二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇2000‑双叶酸及其制备方法和应用与流程

本发明属于化学与医学的交叉领域，特别涉及一种二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸及其制备方法和在制备超声造影剂中的应用。

背景技术：

乳腺癌在妇女中的发病率和死亡率较高，全球每年约500,000人死于乳腺癌。乳腺癌的早期检测和确诊有利于及时选择相应的治疗，降低死亡率，是大家极力追求的研究目标。

随着超声分子成像技术和生物纳米技术的迅猛发展，纳米级超声造影剂发展迅速，具有较高散射特性，能显著增强超声检测信号的物质。与传统超声造影剂(血池显像剂)不同，纳米级超声造影剂具有很强的穿透力，能穿过血管壁，其开发和应用还有利于进一步发展靶向性、高效性、小型化且具有辅助治疗作用的新型超声造影剂。而靶向纳米级超声微泡造影剂的出现使病变的靶向成像成为可能，是超声分子影像学发展的重要标志。

近年来研究表明：肿瘤组织在生长过程中较正常组织需要更多的叶酸，叶酸受体在绝大多数正常组织中几乎不表达，而在大部分癌细胞上表达异常升高。报告显示：卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌上的叶酸受体都呈显著高水平表达；而高度未分化的转移性癌表达的叶酸受体水平比非转移性癌还要高。叶酸靶向纳泡(NB)能显著提高纳泡与叶酸受体高表达的肿瘤细胞的被动结合能力。叶酸与肿瘤表面叶酸受体特异性的结合能力与以下两种因素有关：1)不同肿瘤组织细胞表面叶酸受体的量；2)载体上连接的叶酸的含量。目前报道的用于针对叶酸受体的靶向方法有两种：一种是利用如mAb Mov18的单克隆抗体，但由于mAb Mov18具备较强的免疫原性，以及抗体一微泡复合物分子量大,组织穿透力弱等局限，限制了其发展；另一种是用叶酸本身，叶酸相对比较稳定、廉价且不易产生副作用，因此应用比较广泛。PEG2000具备良好的生物相容性、无毒亲水，是作为基团连接最常见的高分子聚合物之一。

现有技术中未发现将L-2-Aminoadipic acid氨基己二酸作为中间连接基团，使更多的叶酸与脂质DSPE表面连接，从而实现纳泡在肿瘤靶部位的富集。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了一种二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸(DSPE-PEG2000-AD-(FOL)₂)及其制备方法；本发明还提供二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸在制备双叶酸靶向超声造影剂中的应用。

本发明的技术方案为：

一、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸

二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸，具有如下所示的结构：

二、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸的制备

二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸的制备方法，制备路线如下：

(1)合成1,2-二硬酯酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇2000-N-羟基丁二酰亚胺；

(2)合成1,2-二硬酯酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基己二酸；

(3)合成端氨基叶酸；

(4)合成二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸；

根据本发明优选的，所述的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸的制备方法，制备步骤如下：

(1)合成1,2-二硬酯酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇2000-N-羟基丁二酰亚胺

将280mg1,2-二硬酯酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇2000(羧基端)溶于无水二氯甲烷8mL中，依次加入17.5mg N-羟基丁二酰亚胺和62mg二环已基碳二亚胺。混合物常温下避光反应3h；过滤除去生成的N,N-二氯氨基甲酸乙酯；滤液倒入预先冷却的乙醚200mL中，将乙醚混合物置于-20℃4h；过滤，干燥得到所需产物；

(2)合成1,2-二硬酯酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基己二酸

将49mgL-2氨基己二酸溶于pH为8的0.1M硼酸缓冲液10mL中，然后加入300mg二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-N-羟基丁二酰亚胺，避光反应30min；将反应液用0.2N盐酸调节pH值为4-4.5，用氯仿萃取3次，每次80mL，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，然后倒入200mL预先冷却的乙醚中，在-20℃下搅拌4h，过滤，干燥得到所需产物；

(3)合成端氨基叶酸

将441mg叶酸溶于20mL无水二甲基亚砜中，依次加入428mgN-叔丁氧羰基-1,3-丙二胺和572mg二环己基碳二亚胺，室温下反应4h。将反应液倒入300mL预先冷却的乙醚中，在-20℃搅拌4h，过滤，滤饼用四氢呋喃洗，干燥，得到叶酸-N-叔丁氧羰基(产率：90％)；将654mg端氨基叶酸溶于无水二氯甲烷中，冰浴下加入50mL三氟乙酸；室温下反应2h；减压旋蒸蒸发除去二氯甲烷和三氟乙酸；将所得残留物倒入预先冷却的乙醚中，过滤，干燥得到所需产物；

(4)合成二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸

将300mg步骤(2)中合成的1,2-二硬酯酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基己二酸溶于5mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，55mg步骤(3)中合成的端氨基叶酸溶于1mL二甲基亚砜中，然后加入至体系中；常温避光反应过夜；然后加入8mL水，6mL 0.1N的盐酸和2mL饱和食盐水，用氯仿萃取4次，每次80mL；合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩；所得残留物倒入200mL预先冷却的乙醚中，-20℃下搅拌3h，过滤，干燥得到所需产物。

三、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸的应用

本发明所述的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸的应用，其特征在于，用于制备双叶酸靶向超声造影剂。

根据本发明，所述的双叶酸靶向超声造影剂的制备方法，步骤如下：

称取0.5mg司盘60，0.5ml吐温80置于1.5mLEP管中，加入1mg二棕榈酸磷脂酰胆碱,1mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸，PBS定容至1mL，通入全氟丙烷气体置换出空气，将离心管放置于恒温水浴锅中加热50min至脂质完全溶解，避光加入DiI染料，再次充入全氟丙烷气体置换其中的空气，机械振荡90s后取出，300rpm离心3min，取下层液体，即为所制备的双叶酸靶向超声造影剂。

本发明还提供一种双叶酸靶向超声造影剂，其特征在于，由本发明所述的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸制备而成。

以上本发明制备方法中未特别说明的均按照现有技术。

本发明首先合成1,2-二硬酯酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇-N-羟基丁二酰亚胺，通过氨基己二酸与活化的端氨基叶酸相连，即合成了双叶酸分子的脂质。本发明还提供了二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸在制备双叶酸靶向超声造影剂中的应用。由二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸进一步制备成双叶酸靶向超声造影剂。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明制备的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸未明显增加超声造影剂粒径；

(2)未影响超声造影剂的体外显影能力；

(3)在上述(1)、(2)前提下二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸能显著提高超声造影剂乳腺癌MCF-7的靶向结合能力。

附图说明

图1是提示二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸成功合成的核磁谱图；

图2是三组不同的叶酸含量的超声造影剂的光镜图；

图3是三组不同的叶酸含量的超声造影剂粒径图；

图4是三组不同的叶酸含量的超声造影剂体外显影图；

图5是CCK-8法检测三组不同的叶酸含量的超声造影剂的不同脂质浓度对乳腺癌MCF-7细胞毒性图；

图6是三组不同的叶酸含量的超声造影剂对乳腺癌MCF-7结合能力的荧光图；

图7是三组不同的叶酸含量的超声造影剂对乳腺癌MCF-7结合能力的流式细胞术图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不限于此。

实施例1：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸的制备

二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸的制备方法，包括如下步骤：

(1)合成1,2-二硬酯酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇2000-N-羟基丁二酰亚胺

将280mg1,2-二硬酯酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇2000(羧基端)溶于无水二氯甲烷(8mL)中，依次加入17.5mg N-羟基丁二酰亚胺和62mg二环已基碳二亚胺。混合物常温下避光反应3h。过滤除去生成的N,N-二氯氨基甲酸乙酯；滤液倒入预先冷却的乙醚(200mL)中，将乙醚混合物置于-20℃4h。过滤，干燥得到所需产物。

(2)合成1,2-二硬酯酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基己二酸

将49mgL-2氨基己二酸溶于pH为8的0.1M硼酸缓冲液(10mL)中，然后加入300mg二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-N-羟基丁二酰亚胺，避光反应30min。将反应液用0.2N盐酸调节pH值为4-4.5，用氯仿萃取(3*80mL)，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，然后倒入200mL预先冷却的乙醚中，在-20℃下搅拌4h，过滤，干燥得到所需产物。

(3)合成端氨基叶酸

将441mg叶酸溶于20mL无水二甲基亚砜中，依次加入428mgN-叔丁氧羰基-1,3-丙二胺和572mg二环己基碳二亚胺，室温下反应4h。将反应液倒入300mL预先冷却的乙醚中，在-20℃搅拌4h，过滤，滤饼用四氢呋喃洗，干燥，得到叶酸-N-叔丁氧羰基(产率：90％)；将654mg端氨基叶酸溶于无水二氯甲烷中，冰浴下加入50mL三氟乙酸。室温下反应2h。减压旋蒸蒸发除去二氯甲烷和三氟乙酸。将所得残留物倒入预先冷却的乙醚中，过滤，干燥得到所需产物。

(4)合成二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸

将300mg(2)中合成的合成1,2-二硬酯酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基己二酸溶于5mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，55mg(3)中合成的端氨基叶酸溶于1mL二甲基亚砜中，然后加入至体系中。常温避光反应过夜。然后加入8mL水，6mL 0.1N的盐酸和2mL饱和食盐水，用氯仿萃取(4*80mL)。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。所得残留物倒入200mL预先冷却的乙醚中，-20℃下搅拌3h，过滤，干燥得到所需产物。

本实施例中，所得二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸的产率为70％，纯度为90％。

二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸成功合成的核磁谱图见图1。在化学位移为0.8的位置六个氢，每个DSPE分子在该位置有两个甲基，化学位移6～8之间有八个氢，为叶酸苯环上的氢，每个叶酸分子含有4个氢，所以对应两个叶酸分子。

实施例2：双叶酸靶向超声造影剂的制备

称取0.5mg司盘60，0.5ml吐温80置于1.5mLEP管中，加入1mg二棕榈酸磷脂酰胆碱，1mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸，PBS定容至1mL，通入全氟丙烷气体置换出空气，将离心管放置于恒温水浴锅中加热50min至脂质完全溶解，避光加入DiI染料，再次充入全氟丙烷气体置换其中的空气，机械振荡90s后取出，300rpm离心3min，取下层液体，即为所制备的双叶酸靶向超声造影剂。

下面结合实验例对本发明做进一步的说明，但不限于此。

三种不同叶酸含量的超声造影剂的制备：

称取0.5mg司盘60，0.5ml吐温80置于1.5mLEP管中，加入1mg二棕榈酸磷脂酰胆碱,分别加入1mg1,2-二硬酯酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇(A组)、1mg1,2-二硬酯酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸(B组)、1mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-双叶酸(C组)，PBS定容至1mL，通入全氟丙烷气体置换出空气，将离心管放置于恒温水浴锅中加热50min至脂质完全溶解，避光加入DiI染料，再次充入全氟丙烷气体置换其中的空气，机械振荡90s后取出，300rpm离心3min，取下层液体，即为所制备的超声造影剂。

A组为空白脂质组，B组为单叶酸组，C组为多叶酸组。

实验例1：三种不同叶酸含量的超声造影剂的表征实验

光镜下观察纳米级UCAs大小、形态，1000×光镜下可见不同叶酸含量的纳泡均呈球形，粒径均一，分散均匀无聚集，见图2。使用纳米激光粒度及Zeta电位分析仪检测超声造影剂的粒径，所有指标重复三次测量取平均值，不同叶酸含量的纳泡粒径分布不同，A,B,C三组粒径分别为129.43±12.33nm，244.1±35.09nm，286.87±22.96nm，见图2。单叶酸组，双叶酸组纳泡粒径与空白组相比差异显著(P均<0.05)，而单叶酸组与双叶酸组粒径无明显差异(P>0.05)，三组超声造影剂粒径均小于400nm，见图3。

实验例2：三种不同叶酸含量的超声造影剂体外显影能力测定实验

将三组NBs置于琼脂凝胶制成的圆孔中，采用GElogiq E9超声诊断仪的造影模式,频率9.0MHz，机械指数(M I)0.12，二维与超声造影模式同步观察，调节参数设置，使得封管针内部出现均匀增强,参数保持不变，用超声仪内部工作站存储图像资料，Image J软件分析声噪比，不同叶酸含量的NBs体外显影能力显影能力不同，见图4，与粒径差异保持一致。A、B、C三组的灰度值分别为205.28±2.10，216.13±1.16，218.17±2.09，其中，单叶酸组，双叶酸组纳泡粒径与空白组相比差异显著(P均<0.01)，而单叶酸组与双叶酸组粒径无明显差异(P>0.05)，见图4。

实验例3：三种不同叶酸含量的超声造影剂对乳腺癌MCF-7细胞细胞毒性检测实验

以10000个/孔将MCF-7细胞接种于96孔板中，加入培养基，37℃、5％CO2孵育箱中培养24h，分别加入10ul浓度为0μg/mL、100μg/mL、120μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、600μg/mL的脂质，孵育过夜后，将培养基换成含有10ulCCK-8的新鲜培养基,继续孵育1-4h，用酶标仪在450nm波长处检测其光吸收值。结果显示脂质浓度在小于50μg/mL时均未表现出明显的细胞毒性，提示进行细胞实验时合适的脂质浓度为50μg/mL，见图5。

实验例4：三种不同叶酸含量的超声造影剂对乳腺癌MCF-7细胞的体外结合能力实验

在培养瓶中接种6×105个细胞，加培养液5mL，37℃，5％CO2孵箱中培贴壁24h，在实验组和对照组中分别加入等量单叶酸，双叶酸NBs，对照组加入空白NBs，置于培养箱中共培养1h后取出，用PBS将细胞冲洗3次，0.25％胰蛋白酶消化后离心，加入200μLPBS混匀细胞，以流式细胞仪检测纳米粒对肿瘤细胞的黏附比例。流式细胞术实验发现双叶酸组MCF-7细胞带荧光的比例96.76％，单叶酸组及无靶向组细胞带荧光的比例分别为33.33％、0.52％，表明双叶酸组纳泡较单叶酸组及空白组与肿瘤细胞有较高的结合效力，见图6。

取对数生长期的MCF-7细胞，以0.25％胰蛋白酶消化，取10μL细胞悬液计数，用含10％胎牛血清的DMEM培养液调整细胞浓度至5×104个/mL，每孔1mL接种于已置入盖玻片的12孔板中爬片，37℃、5％CO₂培养箱中贴壁24h，分别加入100μL空白脂质，单叶酸，双叶酸纳泡，置于培养箱中共培养1h。将盖玻片取出，PBS冲洗3次，丙酮/甲醇混合液固定10min，PBS冲洗2次，Hoechst染色10min，PBS冲洗3次，封片后暗盒保存，于荧光显微镜下观察。荧光显微镜下观察可见对照组中的细胞核呈蓝色荧光，无其他荧光现象，单叶酸组中可见呈蓝色荧光的细胞核周围围绕红色荧光团，并且大部分黏附在细胞膜上，双叶酸组也可见呈蓝色荧光的细胞核周围围绕红色荧光团，并且大部分黏附在细胞膜上，相比单叶酸组荧光强度较强，见图7。