一种细胞微载体及其制备方法与流程

本发明属于生物材料技术领域，尤其涉及一种细胞微载体及其制备方法。

背景技术：

微载体是一种微小的球状颗粒，其在细胞立体培养中能使贴壁细胞在悬浮状态下贴附在颗粒表面单层生长，因而具有比普通平面培养更大的接触面积，利于细胞的大规模培养和收集。贴壁细胞在微载体表面增殖，需要经历以下三个阶段:细胞与微载体表面接触并黏附，生长以及扩增至单层细胞。其中细胞与微载体表面接触并黏附是最重要的环节，细胞只有在良好黏附于微载体表面才能够进一步生长和增殖。细胞能否在微载体表面黏附，主要取决于微载体表面的细胞相容性以及细胞与微载体的接触概率。

目前制备聚合物基微载体多是单一聚合物组分(包括均聚物、共聚物以及多种聚合物共混物组分)，或者采用共混的方式将无机物质等其他组分，比如羟基磷灰石，加入到聚合物有机相中预先搅拌混合，再进行制备。但是采用常规单一聚合物组分，如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)等，其细胞相容性较差，细胞不易在其表面黏附；采用共混法，比如加入羟基磷灰石，可以促进骨细胞的黏附与增殖，但是其与聚合物相容性差，不易在聚合物组分中均匀分散，且脆性大，缺乏可塑性，会导致微载体力学性能下降或者影响其成球的形态等，同时会多出预混合步骤，增加了微载体制备的周期和成本。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种与细胞相容性较好的细胞微载体及其制备方法。

本发明提供了一种细胞微载体，由经硅烷偶联剂修饰的羟基磷灰石接枝聚氨基酸形成。

优选的，所述硅烷偶联剂选自γ-氨丙基三乙氧基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基甲基二甲氧基硅烷、N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅烷、N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷、异氰酸酯丙基三乙氧基硅烷与γ-氨丙基甲基二乙氧基硅烷中的一种或多种。

本发明还提供了一种细胞微载体的制备方法，包括以下步骤：

S1)将经硅烷偶联剂修饰的羟基磷灰石与氨基酸-N-羧酸酐在有机溶剂中搅拌反应，得到接枝聚氨基酸的羟基磷灰石；

S2)将所述接枝聚氨基酸的羟基磷灰石与易挥发的有机溶剂混合，得到混合溶液；将所述混合溶液与水溶性高分子化合物的水溶液混合搅拌，除去易挥发的有机溶剂，水洗后，得到细胞微载体。

优选的，所述经硅烷基偶联剂修饰的羟基磷灰石按照以下方法制备：

将羟基磷灰石与硅烷偶联剂在醇溶剂中混合，得到中间产物；

将所述中间产物加热处理，得到经硅烷偶联剂修饰的羟基磷灰石。

优选的，所述羟基磷灰石与硅烷偶联剂的质量比为(1：0.1)-(1：0.5)。

优选的，所述经硅烷偶联剂修饰的羟基磷灰石与氨基酸-N-羧酸酐的质量比为(1：0.1)-(1：10)。

优选的，所述步骤S1)中搅拌反应的时间为4-72h。

优选的，所述步骤S2)混合溶液中接枝聚氨基酸的羟基磷灰石的质量分数为0.5％-10％；所述水溶性高分子化合物的水溶液的质量分数为0.01％-0.5％。

优选的，所述水溶性高分子化合物选自聚乙烯醇和/或聚乙烯吡咯烷酮。

优选的，所述步骤S2)中搅拌的速度为500-2000r/min；搅拌的时间为4-24h。

本发明提供了一种细胞微载体及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：S1)将经硅烷偶联剂修饰的羟基磷灰石与氨基酸-N-羧酸酐在有机溶剂中搅拌反应，得到接枝聚氨基酸的羟基磷灰石；S2)将所述接枝聚氨基酸的羟基磷灰石与易挥发的有机溶剂混合，得到混合溶液；将所述混合溶液与水溶性高分子化合物的水溶液混合搅拌，除去易挥发的有机溶剂，水洗后，得到细胞微载体。与现有技术先比，本发明将通过表面修饰氨基的羟基磷灰石引发氨基酸-N-羧酸酐单体原位开环聚合，使氨基酸原位聚合于羟基磷灰石表面，聚氨基酸是由氨基酸-N-羧酸酐单体均聚或共聚而成的高分子，具有良好的生物相容性和可降解性，羟基磷灰石是人体骨骼和牙齿的主要无机组分，具有优良的生物相容性和生物活性，并且所得细胞微载体不含其它聚酯材料，且有效结合了羟基磷灰石和聚氨基酸二者的优点，有利于细胞的黏附与增殖，诱导成骨细胞分化，适合于体外细胞扩增以及体内骨组织修复。

附图说明

图1为图1为本发明提供的细胞微载体制备流程示意图；

图2为PBLG-g-HA细胞微载体扫描电镜照片，其中a为P-g-H-33微载体的扫描电镜照片，b为P-g-H-50微载体的扫描电镜照片(标尺＝100微米)；

图3为细胞增殖检测结果柱形图；

图4为MC3T3-E1细胞在P-g-H-33微载体及P-g-H-50微载体上的荧光染色图片。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种细胞微载体，由经硅烷偶联剂修饰的羟基磷灰石接枝聚氨基酸形成。

其中，所述硅烷偶联剂为本领域技术人员熟知的带有伯氨基的硅烷偶联剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为γ-氨丙基三乙氧基硅烷(KH-550)、3-氨基丙基三甲氧基硅烷(KH-540)、N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基甲基二甲氧基硅烷(KH-602)、N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅烷(KH-791)、N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷(KH-792)、异氰酸酯丙基三乙氧基硅烷(KH-901)与γ-氨丙基甲基二乙氧基硅烷(KH-902)中的一种或多种。

羟基磷灰石为一种典型无机材料，具有优良的力学性能，但是质脆而不易加工成型，需要借助于有机基体材料使其充分分散于其中才更易于加工成型，硅烷偶联剂可对羟基磷灰石起到改性，增强羟基磷灰石界面稳定性的作用，在经硅烷偶联剂修饰的羟基磷灰石表面接枝聚氨基酸，这样既可以增强羟基磷灰石的界面稳定性，同时羟基磷灰石表面接枝的聚氨基酸具有优良的生物相容性和生物活性，可以作为优良的促进细胞、组织生长的载体。

本发明还提供了一种上述细胞微载体的制备方法，包括以下步骤：S1)将经硅烷偶联剂修饰的羟基磷灰石与氨基酸-N-羧酸酐在有机溶剂中搅拌反应，得到接枝聚氨基酸的羟基磷灰石；S2)将所述接枝聚氨基酸的羟基磷灰石与易挥发的有机溶剂混合，得到混合溶液；将所述混合溶液与水溶性高分子化合物的水溶液混合，搅拌，除去易挥发的有机溶剂，水洗后，得到细胞微载体。

本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。

其中，所述经硅烷偶联剂修饰的羟基磷灰石的制备方法为本领域技术人员熟知的制备方法即可，并无特殊的限制，本发明中优选按照以下步骤制备：将羟基磷灰石与硅烷偶联剂在醇溶剂中混合，得到中间产物；将所述中间产物加热处理，得到经硅烷偶联剂修饰的羟基磷灰石。

所述硅烷偶联剂的种类同上所述，在此不再赘述。将羟基磷灰石与硅烷偶联剂在醇溶剂中混合；所述羟基磷灰石与硅烷偶联剂的质量比优选为(1：0.1)-(1：0.5)；所述醇溶剂为本领域技术人员熟知的醇溶剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为乙醇，更优选为85％-95％的乙醇；在本发明中此步骤优选为：将羟基磷灰石加入到硅烷偶联剂的醇溶剂中混合；所述混合温度优选为室温；所述混合的时间优选为4-24h；混合后优选用醇溶剂清洗，室温干燥后，得到中间产物。

将所述中间产物加热处理，得到经硅烷偶联剂修饰的羟基磷灰石；所述加热处理的温度优选为100℃-150℃，更优选为120℃-150℃，再优选为120℃-140℃，最优选为130℃；所述加热处理的时间优选为1-4h，更优选为2-3h，再优选为2h。

将经硅烷偶联剂修饰的羟基磷灰石与氨基酸-N-羧酸酐在有机溶剂中搅拌反应；所述氨基酸-N-羧酸酐为本领域技术人员熟知的氨基酸-N-羧酸酐即可，并无特殊的限制，本发明中优选为谷氨酸苄酯-N-羧酸酐、赖氨酸-N-羧酸酐和/或苯丙氨酸-N-羧酸酐；所述经硅烷偶联剂修饰的羟基磷灰石与氨基酸-N-羧酸酐的质量比优选为(1：0.1)-(1：10)，更优选为(1：0.5)-(1：8)，再优选为(1：0.5)-(1：6)，最优选为(1：0.5)-(1：4)；所述有机溶剂为本领域技术人员熟知的有机溶剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为二氧六环；所述搅拌反应的温度优选为室温；所述搅拌反应的时间优选为4-72h，更优选为6-72h，再优选为4-48h。

搅拌反应后，优选用二氧六环与丙酮洗涤产物，得到接枝聚氨基酸的羟基磷灰石。

将所述接枝聚氨基酸的羟基磷灰石与易挥发的有机溶剂混合，得到混合溶液；所述易挥发的有机溶剂为本领域技术人员熟知的具有易挥发性、可溶解聚氨基酸、与水不相溶的有机溶剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为三氯甲烷和/或二氯甲烷；所述混合优选采用超声使其溶解均匀；所述混合溶液中接枝聚氨基酸的羟基磷灰石的质量分数优选为0.5％-10％，更优选为0.5％-5％。

将所述混合溶液与水溶性高分子化合物的水溶液混合搅拌；所述水溶性高分子化合物为本领域技术人员熟知的水溶液高分子化合物即可，并无特殊的限制，本发明中优选为聚乙烯醇和/或聚乙烯吡咯烷酮；所述水溶性高分子化合物的水溶液中水溶性高分子化合物的质量分数优选为0.01％-0.5％，更优选为0.01％-0.3％，再优选为0.01％-0.1％；在本发明中优选将混合溶液倒入水溶性高分子化合物的水溶液中混合搅拌；所述混合搅拌优选采用磁力搅拌；所述搅拌的速度优选为500-2000r/min，更优选为600-1500r/min，再优选为600-1200r/min；所述搅拌的时间优选为4-24h，使易挥发的有机溶剂逐渐挥发。

接枝聚氨基酸的羟基磷灰石溶解在有机溶剂中制备成均匀的悬液，再将该悬液倾倒入水溶性高分子化合物的水溶液中，此时即构成“水包油”(O/W)乳液，油相与水相互不相容，通过不断的、适宜转速的搅拌，油相分散成微珠分散于水相中，同时有机溶剂具有较高的挥发性，会随着搅拌而逐渐挥发，当挥发完全时，原先聚氨基酸-羟基磷灰石/有机溶剂悬液即可固化成聚氨基酸-羟基磷灰石微球。油相分散成的微珠在水相中随着搅拌可能会发生不断的碰撞-合并-再分散的过程，通过在水相中加入一定含量的水溶性高分子化合物，则搅拌分散开的油相微珠表面会物理吸附一层水溶性高分子化合物分子，该分子可以起到稳定油相微珠、减弱微珠之间的相互碰撞融合，进而提高微载体的制备成功率和稳定性。

除去易挥发的有机溶剂，水洗后，优选冷冻干燥，得到细胞微载体。

图1为本发明提供的细胞微载体制备流程示意图。

本发明将通过表面修饰氨基的羟基磷灰石引发氨基酸-N-羧酸酐单体原位开环聚合，使氨基酸原位聚合于羟基磷灰石表面，聚氨基酸是由氨基酸-N-羧酸酐单体均聚或共聚而成的高分子，具有良好的生物相容性和可降解性，羟基磷灰石是人体骨骼和牙齿的主要无机组分，具有优良的生物相容性和生物活性，并且所得细胞微载体不含其它聚酯材料，且有效结合了羟基磷灰石和聚氨基酸二者的优点，有利于细胞的黏附与增殖，诱导成骨细胞分化，适合于体外细胞扩增以及体内骨组织修复。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种细胞微载体及其制备方法进行详细描述。

以下实施例中所用的试剂均为市售。

实施例1

1.1共沉淀法制备硅烷偶联剂KH-550修饰的羟基磷灰石(记为HA-APS)：将羟基磷灰石(HA)加入至硅烷偶联剂KH-550的90％乙醇水溶液中，HA与硅烷偶联剂KH-550的质量比为1:0.2，室温搅拌6h，然后将产物用乙醇清洗3～5次，室温干燥后，130℃处理2h，得到HA-APS。

1.2以无水二氧六环为溶剂，HA-APS与谷氨酸苄酯-N-羧酸酐(记为BLG-NCA)按质量比(1:1-1:2)，反应32h后，制得接枝量为30％-50％的聚谷氨酸苄酯接枝羟基磷灰石(记为PBLG-g-HA)(1:1可以制备接枝量约33％的PBLG-g-HA，记为P-g-H-33；1:2可以制备接枝量约50％的PBLG-g-HA，记为P-g-H-50)。

1.3将PBLG-g-HA充分分散于三氯甲烷中，制成3％的稳定悬液，将悬液加入聚乙烯醇PVA水溶液中(PVA浓度为0.05％)，800rpm搅拌，待12h后，三氯甲烷挥发完全，制得PBLG-g-HA细胞微载体，通过去离子水清洗微载体可以除去吸附于微载体表面的PVA分子。

将骨细胞MC3T3-E1接种到1.3中得到的细胞微载体及对照样品表面，通过细胞反应器进行培养，定期观察细胞增殖，得到细胞增殖试验柱形图如图2所示，其中对照组为脱脂玻片，P-g-H-33玻片为由接枝量为33％聚谷氨酸苄酯接枝羟基磷灰石在细胞培养玻片上涂平面薄膜得到，P-g-H-50玻片为由接枝量为50％聚谷氨酸苄酯接枝羟基磷灰石在细胞培养玻片上涂平面薄膜得到；P-g-H-33微载体由接枝量为33％聚谷氨酸苄酯接枝羟基磷灰石形成的细胞微载体，P-g-H-50微载体为由接枝量为50％聚谷氨酸苄酯接枝羟基磷灰石形成的细胞微载体。通过体外细胞实验可以充分说明PBLG-g-HA细胞微载体具有优良的促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1黏附、增殖的性质。

图3为MC3T3-E1细胞在P-g-H-33微载体(a与c)及P-g-H-50微载体(b与d)上的荧光染色图片(a,b为Calcein-AM染色；c,d为DAPI染色)，结果表明成骨细胞在实施例1得到的细胞微载体表面黏附良好，生长状态良好。

比较例

将羟基磷灰石与聚(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLGA)共混制备含33％PLGA的细胞微载体(记为H/P-33)与含50％PLGA的细胞微载体(记为H/P-50)。

将骨细胞MC3T3-E1接种到比较例中得到的细胞微载体及对照样品表面，通过细胞反应器进行培养，定期观察细胞增殖，得到细胞增殖试验柱形图如图2所示；图2中由左至右依次为对照组、P-g-H-33玻片、P-g-H-50玻片、H/P-33微载体、H/P-50微载体、P-g-H-33微载体及P-g-H-50微载体。