一种人源程序性死亡受体hPD‑1单克隆抗体的制作方法

本发明属于抗体的制备方法技术领域，具体涉及一种人源程序性死亡受体PD-1单克隆抗体的制备方法。

背景技术：

众所周知，初始T细胞活化离不开抗原肽-MHC分子复合物与T细胞表面受体（TCR）的相互作用，但同时需要抗原呈递细胞表面（APC）的共刺激分子与其表面的相应受体结合来提供第二刺激信号。B7家族作为唯一能从APC单向传送信号至T细胞的共刺激分子，可以调控免疫信号的强度、持续时间和过程。人源程序性死亡分子1（hPD-1）是B7家族的一员，是重要的免疫抑制分子，与其配体PD-Ls结合后，可激活细胞内的抑制信号，诱导T细胞凋亡，抑制T细胞的活化和增殖以及IL-2和IFN-γ等细胞因子的分泌，从而抑制免疫应答反应，参与调节免疫耐受，导致微生物感染和肿瘤细胞的免疫逃逸。hPD-1可表达在激活的T细胞、B细胞和骨髓细胞等免疫细胞上，属于免疫球蛋白家族。因此，hPD-1作为肿瘤发生、发展、转移以及肿瘤预后的重要指标，需要准确和高灵敏的免疫组化技术对其检测。

免疫组化技术是20世纪70年代初Sterb Berger在酶标法的基础上以免疫学的抗原抗体反应为理论基础发展起来的技术，可对组织和细胞内的特定抗原或抗体(多肽和蛋白质)进行定位、定性或定量检测。目前，免疫组化技术在临床检测的应用包括良性和恶性肿瘤的诊断与鉴定、肿瘤分期、肿瘤来源的鉴定、区分组织器官交界处肿瘤、发现微小转移灶和指导肿瘤的治疗。因此，有必要制备高纯度、高特异性的hPD-1单克隆抗体，利用免疫组化技术指导肿瘤的诊断和治疗。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供一种人源程序性死亡受体PD-1单克隆抗体的制备方法。

为此采用如下的技术方案：

一种人源程序性死亡受体hPD-1单克隆抗体，所述抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述的重链可变区碱基序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-2所示，轻链可变区的碱基序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3-4所示。

所述抗体为如下1）或2）所示的蛋白质：

1）重链与轻链可变区由SEQ ID NO.1-4所示的碱基序列或氨基酸序列组成的蛋白质；

2）将SEQ ID NO.1-4所示的轻链和/或重链可变区的碱基序列或氨基酸序列经过一个或几个碱基/氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1）衍生的蛋白质的轻链和/或重链可变区。

所述抗体的轻链和/或重链可变区编码DNA分子，所述编码DNA分子为如下1）-3）中任一所述的DNA分子：

1）其轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列所示；

2）与SEQ ID NO.1-4中序列限定的DNA分子杂交且编码权利要求1-2中任一所述抗体的DNA分子；

3）与1）的DNA分子具有90%以上的同源性且编码权利要求1-2中任一所述的抗体的DNA分子。

所述的单克隆抗体的重组表达载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌。

任一所述的抗体在如下a）-c）中任一种中的应用：

a）制备特异性结合人源程序性死亡受体PD-1的产品；

b)制备利用免疫组化技术检测肿瘤组织中PD-1的产品；

c)制备作为治疗肿瘤的药物。

一种人源程序性死亡受体hPD-1单克隆抗体的制备方法，采用如下步骤：

1）利用分子克隆的方法构建hPD-1胞外段的重组质粒，转化至宿主菌BL21（DE3）中进行蛋白表达，纯化后，获得高纯度、构象均一的hPD-1蛋白；

2）将制备好的hPD-1抗原注射至Balb/c小鼠体内；

3）重复步骤2）再将强免疫2次后，采血，利用ELISA技术检测血清中抗体效价；

4）取效价达到要求（高于100,000）的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，制备杂交瘤细胞；

5）对分泌hPD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞进行2~3次的克隆化培养；

6）将步骤5）获得的克隆化培养的杂交瘤细胞接种于Balb/c小鼠腹腔内，获得hPD-1蛋白单克隆抗体浓度很高的腹水单抗；

7）利用Protein A亲和层析柱对腹水单抗进行纯化；

8）特异性检测：利用免疫组化技术对获得的抗体的特异性进行检测；

9）利用PCR技术对制备的单克隆抗体的重链可变区进行基因测序。

具体为：

1）获取抗原hPD-1蛋白：人源程序性死亡受体hPD-1是由PDCD-1基因编码的共刺激分子，选取hPD-1蛋白的胞外结构域作为抗原，其碱基数约400 bp，蛋白分子量18 kDa左右。利用软件Primer premier 5.0设计hPD-1蛋白的胞外结构域的上游引物和下游引物，利用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增获得hPD-1蛋白的胞外结构域的基因，分别对该目的基因与表达载体pET-22b进行双酶切，然后利用T4-DNA连接酶进行酶连，获得重组质粒pET-22b-hPD-1。将重组质粒pET-22b-hPD-1转化至宿主菌BL21（DE3）中，进行蛋白表达。根据聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）的结果，hPD-1蛋白的胞外结构域以包涵体的形式表达。将hPD-1蛋白的包涵体溶于含有8 M尿素的PBS缓冲液中，进行Ni柱纯化，然后利用复性缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，400 mM L-Arghydrochloride，2 mM EDTA，5 mM Cystamine，0.5 mM Cysteamine），进行hPD-1蛋白的复性，获得空间折叠正确、构象均一的抗原。最后再利用AKTA 蛋白纯化系统进一步纯化hPD-1蛋白，获得高纯度，高构象均一性的抗原蛋白。

2）用生理盐水将步骤1）获得的hPD-1蛋白稀释至1 mg/mL，然后与等体积的完全弗氏佐剂（IFC）混合，利用乳化器将混合物乳化至滴水不化后，对Balb/c小鼠进行免疫，每只小鼠注射剂量为：100 μg。

3）重复步骤2）所述，加强免疫两次：第15天，每只小鼠注射剂量为：50 μg；第29天，每只小鼠注射剂量为：50 μg。

4）利用ELISA检测Balb/c小鼠血清中的抗体效价，取效价达到要求（高于100,000）的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，制备杂交瘤细胞。

5）融合2周左右，利用ELISA法对杂交瘤细胞进行筛选，获得分泌hPD-1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。

6）对于5）步骤获得的杂交瘤细胞进行2~3次的克隆化培养，直至100%孔分泌hPD-1蛋白单克隆抗体，建系保存该杂交瘤细胞株。

7）将步骤6）克隆化培养、筛选获得的杂交瘤细胞接种于Balb/c小鼠腹腔内，获得hPD-1蛋白单克隆抗体浓度很高的腹水单抗。

8）将2 g左右的Protein A填料与10 mL pH 7.0的Tris缓冲液混合，倒入层析柱，静置5-10 min，使得填料自然沉降，得到无气泡的Protein A填料柱；加入10倍柱体积的pH 7.0的Tris缓冲液，并以合适的流速冲洗柱子；将步骤7）获得高浓度单抗与pH 7.0的Tris缓冲液按照体积比1:2混合后，用0.45 μm滤膜过滤后，加入层析柱中进行亲和层析，然后利用洗脱液（pH 4.5 0.1 M柠檬酸溶液加pH 8.0的中和液）洗脱抗体，将洗脱液利用PBS透析三次，最后利用超滤浓缩管浓缩抗体溶液，获得高纯度、高浓度的hPD-1单克隆抗体。

9）利用PCR技术对制备的单克隆抗体的重链可变区进行基因测序。

本发明的优点在于：本抗体是完全人源性抗体，具有高特异性、高亲和力和高灵敏度，且抗体具有很好的膜定位；本发明纯化抗体的方法是利用Protein A填料来纯化，得到的单克隆抗体纯度更高。本发明所采用的人源PD-1蛋白制备的单克隆抗体能够为肿瘤的诊断与治疗提供一定的科学指导。

附图说明

图1：hPD-1蛋白胞外结构域基因克隆的琼脂糖凝胶电泳图。

图2：hPD-1蛋白胞外结构域蛋白表达鉴定的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图3：hPD-1单抗的免疫组化特异性检测图。

图4：hPD-1单抗检测PD-1蛋白的WB结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细的描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

除非另有其他明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并非排除其他元件或其他组成部分。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

具体采用如下步骤：

1）首先获取抗原hPD-1蛋白：本发明选取hPD-1蛋白的胞外结构域作为抗原，其碱基数约为400 bp，蛋白分子量约为18 kDa。利用引物设计软件Primer premier 5.0设计hPD-1蛋白的胞外结构域的上游引物：5’ TGAATTCCATATGCCCCCCACCTTCTCCCCAG3’ （酶切位点，Nde I）和下游引物：5’ GTACTCGAG TTCTGCCCTTCTCTCTGTCACC3’（酶切位点，Xho I），利用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增获得大量hPD-1蛋白的胞外结构域的基因，分别对该目的基因与载体pET-22b进行双酶切，然后利用T4-DNA连接酶进行连接，获得重组质粒pET-22b-hPD-1，送至基因测序。将测序正确的重组质粒pET-22b-hPD-1转化至宿主菌BL21（DE3）中，挑取阳性单克隆菌落，接种于35 mg/L氨苄抗性LB培养基的10 mL试管中，37 ℃，220 rpm/min 培养过夜；将10 mL过夜培养物接种于含有35 mg/L氨苄抗性的1 L LB培养基的三角瓶中，37℃，230rpm/min 培养至菌液OD值达到0.8-1.0，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.5 mM，37 ℃，190 rpm/min 培养16 h，进行蛋白表达。收集菌体，重悬于50 mL PBS中（含1mM EDTA，0.1mM PMSF），超声破碎，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定，结果表明： hPD-1蛋白的胞外结构域以包涵体的形式表达。将hPD-1蛋白的包涵体溶于含有8M尿素的PBS缓冲液中，进行Ni柱纯化。将含有高纯度的hPD-1蛋白的Ni柱洗脱液利用复性缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，400 mM L-Arghydrochloride，2 mM EDTA，5 mM Cystamine，0.5 mM Cysteamine）进行复性，获得空间折叠正确、构象均一的抗原。最后再利用AKTA纯化系统的G75柱进一步对hPD-1蛋白进行纯化，获得高纯度，构象均一性的抗原蛋白。

2）用生理盐水将步骤1）获得的hPD-1蛋白稀释至1 mg/mL，然后与等体积的完全弗氏佐剂（IFC）混合，利用乳化器将混合物乳化至滴水不化；选取6~8周龄的Balb/c小鼠进行腹部多点注射免疫，每只小鼠注射剂量为：100 μg。

3）重复步骤2）所述，加强免疫两次：第15天，每只小鼠注射剂量为：50 μg；第29天，每只小鼠注射剂量为：50 μg。

4）第三次注射2周后，尾部取血并测定血清效价；利用ELISA检测Balb/c小鼠血清中的抗体效价，以空白对照组血清为阴性对照，PBS为空白对照；效价高于100,000时，表明抗体具有足够的抗体滴度和亲和力，取该Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，制备杂交瘤细胞。

5）融合2周左右，利用ELISA法对杂交瘤细胞的抗体进行检测和筛选，以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性对照，包被抗原为hPD-1蛋白；最终获得分泌hPD-1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。

6）对于5）步骤获得的杂交瘤细胞进行2~3次的克隆化筛选和培养；每次克隆化培养约7-10天，在倒置显微镜下观察细胞，标出肉眼可见的只有单个克隆生长的孔，进行抗体检测；将检测结果为阳性细胞再次扩大培养，直至100%孔分泌hPD-1单克隆抗体，建系保存该杂交瘤细胞株。

7）小鼠腹水法制备单抗：首先每只F1小鼠腹腔注射0.3 mL弗氏不完全佐剂；7天后每只F1小鼠腹腔注射1×10⁶/0.2 mL的细胞量的PBS稀释的步骤6）克隆化培养、筛选获得的杂交瘤细胞；7天后开始观察F1小鼠，若观察到小鼠腹部明显膨大，则可采集其腹水；先将腹水低速离心以除去细胞等杂质，收集上清后再采用高速离心以除去细小颗粒。

8）将2g左右的Protein A填料与10 mL pH 7.0的Tris缓冲液混合，倒入层析柱，静置5-10 min，使得填料自然沉降，得到无气泡的Protein A填料柱；加入10倍柱体积的pH 7.0的Tris缓冲液，并以合适的流速冲洗柱子；将步骤7）获得的高浓度hPD-1单抗与pH 7.0的Tris缓冲液按照体积比1:2混合后，用0.45 μm滤膜过滤后，倒入层析柱中进行亲和层析纯化，利用10倍柱体积的pH 7.0的Tris缓冲液进行洗脱非特异性吸附的杂质，然后利用洗脱液（pH 4.5 0.1 M柠檬酸溶液加pH 8.0的中和液）洗脱hPD-1单体，用PBS将洗脱液透析三次，最后利用超滤浓缩管浓缩抗体溶液，获得高纯度、高浓度的hPD-1单克隆抗体。

9）hPD-1单克隆抗体的特异性检测：利用免疫组化技术进行检测，选取hPD-1的阳性组织切片进行脱蜡和水化处理，之后封闭内源性过氧化物酶和非特异性抗原。接着加一抗、二抗，最后DAB显色和核染。本发明所述的hPD-1单克隆抗体具有很好的膜定位、特异性很强、能够很好的检测hPD-1阳性组织（如图3）。

10）hPD-1单克隆抗体亚型测定：利用鼠源单克隆抗体亚型鉴定试剂盒采用ELISA检测法对Balb/c小鼠和F1小鼠腹水纯化的hPD-1单克隆抗体进行亚型鉴定，结果表明：hPD-1单克隆抗体属于IgG2a亚类，其轻链为K链。

11）利用PCR技术对制备的单克隆抗体的重链可变区进行基因测序。

表1 ELISA检测Balb/c小鼠血清中的抗体效价表

注释：1111：>1.5; 1111:0.95-1.5

取效价达到要求的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，融合后两周，进行ELISA检测，ELISA步骤和结果如下图：

（1）包被：用包被缓冲液将本发明制备的PD-1蛋白稀释至1 μg/mL，然后包被聚苯乙烯板的反应孔，100 μL/孔，4 ℃过夜。

（2）洗涤：弃去孔内的包被液，用洗涤缓冲液孔洗涤3次反应孔，3×3 min（以下简称洗涤）。

（3）封闭：每孔加入200 μL的封闭液，37 ℃封闭2 h；尽量弃尽封闭液。

（4）加一抗：每孔加入稀释5倍细胞培养上清，37 ℃下孵育1 h；孵育完毕后弃尽一抗，充分洗涤后甩干。

（5）加二抗：每孔加入100 μL用稀释液稀释至一定浓度的HRP-羊抗小鼠IgG二抗，37 ℃下孵育30 min；孵育完毕后弃尽酶标二抗，洗涤，甩干。

（6）显色：每孔加入100 μL底物TMB，37 ℃避光反应15 min；每孔加入100 mL的终止液以终止显色反应。测定450 nm的吸光度值（A₄₅₀）。

实验结果分析：从ELISA结果中可以看出阴性的结果（NC）只有0.0738，阳性结果（PC）为OVER。表中标记的是抗体效价较高的融合细胞株，分别是：A9、B4、C3、D6、H10;这5株细胞株是对PD-1特异性较强、产生抗PD-1抗体较多的细胞株。将这5株细胞株进行进一步的克隆化培养，直至获得特异性更强、100%分泌单克隆抗体的融合细胞株。

表2 hPD-1单抗亚型的ELISA结果

实验结果分析：从抗体亚型鉴定的ELISA结果表中可以看出IgG2A的结果全为OVER，所以本次发明的抗体重链为IgG2A；轻链结果κ链的结果明显高于λ链，而且据文献描述95%的老鼠抗体均为κ链，所以可以判定本次发明的抗体轻链为λ链。

实施例2

利用Western-Blot技术检测PD-1蛋白，具体操作步骤如下：

1）对含有PD-1蛋白的生物样品，利用15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分离，电泳结束后取下PAGE胶，与PVDF膜做成“三明治”形状，用湿转法进行转膜。

2）电转完毕，取下PVDF膜，加入5% BSA-TBST(蛋白面朝下），于37 ˚C 摇床摇荡（65 rpm）封闭1 h ，以消除非特异性背景。

3）封闭结束后用TBST洗掉5% BSA-TBST，加入一抗：本发明制备的hPD-1的单克隆抗体，于脱色摇床摇荡孵育（60 rpm）1 h或者4 ˚C 孵育过夜（12-16 h），使一抗与特异蛋白结合。

4）回收一抗，用TBST在摇床中洗4次（60 rpm），洗脱时间分别为5 min、10 min、15 min、20 min。

5）加入二抗，于脱色摇床孵育（60 rpm）1 h，使二抗与一抗充分结合。

6）回收二抗，用TBST在摇床中洗4次（60 rpm），洗脱时间分别为5 min、10 min、15 min、20 min。

7）用ECL显色试剂盒（200 μl试剂A/张+200 μl试剂B/张）孵育3 min。去掉反应液，转移到保鲜膜上，压片显影定影。定影后自然干燥，佳能相机拍照，记录实验结果（如附图4）。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明作的进一步详细说明、不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明、对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说、在不脱离本发明构思的前提下、还可以做出若干简单推演或替换、都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种人源程序性死亡受体hPD-1单克隆抗体

<130> 6

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 261

<212> DNA

<213> 重链可变区碱基序列

<400> 1

ctctcctgtg cagcctctgg attcactttc agtagctatg ccatgtcttg ggttcgccag 60

actccggaaa agaggctgga gtgggtcgca accattggta gtggtggtgg ttacacctac 120

tatccagaca ctgtgaaggg tcgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaccctg 180

tacctgcaaa tgagcagtct gaggtctgag gacacggcca tgtattattg tgtaagacag 240

tgggattacg acgggggtta c 261

<210> 2

<211> 79

<212> PRT

<213> 重链可变区氨基酸序列

<400> 2

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser

1 5 10 15

Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile

20 25 30

Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg

35 40 45

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met

50 55 60

Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg

65 70 75

<210> 3

<211> 267

<212> DNA

<213> 轻链可变区碱基序列

<400> 3

agtcgtctgg agtcagcctc catctcttgc agatctagtc agagcattgt acatagtgat 60

ggaaacacct atttagaatg gtacctgcag aaaccaggcc agtctccaaa gctcctgatc 120

tacaaagttt ccaatcgatt ttctggggtc ccagacaggc tcagtggcag tggatcaggg 180

acagatttca cactcaagat cagcagagtg gaggctgagg atctgggagt ttattactgc 240

tttcaaggtt cacatgttcc tccgacg 267

<210> 4

<211> 88

<212> PRT

<213> 轻链可变区氨基酸序列

<400> 4

Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile

1 5 10 15

Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro

20 25 30

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

35 40 45

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

50 55 60

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys

65 70 75 80

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Pro

85

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgaattccat atgcccccca ccttctcccc ag 32

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtactcgagt tctgcccttc tctctgtcac c 31