本发明属于抗癌药物设计、合成领域，具体涉及香豆素衍生物及其制备方法和应用。
背景技术：
随着城市化、工业化进程的加速，环境污染和食品安全问题日益突出，加之人们不良生活方式和行为习惯的影响，癌症已成为严重影响人类健康、威胁人类生命的重大疾病之一，是人类在二十一世纪期待攻克的主要难题之一。癌症不仅给病人造成身体和精神上的折磨，还给患者家庭带来巨大的经济和精神压力，同时造成劳动力的巨大损失和社会资源的惊人消耗，因此如何治愈这一严重威胁人类生命的疾病，减少病人的痛苦，已成为全世界各国的首要任务。
化学治疗(chemotherapy)，简称化疗，是目前使用最广泛的一类治疗癌症以及非癌症疾病的方法，主要是利用化学合成类药物来实现对疾病的治疗。常用的抗肿瘤化疗药有阿霉素、柔红霉素、丝裂霉素、氟脲嘧啶脱氧核、顺铂等。这些小分子化合物除了可以通过被动运输或者借助于载体的方式进入细胞内以外，还可以通过与一些亲和试剂如DNA当中的嘌呤结合进入细胞内部，抑制肿瘤细胞的DNA复制和转录，最终导致细胞周期停滞或引发细胞凋亡，达到化疗的目的，化疗在临床肿瘤治疗方面已经取得了显著的效果。
香豆素是一类重要的天然香料，大量存在于自然界的一些植物如黑香豆、胡萝卜、芹菜、香菜以及柑橘类当中，对人类的健康有很大的帮助。由于香豆素具有成本低且副作用小的特点而被用作补充和替代药物，被用于抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎、抗氧化和抗凝等方面。经过对肾癌细胞的体外活性研究表明，7-羟基香豆素不仅具有非常好的细胞毒性而且也是有效的细胞生长抑制剂，这种香豆素对几种人癌细胞系(如胃癌、结肠癌、肝癌细胞系以及淋巴癌细胞系)和异种移植模型都有非常好的体外活性。低聚乙二醇单甲醚是一种两亲性分子，在香豆素衍生物上引入低聚乙二醇单甲醚可以改善香豆素衍生物的两亲性，提高香豆素衍生物的生物相容性。本发明致力于合成一系列香豆素衍生物，并研究了它们的离体抗肿瘤活性。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一类香豆素衍生物及其制备方法和应用，通过小分子哌嗪和低聚乙二醇单甲醚链的引入，使得所制得的香豆素衍生物具有良好的两亲性，这有利于药物在生物体内的代谢和细胞对药物的摄取；从而得到了一种具有较高生物相容性，毒副作用小，抗癌活性高的新药；本发明合成的化合物结构单一，产品容易提纯；合成方法比较简单，副反应少，产率较高，原料易得，成本低，有利于工业化生产。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一、一种香豆素衍生物，具有通式Ⅰ的结构：
，n=1～3
制备方法包括以下步骤：
（1）以化合物、炔丙醇为起始原料，合成化合物1，其结构式为：
（2）接着以化合物，n=1～3和化合物1为起始原料，合成化合物Ⅰ。
具体制备方法为：
步骤（1）具体制备方法为：将化合物、炔丙醇、三苯基磷和DEAD按摩尔比为1:2:2:5加入到50 mL圆底烧瓶中，以无水四氢呋喃作溶剂，冰浴下反应1小时，然后转到室温反应过夜；反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，所得粗产物以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂经硅胶柱色谱纯化分离后得到化合物1，产率为50%-58%；
步骤（2）具体制备方法为：将化合物，n=1～3和化合物1按摩尔比2:1加入至7 mL DMF和水的混合液中，然后再将0.1-1当量的CuSO4·5H2O、0.2-2当量的抗坏血酸钠加入至混合液中，室温下剧烈搅拌24小时；反应液用CH2Cl2 和水萃取；有机层经无水Na2SO4 干燥后减压旋干；然后以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到化合物Ⅰ，产率为75%-80%。所述的DMF和水的混合液中：DMF和水的体积比为6:1。
所述的香豆素衍生物Ⅰ，均可用于制备化学治疗的药物。
化学治疗是目前使用最广泛的一类治疗癌症以及非癌症疾病的方法，主要是利用化学合成类药物来实现对疾病的治疗。常用的抗肿瘤化疗药有阿霉素、柔红霉素、丝裂霉素、氟脲嘧啶脱氧核、顺铂等。香豆素是一类重要的天然香料，对人类的健康有很大的帮助。香豆素不仅具有非常好的细胞毒性而且也是有效的细胞生长抑制剂，这种香豆素对几种人癌细胞系(如胃癌、结肠癌、肝癌细胞系以及淋巴癌细胞系)和异种移植模型都有非常好的体外活性。本发明合成了一系列香豆素衍生物，母体通过用哌嗪和聚乙二醇单甲醚修饰从而增加了其抗癌活性和生物相容性。
本发明具有以下突出优点：
（1）合成路线设计合理，步骤简单，反应容易实现，副反应少，产率高，分离纯化简单；
（2）该系列香豆素衍生物具有较强的抗癌活性，有利于化学治疗；
（3）两亲性基团的引入提高了抗癌药物的生物相容性，使得其具有较好的抗肿瘤效果；
（4）产物结构单一，组分明确，所用原料低廉，易于实现工业化生产。
具体实施方式
以下具体实施例进一步详细阐述关于本发明中相关化合物的制备过程、纯化方法、理化性质表征以及离体抗肿瘤活性测试，以便全面理解本发明，但不以任何方式限制此发明，本发明并不仅局限于以下实例。
实施例1（n=1）
（1）向50 mL圆底烧瓶中加入25 mL无水四氢呋喃，然后将该反应瓶置于冰水浴中，加入三苯基磷 (2.05 g，7.82 mmol)，搅拌溶解后依次加入化合物 (1.43 g，5.21 mmol)、炔丙醇 (0.61 mL，10.43 mmol)和DEAD(4.1 mL，26.05 mmol)；所得混合物在氮气保护下，室温搅拌过夜；TLC检测反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，所得粗产物以二氯甲烷-甲醇 (15:1，v/v)为洗脱剂经硅胶柱色谱分离纯化得白色固体 (0.94 g，58％)。
结构表征：1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ7.50 (d, J = 8.8 Hz, 1 H, ArH), 6.91 (m, 2 H, ArH), 4.74 (d, J = 2.4 Hz, 2 H, CH2C≡C-), 3.17 (br s, 4 H, NCH2), 2.62 (br s, 4 H, NCH2), 2.55 (t, J = 2.4 Hz, 1 H, CH≡C-), 2.46 (s, 3 H, CH3), 2.42 (s, 3 H, CH3)；高分辨质谱[HRMS (ESI)]：C18H20N2O3理论计算值 (m/z[M+H+])为313.1552，实际测试值为313.1545。
（2）向10 mL的圆底烧瓶中加入1 mL水，再加入抗坏血酸钠 (30 mg，0.15 mmol) 和五水硫酸铜 (15 mg，0.06 mmol)，所得混合物在氮气保护下搅拌5分钟，再往上述溶液中加入用6 mL DMF溶解的化合物 (0.09 g，0.62 mmol)和 (0.10 g，0.31 mmol)，氮气保护下室温反应24 h；TLC检测反应完全后，将DMF旋干，并用二氯甲烷和少量甲醇溶解，将溶液转移到分液漏斗中，加水，用30 mL二氯甲烷萃取3次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥。过滤掉无水硫酸钠，减压旋蒸除去溶剂，粗产物用二氯甲烷-甲醇(10:1, v/v)为洗脱机经硅胶柱色谱纯化后，得浅黄色固体 (0.11 mg，78﹪)。
结构表征：1H NMR (400 MHz, CDCl3)：δ8.05 (s, 1 H, triazole-H), 7.72 (d, J = 8.8 Hz, 1 H, ArH), 7.38 (m, 2 H, ArH), 5.66 (s, 2 H, OCH2) 4.82 (t, J = 4.8 Hz, 2 H, CH2), 4.05 (t, J = 4.8 Hz, 2 H, CH2), 3.68-3.70 (m, 2 H, CH2), 3.43-3.46 (m, 2 H, CH2), 3.26 (s, 3 H, CH3), 3.17 (br s, 4 H, NCH2), 2.84 (br s, 4 H, NCH2), 2.48 (s, 3 H, CH3), 2.29 (s, 3 H, CH3); 高分辨质谱[HRMS (ESI)]：C18H20N2O3理论计算值 (m/z[M+H+])为457.2325，实际测试值为457.2316。
实施例2（n=2）
（1）向10 mL的圆底烧瓶中加入1 mL水，再加入抗坏血酸钠 (30 mg，0.15 mmol)和五水硫酸铜 (15 mg，0.06 mmol)，所得混合物在氮气保护下搅拌5分钟，再往上述溶液中加入用6 mL DMF溶解的化合物 (0.13 g，0.70 mmol)和 (0.11g，0.35 mmol)，氮气保护下室温反应24 h。TLC检测反应完全后，将DMF旋干，并用二氯甲烷和少量甲醇溶解，将溶液转移到分液漏斗中，加水，用30 mL二氯甲烷萃取3次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥。过滤掉无水硫酸钠，减压旋蒸除去溶剂，粗产物用二氯甲烷-甲醇(10:1，v/v)为洗脱机经硅胶柱色谱纯化后，得浅黄色固体 (0.13 mg，70﹪)。
结构表征：1H NMR (400 MHz, CDCl3)：δ7.72 (s, 1 H, triazole-H), 7.62 (d, J = 8.8 Hz, 1 H, ArH), 7.05 (m, 2 H, ArH), 5.86 (s, 2 H, OCH2), 4.42 (t, J = 4.8 Hz, 2 H, CH2), 3.95 (t, J = 4.8 Hz, 2 H, CH2), 3.78-3.80 (m, 2 H, CH2), 3.68-3.74 (m, 4 H, CH2), 3.52-3.56 (m, 2 H, CH2), 3.45 (s, 3 H, CH3), 3.18 (br s, 4 H, NCH2), 2.74 (br s, 4 H, NCH2), 2.54 (s, 3 H, CH3), 2.48 (s, 3 H, CH3); 高分辨质谱[HRMS (ESI)]：C18H20N2O3理论计算值 (m/z[M+H+])为501.2587，实际测试值为501.2577。
实施例3（n=3）
（1）向10 mL的圆底烧瓶中加入1 mL水，再加入抗坏血酸钠 (30 mg，0.15 mmol)和五水硫酸铜 (15 mg，0.06 mmol)，所得混合物在氮气保护下搅拌数分钟，再往上述溶液中加入用6 mL DMF溶解的化合物 (0.2 g，0.86 mmol)和 (0.13 g，0.43 mmol)，氮气保护下室温反应24 h；TLC检测反应完全后，将DMF旋干，并用二氯甲烷和少量甲醇溶解，将溶液转移到分液漏斗中，加水，用30 mL二氯甲烷萃取3次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥。过滤掉无水硫酸钠，减压旋蒸除去溶剂，粗产物用二氯甲烷-甲醇(10:1，v/v)为洗脱机经硅胶柱色谱纯化后，得浅黄色固体 (0.17 mg，72﹪)。
结构表征：1H NMR (400 MHz, CDCl3)：δ7.68 (s, 1 H, triazole-H), 7.53 (d, J = 8.8 Hz, 1 H, ArH), 6.93 (m, 2 H, ArH), 5.36 (s, 2 H, OCH2) 4.22 (t, J = 4.8 Hz, 2 H, CH2), 3.89 (t, J = 4.8 Hz, 2 H, CH2), 3.74-3.76 (m, 2 H, CH2), 3.64-3.70 (m, 4 H, CH2), 3.60-3.61 (m, 4 H, CH2), 3.54-3.56 (m, 2 H, CH2), 3.38 (s, 3 H, CH3), 3.20 (br s, 4 H, NCH2), 2.65 (br s, 4 H, NCH2), 2.49 (s, 3 H, CH3), 2.44 (s, 3 H, CH3); 高分辨质谱[HRMS (ESI)]：C18H20N2O3理论计算值 (m/z[M+H+])为545.2849，实际测试值为545.2835。
应用实例 1
对本发明实施例1-3所制得的化合物的离体光动力抗肿瘤活性进行了初步探究，为今后在体实验研究提供重要的参考，具有重要的研究价值；化合物的离体光动力抗肿瘤活性是通过细胞毒性实验来完成的，所用方法是MTT法；MTT法的原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT（3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐）还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞中因无琥珀酸脱氢酶而不产生甲瓒。用二甲基亚砜（DMSO）溶解活细胞产生的甲瓒，用多功能酶标仪测定其在570 nm波长处的吸收值（OD值），可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT甲瓒形成的量与活细胞数成正比。对本发明所涉及到的化合物的细胞毒性进行了研究，并获得了各个化合物对人胃癌细胞BGC-823的半数抑制浓度即IC50值，由此可以初步判断药物的抗肿瘤活性。
MTT实验具体过程包括：取处于对数期且生长状态良好的人胃癌细胞BGC-823，用0.25%胰蛋白酶消化传代，吹打均匀后用DMEM培养基（含10%小牛血清）配制成3×103cells/ mL细胞悬浮液，每孔加100 μL细胞悬浮液（约含3000个肿瘤细胞）接种于96孔培养板内，于37℃，5% CO2培养箱内培养过夜。实验设阳性对照组即空白对照组和阴性对照组即溶剂对照组。先将实施例1-3制得的香豆素衍生物配制成DMSO储备液，使用前用DMEM将药物稀释为7个不同浓度，终溶液中 DMSO的含量为1%。每个浓度设定6个平行孔，每孔加入200 μL不同浓度的药物后置于培养箱内孵育。细胞毒性实验：加药孵育24小时后，弃去上层培养基，加入100 μL不含药的新鲜培养基，置于培养箱内继续培养。24 h后，每孔加入MTT的PBS溶液（5 mg·mL-1）10 μL，37℃孵育4小时，小心弃去上层溶液，向每孔中加入100 μL DMSO溶解甲瓒，于摇床中震荡15分钟使甲瓒完全溶解后，用多功能酶标仪测定570 nm波长处OD值。
通过MTT法探索了实施例1-3制得的化合物对人胃癌细胞BGC-823的杀伤效果。所得数据经三次平行实验后由GraphPad Prism 5.0统计分析软件处理得到，结果以Mean±SD来表示。由实验结果可知，3种化合物都对人胃癌细胞BGC-823表现出强的杀伤作用，其半数抑制浓度见表1。比较研究发现，链的长短对化合物的活性没有明显的影响。研究表明，所述的系列香豆素衍生物都具有较强的抗癌活性。
表1 实施例1-3制得的香豆素衍生物对人胃癌细胞BGC-823的IC50值
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。