子camp的水平柱状图。
图7：是第三类mc4r突变体在不同浓度bms-470539诱导下产生信号分子camp的折线图。附图标记说明：图7中的a图是g55v、δ88-92、i102t突变体与wt受体在不同浓度bms-470539诱导下产生信号分子camp的折线图；图7中的b图是l106p、d126y、a219v突变体与wt受体在不同浓度bms-470539诱导下产生信号分子camp的折线图。
图8：是第四类mc4r突变体在不同浓度bms-470539诱导下产生信号分子camp的折线图。
图9：是第三类mc4r突变体在10-5mbms-470539诱导下产生信号分子perk1/2水平的wb结果图。附图标记说明：图9中的a图为wb检测图；图9中的b图为wb结果统计柱状图。
图10：是第四类mc4r突变体在10-5mbms-470539诱导下产生信号分子perk1/2水平的wb结果图。附图标记说明：图10中的a图为wb图；图10中的b图为wb结果统计柱状图。
具体实施方式
为理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
实施例1基本制备实施例
本发明选取商用质粒pcdna3.1(+)(购自clontech公司)作为表达载体，构建了野生型(wt)人的mc4r(hmc4r)的表达载体：pcdna3.1-hmc4r-wt。即在pcdna3.1(+)的多克隆位点插入了一个编码野生型hmc4r基因的表达序列(nm_005912.2)。
本发明以构建好的pcdna3.1-hmc4r-wt为模板，利用快速定点突变试剂盒(购自stratagene公司)构建了20个命名为n62s，i69r，p78l，c84r，g98r，y157s，m161t，w174c，p260q，c271y，g55v，δ88-92，i102t，l106p，d126y，a219v，d90n，s136f，a175t，c326r经功能鉴定的第二、三、四类mc4r突变体表达载体。
本发明将不表达mc4r受体人肾胚胎细胞(hek293t)作为mc4r及突变体的瞬时表达系统，用于检测配体亲和力、camp信号和perk1/2信号。hek293t细胞(购自atcc公司)于37℃、5％co2培养箱中培养细胞，培养体系为含10％小牛血清的dmem培养基。转染前一天，将细胞以0.14×106个/ml的密度接种细胞到6孔板中，30h后(待细胞贴壁伸展开)，采用磷酸钙法21转染mc1r突变体和野生型阳性对照质粒，48h后收样。
本发明对bms-470539作为mc4r激动剂的功能鉴定涉及配体亲和力检测(见实施例2)、camp信号激活能力检测(见实施例3)以及产生信号分子perk的能力检测(见实施例4)。
同时，对bms-470539作为mc4r突变体药物伴侣的挽救功能鉴定涉及产生信号分子camp的能力检测(见实施例5、6)以及产生信号分子perk的能力检测(见实施例7)。
实施例2对bms-470539与mc1r、mc3r、mc4r、mc5r亲和力的检测
hek293t细胞收样前，用无血清培养基(购自gibco公司)洗细胞2次，将不同终浓度(10-10～10-5m)配体bms-470539(购自bachem公司)与100,000cpm的放射性标记配体125i-ndp-msh(购自密西西比大学肽放射性碘标记服务中心)(50μl)在37℃共同温育转染mc1r、mc3r、mc4r和mc5r的hek293t细胞(购自atcc公司)1h，终止反应后，用预冷的磷酸盐缓冲液即pbs(137mmnacl，2.7mmkcl，1.4mmkh2po4，4.3mmna2hpo4，ph7.4)洗去未被结合的标记物，加入100μl的0.5nnaoh收集细胞后，利用伽马闪烁计数仪测定细胞中与受体结合的125i-ndp-msh的总量，即得出mc1r、mc3r、mc4r和mc5r与配体bms-470539的结合能力。利用graphpadprism5软件分析实验数据作出非线性回归s型曲线，计算得到受体与配体结合的有效中浓度值(ic50)和最大浓度值(bmax)。
通过竞争结合试验，申请人发现bms-470539除对mc1r表现出很强的亲和力外，对mc4r受体也有相当高的亲和力，而对mc3r的亲和力了下降4倍。mc5r则只在10-5m的bms-470539刺激下与之有微弱的亲和力。结果见图2和表1。
表1mc1r、mc3r、mc4r、mc5r与bms-470539的亲和力以及在bms-470539诱导下产生camp信号的特征
表1说明：a表示与mc1r受体相比p<0.05；b表示与mc1r受体相比p<0.01；c表示与mc1r受体相比p<0.001；n/a表示没有检测到。
实施例3bms-470539诱导mc1r、mc3r、mc4r和mc5r产生信号分子camp的能力检测
hek293t细胞收样前，用无血清培养基洗细胞2次，并将含0.5mm的异丁基甲基黄嘌呤的无血清培养基(购自gibco公司)在37℃温育已转染mc1r、mc3r、mc4r和mc5r的hek293t细胞15min，然后将不同终浓度(10-10～10-5m)的bms-470539刺激处理细胞，37℃温育1h后，将细胞培养板放冰上，吸弃培养基，加入含180μg/ml茶碱的0.5n高氯酸提取细胞内camp，利用放射免疫分析(ria)方法22进行信号分子camp产生的剂量依赖性测定，并利用graphpadprism5软件计算其有效中浓度(ec50)和最大浓度值(rmax)。
本实施例的测定结果与配体亲和力测定结果一致，camp活性诱导试验表明，bms-470539除能诱导mc1r产生camp外,还能刺激mc4r产生剂量依赖性camp，其ec50为472.4nm；rmax为1887.4pmol/106个细胞。结果见图3和表1。
实施例4bms-470539诱导mc4r产生信号分子perk的能力检测
利用常规的westernblot(简称wb)方法来检测perk(磷酸化的细胞外调节蛋白激酶)的水平。hek293t细胞转染野生型mc4r载体24h后，再用无血清培养基(购自gibco公司)使hek293t细胞饥饿24h。在收样日，用bms-470539进行诱导。收样前先用hepes缓冲液【150mmnacl和20mmhepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸),ph7.4】洗细胞2次，再加裂解液【hepes缓冲液中含0.5％np-40(乙基苯基聚乙二醇),2mmedta(乙二胺四乙酸),1mmna3vo4(钒酸钠)和1mmnaf(氟化钠)】收集细胞。总蛋白浓度用bradford法23测定。每孔上样总蛋白35mg，用10％sds–page胶分离后转到pvdf膜上。pvdf膜用10％脱脂奶粉(含0.2％tween-20)室温封闭4h后，加两种一抗4℃孵育过夜，其中一抗兔抗perk1/2(体积比为1:2000)和鼠抗β-tubulin(作为内参抗体，体积比为1:5000)用含5％牛血清白蛋白即bsa的tbst(购自上海生工生物工程有限公司)来稀释。第二天，加辣根过氧化物酶标记的抗兔(体积比为1:1500)和抗鼠(体积比为1:5000)的二抗igg室温下孵育2h，所述的二抗用10％脱脂奶粉稀释。最后用ecl显色法24显色。然后用图像处理软件imagej对蛋白条带进行光密度扫描。erk1/2的磷酸化水平通过perk1/2与β-tubulin的比率进行标准化。
结果表明bms-470539可以诱导mc4r受体产生erk信号。bms-470539作用5min时，能诱导mc4r产生3.7倍于基础水平的perk1/2，但作用30min到60min就回落到了基础水平，如图4所示。从剂量依赖性结果看来，10-7m的bms-470539就能诱导mc4r产生4.0倍于基础水平的perk1/2，更高浓度的bms-470539诱导差异不显著，如图5所示。
实施例5bms-470539对第二类mc4r突变体camp活性的影响
bms-470539对第二类mc4r突变体camp活性的影响采用ria方法22测定，具体步骤为：hek293t细胞收样前一天，用10-5m终浓度的bms-470539处理已转染n62s，i69r，p78l，c84r，g98r，y157s，m161t，w174c，p260q，c271y和wt质粒的细胞24小时。第二天，细胞收样前，用无血清培养基洗细胞2次，并将含0.5mm的异丁基甲基黄嘌呤的无血清培养基在37℃温育细胞15min，再加10-6mndp-msh作用37℃温育1h后，将细胞培养板放冰上，吸弃培养基，加入含180μg/ml茶碱的0.5n高氯酸提取细胞内camp，利用ria方法22进行信号分子camp水平测定，并利用graphpadprism5软件计算其浓度值。
ria检测结果表明bms-470539增加了n62s，c84r，m161t和p260q产生的camp水平，而对i69r,p78l,g98r,y157s,w174c没有显著影响，结果如图6所示。
实施实例6bms-470539对第三、四类mc4r突变体camp信号活性的影响
bms-470539对第三、四类mc4r突变体camp信号活性的影响采用ria方法22测定。具体步骤是：细胞收样前，用无血清培养基洗细胞2次，并将含0.5mm的异丁基甲基黄嘌呤的无血清培养基在37℃温育已转染g55v，δ88-92，i102t，l106p，d126y，a219v，d90n，s136f，a175t，c326r和wt质粒的hek293t细胞15min，然后将不同终浓度(10-7m～10-5m)的bms-470539在37℃刺激处理细胞1h。将细胞培养板放冰上，吸弃培养基，加入含180μg/ml茶碱的0.5n高氯酸提取细胞内camp，利用ria22进行信号分子camp产生的剂量依赖性测定，并利用graphpadprism5软件计算其浓度值。
ria检测结果表明，bms-470539能诱导第三类突变g55v，i102t和l106p产生剂量依赖性camp，以及诱导第四类突变a175t和c326r产生剂量依赖性camp，但对其它三、四类突变没有显著影响，结果见图7、图8和表2所示。
表2bms-470539对野生型和第三、四类mc4r突变体camp和perk1/2信号的影响
表3的说明：“↑”：表明与基础水平相比表达或活性提高；“↓”：表明与基础水平相比表达或活性降低；“-”：表明与基础水平相比没有显著改变。
实施实例7bms-470539对第三、四类mc4r突变体perk1/2信号活性的影响
bms-470539对第三、四类mc4r突变体perk1/2信号活性的影响利用wb方法检测。具体步骤为：用hek293t细胞转染g55v，δ88-92，i102t，l106p，d126y，a219v，d90n，s136f，a175t，c326r和wt质粒24h后，再用无血清培养基使hek293t细胞饥饿24h。在收样日，用10-5mbms-470539诱导5min。收样前先用hepes缓冲液【150mmnacl和20mmhepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸),ph7.4】洗细胞2次，再加裂解液【hepes缓冲液中含0.5％np-40(乙基苯基聚乙二醇),2mmedta(乙二胺四乙酸),1mmna3vo4(钒酸钠)和1mmnaf(氟化钠)】收集细胞。总蛋白浓度用bradford法23测定。每孔上样总蛋白35mg，用10％sds–page胶分离后转到pvdf膜上。pvdf膜用10％脱脂奶粉(含0.2％tween-20)室温封闭4h后，加两种一抗4℃孵育过夜，其中一抗为兔抗perk1/2(体积比为1:2000)和鼠抗β-tubulin(作为内参抗体，体积比为1:5000)用含5％牛血清白蛋白即bsa的tbst(购自上海生工生物工程有限公司)来稀释；第二天，加辣根过氧化物酶标记的抗兔(体积比为1:1500)和抗鼠(体积比为1:5000)的二抗igg室温下孵育2h，所述的二抗用10％脱脂奶粉稀释。最后用ecl显色法24显色。然后用图像处理软件imagej对蛋白条带进行光密度扫描。erk1/2的磷酸化水平通过perk1/2与β-tubulin的比率进行标准化。
wb检测结果表明，bms-470539能诱导所有第三类mc4r突变体g55v，δ88-92，i102t，l106p，d126y和a219v产生perk1/2，以及诱导第四类突变体s136f，a175t和c326r产生perk1/2，发明效果如图9、图10和表2所示。
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