一种猪源大肠杆菌的分离鉴定方法与流程

本发明涉及一种猪源大肠杆菌的分离鉴定方法，属于微生物技术领域。

背景技术：

大肠杆菌是一类广泛存在于自然界并能引起人和动物共同感染的人畜共患病病原，依其致病机制可分为3类：共生型、肠内致病型和肠外致病型。大肠杆菌病主要是由病原大肠埃希氏菌引起的一种急性、多形性、肠道型传染病。在兽医临床上，由于病源性大肠杆菌的血清型、免疫状态、生理机能以及猪的日龄等存在差异，常见的猪大肠杆菌病分为3种，即3日龄仔猪黄痢、7～10日龄仔猪白痢和30日龄仔猪水肿病。猪大肠杆菌病在世界各地均有发生，而仔猪黄、白痢是猪场中最为常见的传染病，其发病率、死亡率均居仔猪疫病之首，已给养猪业带来极大危害和严重的经济损失。大肠杆菌病发生后多采用抗生素类药物进行治疗，但是由于抗生素的广泛及不合理使用，细菌耐药性问题日益严重，特别是多重耐药性问题更加突出。为防治该病，国内外已研制出多种类型的基因工程菌苗和多价灭火菌苗，但由于大肠杆菌的血清型复杂及各地区流行菌株的不同，免疫效果尚不甚理想，一般以自制的灭火菌苗效果为佳。

为了解和掌握各地区大肠杆菌的耐药程度，并为临床上有效防治药物的筛选提供依据，有必要对采集样本中致病性大肠杆菌进行生化和血清型鉴定。而一般性鉴定程序为：分离培养→挑取可疑菌落→纯培养→革兰氏染色、镜检→生化试验。鉴定步骤为：将病料用生理盐水稀释，并接种于普通培养基上，37℃恒温培养18～24h，观察细菌生长情况和菌落特征，挑取单菌落接种于麦康凯琼脂平板上，37℃恒温培养18～24h后，再挑取红色、中等大小的光滑菌落进行革兰氏染色、镜检，染色情况、形态和大小等均符合大肠杆菌特征的菌株初步判定为大肠杆菌，挑取疑似菌株进行吲哚试验、MR试验、VP试验、H₂S试验、三糖铁试验和糖发酵试验，结合生化试验结果最终判定菌株属种。但是该方法的鉴定结果尚不够准确，尤其是分离纯化操作中菌落形态模糊，不利于挑取分离。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种猪源大肠杆菌的分离鉴定方法，该方法采用营养肉汤培养基、麦康凯培养基和伊红美蓝培养基分离纯化病料菌株，生长出的菌落形态清晰，便于挑取分离，操作简便，鉴定结果准确、可靠，误差小。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种猪源大肠杆菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：

1)细菌分离培养：将采集的样品接种于营养肉汤培养基中，培养后取菌液划线接种于麦康凯琼脂培养基上，观察菌落生长情况，挑取单个或成对的红色菌落接种于伊红美蓝琼脂培养基上，观察菌落生长情况，挑取单个或成对的紫黑色菌落备用；

2)革兰氏染色、镜检；

3)生化鉴定试验；

步骤1)中营养肉汤培养基的组成为：蛋白胨7～8g，牛肉膏2～2.5g，氯化钠3.5～4g，蒸馏水750mL，pH值7.0～7.4；麦康凯琼脂培养基的组成为：蛋白胨12～18g，牛胆盐3.5～4g，氯化钠3.5～4g，琼脂10～15g，乳糖7～8g，中性红0.01～0.03g，蒸馏水750mL，pH值7.0～7.4；伊红美蓝琼脂培养基的组成为：蛋白胨7.5～8.5g，乳糖7～8g，磷酸氢二钾1.2～1.8g，琼脂15～20g，2％伊红水溶液12～18mL，0.5％美蓝水溶液10～15mL，蒸馏水750mL，pH值7.2～7.4。

优选的，步骤1)中营养肉汤培养基的组成为：蛋白胨7.5g，牛肉膏2.3g，氯化钠3.8g，蒸馏水750mL，pH值7.2；麦康凯琼脂培养基的组成为：蛋白胨15g，牛胆盐3.8g，氯化钠3.8g，琼脂12g，乳糖7.5g，中性红0.02g，蒸馏水750mL，pH值7.2；伊红美蓝琼脂培养基的组成为：蛋白胨8g，乳糖7.5g，磷酸氢二钾1.5g，琼脂18g，2％伊红水溶液15mL，0.5％美蓝水溶液12mL，蒸馏水750mL，pH值7.3。

步骤1)中培养的温度为36～38℃，培养时间15～20h。优选的，于温度37℃下培养18h。

步骤2)中革兰氏染色主要包括初染、媒染、脱色、复染四步操作。具体操作为：将挑取的菌落涂片固定，先用草酸铵结晶紫初染，再用碘液媒染，脱色后用复红染液复染。

步骤2)中镜检为：用香柏油覆盖涂菌部位，显微镜下观察染色情况和细菌形态，挑取革兰氏阴性菌待用。

步骤3)中生化鉴定采用细菌微量生化反应管(如肠杆菌科细菌生化编码鉴定管，购自杭州天和微生物试剂有限公司)。具体操作见试剂盒说明书。

步骤3)中生化鉴定为大肠杆菌的菌株进行菌种保存。具体操作为：将菌株接种于营养肉汤培养基中，培养后取菌液与灭菌的甘油混合制成甘油菌，于温度-20℃以下保存备用。

本发明的有益效果：

本发明中猪源大肠杆菌的分离鉴定主要包括细菌分离培养、革兰氏染色及镜检和生化鉴定试验三步操作，该方法操作简单、耗时短，成本低，鉴定结果准确、可靠。其中细菌分离培养依次采用营养肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基和伊红美蓝琼脂培养基进行选择性培养，生长出的菌落形态清晰，便于挑取分离。

附图说明

图1为实施例1中菌落形态图；

图2为镜检细菌的形态图。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

猪源大肠杆菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：

1)采集样品：从某县规模化猪场中采集未断奶、腹泻仔猪粪便40份样；

2)细菌分离培养：将采集的猪粪便样品分别接种于营养肉汤培养基中，放置于摇床上于37℃、150rpm下培养18h，培养后用无菌接种棒挑取少量的菌液划线接种于麦康凯琼脂培养基上，于37℃培养箱中培养18h，观察菌落的生长情况，并挑取粉红色、单个或成对的菌落接种于伊红美蓝琼脂培养基上，于37℃培养箱中培养18h，观察菌落的生长情况，挑取紫黑色、单个或成对的菌落待用，采集的40份样品共分离得到17株菌；

上述营养肉汤培养基的组成为：蛋白胨7.5g，牛肉膏2.3g，氯化钠3.8g，蒸馏水750mL，pH值7.2；麦康凯琼脂培养基的组成为：蛋白胨15g，牛胆盐3.8g，氯化钠3.8g，琼脂12g，乳糖7.5g，中性红0.02g，蒸馏水750mL，pH值7.2；伊红美蓝琼脂培养基的组成为：蛋白胨8g，乳糖7.5g，磷酸氢二钾1.5g，琼脂18g，2％伊红水溶液15mL，0.5％美蓝水溶液12mL，蒸馏水750mL，pH值7.3；

结果表明：分离培养的菌落均符合大肠杆菌的菌落形态(见图1，图中A为麦康凯培养基上的菌落形态，B为伊红美蓝培养基上得菌落形态)；

3)革兰氏染色：将挑取的菌落通过火焰进行涂片固定，在玻片上滴加2滴草酸铵结晶紫溶液，染色1min，用自来水冲洗，再滴加2滴碘液，染色1min，用自来水冲洗，并用吸水纸吸干玻片，连续滴加95％乙醇溶液脱色，30s后水洗，用吸水纸吸干玻片，最后滴加2滴复红染液，复染1min，用自来水冲洗；

镜检：染色后，用香柏油覆盖涂菌部位，并将玻片置于显微镜下观察，先用低倍镜找到菌，再换用高倍物镜观察染色情况和细菌形态；

染色和镜检结果表明：17株菌均为革兰氏阴性菌，并且符合大肠杆菌的细菌形态(见图2)，两端钝圆、单个或成对，微小短杆状；

4)生化鉴定试验：采用肠杆菌科细菌生化编码微量鉴定管(购自杭州天和微生物试剂有限公司)对上述17株菌进行鉴定，具体操作为：分别取细菌生化鉴定管用砂轮划痕从鉴定管中间折断，鉴定管两端分别作为空白组和试验组，用无菌棒挑取单个或成对的疑似大肠杆菌菌落接种于鉴定管试验组的一端，使菌落与生化鉴定管中的检测液充分混合均匀，断口处用封口胶密封；将密封好的鉴定管置于37℃培养箱中，培养18h后，观察生化管两端颜色变化，根据编码值检索肠杆菌科细菌生化编码册(包括葡萄糖、赖氨酸、鸟氨酸、硫化氢、靛基质、乳糖、卫茅醇、苯丙氨酸、尿素、枸椽酸盐等测试项目)，判定菌株的种属特性；

生化鉴定结果表明：17株菌均符合大肠杆菌的基本生化特性，其中葡萄糖反应为产酸产气，葡萄糖、鸟氨酸、硫化氢、靛基质、乳糖等反应结果均呈阳性，赖氨酸、卫矛醇、苯丙氨酸、尿素、枸橼酸盐等反应结果大多呈阴性，判定17株菌为大肠杆菌；

5)菌种保存：用无菌棒挑取单个或成对的大肠杆菌菌落接种于营养肉汤培养基中，放置于摇床上于37℃、150rpm下培养18h；在新鲜菌液中按体积比1:1加入灭菌的甘油(体积分数20％)，混合均匀后得到10％的甘油菌，再置于-20℃冰箱中保存备用。

经试验验证，本发明中分离鉴定方法准确、可靠，耗时短，分离得到的猪源大肠杆菌不易被污染。

在本发明的其他实施例中，营养肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基和伊红美蓝琼脂培养基的组成可在各组分取值范围内任意调整，培养的温度、时间也可在相应范围内任意调整。