本发明涉及药物化学领域，具体涉及一类新型含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物、它们的制备方法及其作为一类新的抗肿瘤药物先导化合物的应用。
背景技术：
刺芒柄花素(Formononetin)为天然植物红车轴草的花序及带花枝叶，属于异黄酮类化合物，对于预防乳腺癌、前列腺癌等癌症有一定的作用。抗肿瘤机制表明，天然产物刺芒柄花素通过IGF1/PI3K/Akt通路诱导乳腺癌细胞的周期阻滞，可作为候选抗肿瘤药物。但是，刺芒柄花素作为候选抗肿瘤药物的主要缺陷为活性较弱，在应用过程中收到很大限制。例如Xin Chen小组报道了刺芒柄花素的体外抗增殖活性，其对结肠癌细胞HCT-116、神经母肿瘤细胞SH-SY5Y及前列腺癌细胞DU-145的活性分别仅为60.97μM,>100μM,>100μM(European Journal of Medicinal Chemistry,2012,54,175-187)。
氨基二硫代甲酸酯是一种重要的抗肿瘤活性基团，通常由氨基化合物和二硫化碳合成。多个研究小组利用药物拼接原理将氨基二硫代甲酸酯和其它药效基团进行连接，合成得到了一些具有优秀抗肿瘤活性的化合物。例如本课题组在查尔酮中引入氨基二硫代甲酸酯(如下式)，合成了一系列抗肿瘤活性优于先导化合物的新型查尔酮衍生物(Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2016,26,3918-3922)。
以氨基二硫代甲酸酯为母体，设计合成含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物，同样具有研究价值，对拓宽刺芒柄花素类化合物的研究领域具有重要意义，目前没见相关文献报道。
技术实现要素：
本发明目的在于提供系列新型含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物，解决天然产物刺芒柄花素抗肿瘤活性弱的问题。
本发明的另一个目的在于提供一种简单高效，绿色环保的合成含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物的方法。
本发明的再一个目的在于提供所述化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
为实现本发明目的，本发明通过药物拼接原理，引入氨基二硫代甲酸酯基团合成了新型含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物，所述一类新型含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物结构式如下：
为苄基哌嗪基、乙基哌嗪基、甲酰基哌嗪基、甲基哌嗪基、吗啡啉基、四氢吡咯基、叔丁氧羰基哌嗪基。
n代表碳原子的个数，为0,1,2。
优选如下化合物之一：
本发明所述新型含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物主要通过下列步骤制得：
1.通式(1a～1d)的制备方法：
溶剂中，将刺芒柄花素在碱性条件下和1,2-二溴乙烷、1,3-二溴丙烷或1,4-二溴丁烷反应，体系浓缩至干，加入适量乙醇重结晶得到化合物1a～1d，所用的碱性化合物是氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、磷酸钠、十二水磷酸钠、磷酸钾、碳酸氢钾、碳酸氢钠中的一种；所用的溶剂为乙醇、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃、二氧六环中之一或其中任意两种的混合物；反应在0-90℃之间进行。
刺芒柄花素与1,2-二溴乙烷、1,3-二溴丙烷或1,4-二溴丁烷的摩尔比范围：1:1～1:1.2.
2.通式(I1～I9)的制备方法：
溶剂中，化合物1a～1d其中之一与取代仲胺化合物、二硫化碳在弱碱性条件下反应，待反应完成后，抽滤，滤液浓缩重结晶即得到通式(I1～I9)化合物；所用的溶剂为丙酮、乙腈、乙醇、甲醇中之一或其中任意两种或三种的混合物；反应在0-30℃之间进行，重结晶溶剂为乙醇。所用的弱碱性化合物是磷酸钠、十二水磷酸钠、磷酸钾、碳酸氢钾、碳酸氢钠中的一种。
所述取代仲胺化合物为：苄基哌嗪、乙基哌嗪、甲酰基哌嗪、甲基哌嗪、吗啡啉、四氢吡咯、叔丁氧羰基哌嗪。
化合物1a～1d与取代仲胺化合物、二硫化碳的摩尔比：1:1.2:1.5。
本发明创新点及优点在于：通过药物拼接原理，以氨基二硫代甲酸酯为母体，经过简单的2步反应，设计合成了9个含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物，解决天然产物刺芒柄花素抗肿瘤活性弱的问题。显著提高了刺芒柄花素的抗肿瘤活性，有望将其应用于抗肿瘤药物的制备，拓宽了刺芒柄花素类化合物的研究领域。
附图说明
图1为不同浓度的本发明衍生物I-8在48h下，对前列腺癌细胞细胞周期的影响。
具体实施方式
为了对本发明进行更好的说明，特举实施例如下：
实施例1通式(1a～1d)的制备
100ml四氢呋喃中，将10g刺芒柄花素、6.2g碳酸钾和7g 1,2-二溴乙烷或7.5g 1,3-二溴丙烷或8g 1,4-二溴丁烷反应，80℃加热搅拌。反应6h后，体系浓缩至干，加入10ml乙醇重结晶得到化合物1a～1d。
实施例2通式(I1～I9)的制备
10ml丙酮中，1g化合物(1a～1d)与600mg取代仲胺、300mg二硫化碳、440mg磷酸钠室温条件下反应，待反应完成后，抽滤，滤液浓缩，3ml乙醇重结晶即得到通式(I1～I9)化合物。
通式(I1～I9)结构表征如下：
I-1：产率83％.白色固体.Mp:124～125℃.1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.42(s,1H),8.03(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.7Hz,2H),7.38–7.29(m,4H),7.29–7.22(m,1H),7.17(d,J＝2.2Hz,1H),7.09(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),4.22(t,J＝6.1Hz,4H),3.92(s,2H),3.79(s,3H),3.51(s,2H),3.42(t,J＝7.2Hz,2H),2.45(s,4H),2.22–2.09(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ194.74,174.60,162.81,158.99,157.38,153.45,137.53,130.04,128.91,128.22,127.09,126.96,124.05,123.35,117.63,115.02,113.60,101.12,67.14,61.27,55.13,51.93,32.72,27.86.HR-MS(ESI):Calcd.C31H33N2O4S2,[M+H]+m/z:561.1885,found:561.1882.
I-2：产率85％.黄色固体.Mp:167～168℃.1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.43(s,1H),8.03(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.8Hz,2H),7.18(d,J＝2.3Hz,1H),7.09(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),4.22(t,J＝6.1Hz,4H),3.91(s,2H),3.79(s,3H),3.42(t,J＝7.2Hz,2H),2.47–2.39(m,4H),2.36(q,J＝7.2Hz,2H),2.21–2.10(m,2H),1.01(t,J＝7.2Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ194.69,174.60,162.82,158.99,157.38,153.46,130.05,126.96,124.05,123.35,117.62,115.03,113.61,101.13,67.15,55.14,51.71,50.99,32.69,27.87,11.85.HR-MS(ESI):Calcd.C26H31N2O4S2,[M+H]+m/z:499.1729,found:499.1725.
I-3：产率78％.白色固体.Mp:174～176℃.1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.43(s,1H),8.04(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.7Hz,2H),7.18(d,J＝2.2Hz,1H),7.10(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),4.23(t,J＝6.1Hz,4H),3.97(s,2H),3.79(s,3H),3.64–3.55(m,4H),3.44(t,J＝7.2Hz,2H),2.24–2.11(m,2H),2.03(s,3H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ195.33,174.61,168.68,162.81,158.99,157.38,153.47,130.05,126.97,124.04,123.35,117.62,115.05,113.61,101.13,67.15,55.15,44.41,32.69,27.81,21.21.HR-MS(ESI):Calcd.C26H29N2O5S2,[M+H]+m/z:513.1510,found:513.1518.
I-4：产率78％.黄色固体.Mp:167～169℃.1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.43(s,1H),8.04(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.7Hz,2H),7.18(d,J＝2.3Hz,1H),7.10(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),4.22(t,J＝6.1Hz,4H),3.92(s,2H),3.79(s,3H),3.42(t,J＝7.2Hz,2H),2.44–2.32(m,4H),2.20(s,3H),2.14(dd,J＝13.7,7.0Hz,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ194.86,174.60,162.81,158.99,157.38,153.47,130.04,126.96,124.04,123.35,117.62,115.03,113.60,101.12,67.15,55.13,53.94,45.03,32.71,27.86.HR-MS(ESI):Calcd.C25H29N2O4S2,[M+H]+m/z:485.1574,found:485.1569.
I-5：产率79％.白色固体.Mp:156～158℃.1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.43(s,1H),8.04(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.8Hz,2H),7.18(d,J＝2.3Hz,1H),7.10(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),4.23(t,J＝6.1Hz,4H),3.94(s,2H),3.79(s,3H),3.72–3.60(m,4H),3.44(t,J＝7.2Hz,2H),2.23–2.11(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ195.39,174.60,162.81,158.99,157.38,153.47,130.05,126.97,124.04,123.35,117.62,115.03,113.60,101.12,67.14,65.56,55.13,32.56,27.84.HR-MS(ESI):Calcd.C24H26NO5S2,[M+H]+m/z:472.1257,found:472.1252.
I-6：产率81％.白色固体.Mp:159～161℃.1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.43(s,1H),8.04(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.8Hz,2H),7.18(d,J＝2.3Hz,1H),7.09(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),4.22(t,J＝6.2Hz,2H),3.79(s,3H),3.76(d,J＝6.9Hz,2H),3.62(t,J＝6.8Hz,2H),3.40(t,J＝7.2Hz,2H),2.23–2.10(m,2H),2.07–1.96(m,2H),1.91(p,J＝6.7Hz,2H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ190.61,174.60,162.83,158.99,157.39,153.47,130.05,126.96,124.05,123.35,117.62,115.04,113.60,101.11,67.15,55.13,54.93,50.53,32.03,28.03,25.53,23.71.HR-MS(ESI):Calcd.C24H26NO4S2,[M+H]+m/z:456.1306,found:456.1303.
I-7：产率79％.白色固体.Mp:140～142℃.1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.43(s,1H),8.04(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.6Hz,2H),7.26(d,J＝1.8Hz,1H),7.11(dd,J＝9.0,2.0Hz,1H),7.00(d,J＝8.6Hz,2H),4.38(t,J＝6.2Hz,2H),4.26(s,2H),3.97(s,2H),3.80(s,3H),3.77(t,J＝6.2Hz,2H),3.48(s,4H),1.42(s,9H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ195.25,190.44,175.10,162.88,159.52,157.85,154.03,130.55,127.56,124.33,123.87,118.19,115.46,114.10,101.78,79.89,75.53,67.15,55.63,35.36,28.49.HR-MS(ESI):Calcd.C28H33N2O6S2,[M+H]+m/z:557.1788,found:557.1780.
I-8：产率83％.白色固体.Mp:165～167℃.1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.42(s,1H),8.03(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.8Hz,2H),7.17(d,J＝2.3Hz,1H),7.09(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),4.22(t,J＝6.1Hz,4H),3.95(s,2H),3.79(s,3H),3.44(dd,J＝15.1,7.3Hz,6H),2.22–2.10(m,2H),1.42(s,9H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ195.33,174.59,162.80,158.98,157.37,153.68,153.44,130.04,126.95,124.04,123.34,117.62,115.02,113.59,101.10,79.35,67.14,55.13,32.69,27.99,27.81,18.53.HR-MS(ESI):Calcd.C29H35N2O6S2,[M+H]+m/z:571.1940,found:571.1937.
I-9：产率85％.白色固体.Mp:143～144℃.1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.41(s,1H),8.02(d,J＝8.9Hz,1H),7.53(d,J＝8.7Hz,2H),7.15(d,J＝2.2Hz,1H),7.07(dd,J＝8.9,2.2Hz,1H),7.00(d,J＝8.8Hz,2H),4.23(s,2H),4.16(t,J＝5.8Hz,2H),3.94(s,2H),3.51–3.42(m,4H),1.95–1.76(m,4H),1.42(s,9H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ196.13,175.10,163.47,159.48,157.89,154.18,153.92,130.54,127.41,124.55,123.83,118.01,115.51,114.09,101.51,79.86,68.48,55.62,36.24,28.49,28.09,25.55.HR-MS(ESI):Calcd.C30H37N2O6S2,[M+H]+m/z:585.2096,found:585.2093.
上述化合物的抗肿瘤活性测定：
1.实验方法：
筛选所用化合物均是由本发明合成、纯化而得；样品储备液：称取1-2mg样品置于1.5mL EP管中，然后用DMSO配制成浓度是128×103μg/mL的溶液，4℃保存放置，实验时根据所需浓度利用培养基稀释。
2.初筛
取对数生长期的细胞，消化计数后，用培养基调整细胞密度，接种至96孔板中，培养24h后，弃去培养基，加入用培养基稀释好的药物(50μg/mL、100μg/mL)，每个浓度设6个复孔，另设空白对照组及阴性对照组。药物作用48h后，每孔加入20μL MTT，继续培养4h后，吸去液体，加入150mL的DMSO，振荡均匀，酶标仪490nm处检测吸光度值，计算抑制率，计算公式如下：
抑制率(％)＝(1-给药组吸光度值/空白组吸光度值)×100％
3、细筛
50μg/mL时抑制率大于50％的样品，重新设置浓度进行细筛。即将待测样品以0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL浓度加入96孔板中，培养48h后，检测。试验结果采用SPSS软件计算IC50值和相关系数。
4、实验结果：
表1上述化合物对三种肿瘤细胞的抗肿瘤活性评价数据：
a人类胃癌细胞b人类食管癌细胞c人类前列腺癌细胞
实验结果表明，本发明所提供的含氨基二硫代甲酸酯的刺芒柄花素衍生物对EC109，MGC-803和PC-3三种肿瘤细胞具有一定的抑制作用。其中化合物I8的体外抗前列腺肿瘤活性约为刺芒柄花素的28倍，可作为进一步开发的候选或者先导化合物，应用于制备抗肿瘤药物。
进一步对活性较好的化合物I-8进行了抗前列腺癌机制研究，发现I-8能阻断前列腺癌细胞细胞周期于G1期。相应结果见附图1。