一种人源程序性死亡受体hPD‑1单克隆抗体的制作方法

文档序号:12399468阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种人源程序性死亡受体hPD-1单克隆抗体,其特征在于:所述抗体包括轻链可变区和重链可变区,所述的重链可变区碱基序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-2所示,轻链可变区的碱基序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3-4所示。

2.根据权利要求1所述的抗体,其特征在于:所述抗体为如下1)或2)所示的蛋白质:

1)重链与轻链可变区由SEQ ID NO.1-4所示的碱基序列或氨基酸序列组成的蛋白质;

2)将SEQ ID NO.1-4所示的轻链和/或重链可变区的碱基序列或氨基酸序列经过一个或几个碱基/氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质的轻链和/或重链可变区。

3.权利要求1-2中任一所述抗体的轻链和/或重链可变区编码DNA分子。

4.根据权利要求3所述的编码DNA分子,其特征在于:所述编码DNA分子为如下1)-3)中任一所述的DNA分子:

1)其轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列所示;

2)与SEQ ID NO.1-4中序列限定的DNA分子杂交且编码权利要求1-2中任一所述抗体的DNA分子;

3)与1)的DNA分子具有90%以上的同源性且编码权利要求1-2中任一所述的抗体的DNA分子。

5.含有权利要求1-2中任一所述的单克隆抗体的重组表达载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌。

6.权利要求1-2中任一所述的抗体在如下a)-c)中任一种中的应用:

a) 制备利用免疫组化技术检测肿瘤组织中PD-1的产品;

b) 制备特异性结合人源程序性死亡受体PD-1的产品。

7.一种如权利要求1所述的人源程序性死亡受体PD-1单克隆抗体的制备方法,其特征在于:利用人源的PD-1蛋白作为抗原,然后免疫Balb/c小鼠获得单克隆抗体。

8.根据权利要求7所述的人源程序性死亡受体PD-1单克隆抗体的制备方法,其特征在于:具体包括如下步骤:

1)利用分子克隆的方法构建hPD-1胞外段的重组质粒,转化至宿主菌BL21中进行蛋白表达,纯化后,获得高纯度、构象均一的hPD-1蛋白;

2)将制备好的hPD-1抗原注射至Balb/c小鼠体内;

3)重复步骤2)再将强免疫2次后,采血,利用ELISA技术检测血清中抗体效价;

4)取效价高于100,000的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,制备杂交瘤细胞;

5)对分泌hPD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞进行2~3次的克隆化培养;

6)将步骤5)获得的克隆化培养的杂交瘤细胞接种于Balb/c小鼠腹腔内,获得PD-1蛋白单克隆抗体浓度很高的腹水单抗;

7)利用Protein A亲和层析柱对腹水单抗进行纯化;

8)特异性检测:利用免疫组化技术对获得的抗体的特异性进行检测;

9)利用PCR技术对制备的单克隆抗体的重链可变区进行基因测序。

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