本发明属于体外细胞培养
技术领域：
，涉及一种昆虫细胞培养基。
背景技术：
：细胞培养是将细胞在体外进行繁殖和培养，该工作始于20世纪初，现在已经成为生物学和医学研究领域中不可缺少的工具，并发展成为重要的基础科学之一。在最近10年里，无脊椎动物细胞和组织培养在细胞和分子生物学基础研究中发挥了越来越重要的作用，应用杆状病毒表达载体，昆虫培养细胞作为宿主的真核表达系统已被广泛应用于生产外源蛋白质，特别是成功表达了大量的具有很高医药价值的活性蛋白质之后，备受人们青睐。近年来，无血清细胞培养技术发展迅速，已报导有多种细胞株系在相应的无血清培养基中生长和增殖获得成功，Sigma－Aldrich公司开发出适用于Sf9和Sf21细胞系长期培养的420和TiterHighTMMedium且都是完全培养基，使用时无需添加其他成分，而其生产的EX-CELLTM405和Hyclone的HyQSFX－Insect则更适于HighFive细胞系的长期培养。中国专利CN101988047B公布了一种低成本的昆虫细胞无血清培养基，所述无血清培养基包含5～10g/L碳水化合物、40～60g/L氨基酸、50～100g/L无机盐、0.01～0.1g/L维生素、12-20g/L的酵母提取物以及20-40ml/L的化学限定脂质混合物，该发明的培养基较目前的商用无血清培养基具有更低的成本。尽管目前已有诸多商品化昆虫无血清培养基，但是细胞在无血清培养基中从几代到十几代不等，都会逐渐出现衰退、老化或死亡等现象，因而每种无血清培养基都有各自的特点和局限性，还需进一步优化完善。技术实现要素：本发明的一个目的在于提供克服现有技术的缺陷，提供一种具有适应多种细胞长时间生长的细胞培养基，同时培养基可以以较低成本获得。本发明通过以下技术方案实现：一种昆虫细胞培养基，所述昆虫细胞培养基包含：碳水化合物20-50g/L，氨基酸10-30g/L，无机盐20-45g/L，维生素0.12-1g/L，酵母提取物10-30g/L，水解乳蛋白3-10g/L，胆固醇1-20mL/L，亚油酸1-10mL/L，苹果酸0.4-1.8g/L，延胡索酸0.1-0.8g/L，大豆磷脂0.1-20g/L，谷氨酰胺0.1-1g/L，腐胺0.1-10g/L和甘油0.1-1g/L；所述氨基酸包括：精氨酸1.32-5.36g/L，亮氨酸1.0-2.56g/L，异亮氨酸0.1-2.42g/L，天冬氨酸2.45-4.27g/L，谷氨酸0.29-125g/L，赖氨酸0.1-3.67g/L，苏氨酸0.46-164g/L，脯氨酸0.19-0.95，甘氨酸0.02-0.65g/L，苯丙氨酸1.38-5.35g/L和蛋氨酸1.38-6.69g/L；所述维生素包括：尼克酰胺0.10-0.58mg/L，吡哆醇0.25-1.38mg/L，泛酸0.23-2.41mg/L，生物素0.35-0.78mg/L和核黄素0.1-0.56mg/L；所述无机盐包括：氯化铝0.5-1.3g/L，氯化钠2.6-5.2g/L，氯化钾0.3-0.8g/L，硫酸锌0.1-0.36g/L和碳酸氢钠0.25-0.35g/L。优选地，所述碳水化合物包括葡萄糖、果糖、麦芽糖和乳糖一种或两种以上。优选地，所述昆虫细胞培养基由以下成分组成：果糖33g/L，酵母提取物15g/L，水解乳蛋白8g/L，胆固醇13mL/L，亚油酸7mL/L，苹果酸1.69g/L，延胡索酸0.63g/L，大豆磷脂16g/L，谷氨酰胺0.8g/L，腐胺1.6g/L，甘油0.7g/L，精氨酸2.46g/L，亮氨酸1.35g/L，异亮氨酸1.78g/L，天冬氨酸3.56g/L，谷氨酸0.97g/L，赖氨酸2.98g/L，苏氨酸1.03g/L，脯氨酸0.83g/L，甘氨酸0.54g/L，苯丙氨酸4.63g/L，蛋氨酸3.21g/L，尼克酰胺0.44mg/L，吡哆醇0.89mg/L，泛酸1.03mg/L，生物素0.52mg/L，核黄素0.39mg/L，氯化铝0.87g/L，氯化钠3.68g/L，氯化钾0.56g/L，硫酸锌0.27g/L，碳酸氢钠0.28g/L。本发明培养基中，碳水化合物为昆虫生长提供了充足的能源，所选氨基酸种类不仅能够满足昆虫细胞长期生长代谢所需，并且合理分配各氨基酸添加量，有利于促进细胞的生长和功能蛋白的表达。所选无机盐，满足了昆虫细胞生长所需的较高渗透压，各无机盐成分相互作用，可以使细胞培养基中pH保持稳定。酵母提取物，水解蛋白为细胞提供氨基酸、多肽等营养物质，胆固醇、亚油酸和大豆磷脂复合后主要提供细胞生长所需的脂类物质。腐胺除了能够维持培养基pH之外，还能促进细胞的代谢。甘油作为一种多聚物保护剂，能够保护细胞免受剪切力损伤和降低细胞结团。本发明昆虫细胞培养基制备方法并不是关键性的。例如，培养基可以通过下面所述方法制得，即将所有成分及附加物先以各自的合适浓度溶解于水，然后加压使溶液通过一个薄膜滤器过滤而制得无菌的培养基。本发明昆虫细胞培养基组成成分中，本发明所用均购于sigma公司。本发明昆虫细胞培养基，各成分搭配科学，能够有效延长昆虫细胞的生存时间，有利于细胞在长时间的不更换培养基的条件下，仍能拥有充足的营养，保持代谢平衡；此外本培养基所含成分种类少，配制简单，成本低。本发明与现有技术相比，本发明具有以下技术优点：1.本发明昆虫细胞培养基能够维持昆虫细胞较长时间的高活力生存，有效改善现有昆虫细胞在无血清培养中逐渐出现的衰退、老化或死亡等现象。2.本发明昆虫细胞培养基所含成分种类少，配制简单，成本低。附图说明图1：HighFive细胞在不同培养基上的生长曲线；A，HighFive细胞在对比例1培养基中生长曲线；B，HighFive细胞在实施例1培养基中生长曲线；C，HighFive细胞在实施例2培养基中生长曲线；D：HighFive细胞在实施例3培养基中生长曲线。具体实施例以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此。实施例1一种昆虫细胞培养基由以下成分及份数组成：麦芽糖20g/L、酵母提取物10g/L、水解乳蛋白3g/L，胆固醇1ml/L，亚油酸1ml/L，苹果酸0.4g/L，延胡索酸0.1g/L，大豆磷脂0.1g/L，谷氨酰胺0.1g/L，腐胺0.1g/L和甘油0.1g/L。氨基酸组成，如下表1所示：表1培养基中氨基酸组成精氨酸1.32g/L亮氨酸1.0g/L异亮氨酸0.1g/L天冬氨酸2.45g/L谷氨酸0.29g/L赖氨酸0.1g/L苏氨酸0.46g/L脯氨酸0.19-0.95g/L甘氨酸0.02g/L苯丙氨酸1.38g/L蛋氨酸1.38g/L维生素组成，如表2所示：表2培养基中维生素组成尼克酰胺0.10mg/L吡哆醇0.25mg/L泛酸0.23mg/L生物素0.35mg/L核黄素0.1-0.56mg/L无机盐组成，如表3所示：表3培养基中无机盐组成氯化铝0.5g/L氯化钠2.6g/L氯化钾0.3g/L硫酸锌0.1g/L碳酸氢钠0.25g/L实施例2一种昆虫细胞培养基由以下成分及份数组成：葡萄糖50g/L、酵母提取物30g/L、水解乳蛋白10g/L，胆固醇20ml/L，亚油酸1ml/L，苹果酸1.8g/L，延胡索酸0.8g/L，大豆磷脂0.1g/L，谷氨酰胺0.1g/L，腐胺0.1g/L和甘油0.1g/L。氨基酸组成，如下表4所示：表4培养基中氨基酸组成精氨酸5.36g/L亮氨酸2.56g/L异亮氨酸2.42g/L天冬氨酸4.27g/L谷氨酸1.25g/L赖氨酸3.67g/L苏氨酸1.64g/L脯氨酸0.95g/L甘氨酸0.65g/L苯丙氨酸5.35g/L蛋氨酸6.69g/L维生素组成，如表5所示：表5培养基中维生素组成尼克酰胺0.58mg/L吡哆醇1.38mg/L泛酸2.41mg/L生物素0.78mg/L核黄素0.56mg/L无机盐组成，如表6所示：表6培养基中无机盐组成实施例3一种昆虫细胞培养基由以下成分及份数组成：果糖33g/L、酵母提取物15g/L、水解乳蛋白8g/L，胆固醇13ml/，亚油酸7ml/L，苹果酸1.69g/L，延胡索酸0.63g/L，大豆磷脂16g/L，谷氨酰胺0.8g/L，腐胺1.6g/L和甘油0.7g/L。氨基酸组成，如下表7所示：表7培养基中氨基酸组成精氨酸2.46g/L亮氨酸1.35g/L异亮氨酸1.78g/L天冬氨酸3.56g/L谷氨酸0.97g/L赖氨酸2.98g/L苏氨酸1.03g/L脯氨酸0.83g/L甘氨酸0.54g/L苯丙氨酸4.63g/L蛋氨酸3.21g/L维生素组成，如表8所示：表8培养基中维生素组成尼克酰胺0.44mg/L吡哆醇0.89mg/L泛酸1.03mg/L生物素0.52mg/L核黄素0.39mg/L无机盐组成，如表9所示：表9培养基中无机盐组成氯化铝0.87g/L氯化钠3.68g/L氯化钾0.56g/L硫酸锌0.27g/L碳酸氢钠0.28g/L对比例1一种昆虫细胞培养基由以下成分及份数组成：果糖33g/L、酵母提取物15g/L、水解乳蛋白8g/L，胆固醇13ml/，亚油酸7ml/L，硫酸锌0.27g/L，苹果酸2.32g/L，大豆磷脂16g/L，谷氨酰胺0.8g/L，腐胺1.6g/L和甘油0.7g/L。氨基酸组成，如下表10所示：表10培养基中氨基酸组成精氨酸2.46g/L亮氨酸1.35g/L异亮氨酸1.78g/L天冬氨酸3.56g/L谷氨酸0.97g/L赖氨酸2.98g/L苏氨酸1.03g/L脯氨酸0.83g/L甘氨酸0.54g/L苯丙氨酸4.63g/L蛋氨酸3.21g/L维生素组成，如表11所示：表11培养基中维生素组成无机盐组成，如表12所示：表12培养基中无机盐组成氯化铝0.87g/L氯化钠3.68g/L氯化钾0.56g/L碳酸氢钠0.28g/L与实施例3的区别在于没有添加延胡索酸，而增加了苹果酸的用量。试验例1、细胞生长曲线的测定1.试验对象：实施例1-3和对比例1制备得到的培养基2.试验方法：将HighFive细胞均培养于27℃生化培养箱中，细胞分为四组，分别对应实施例1、2、3及对比例1制得的培养基。利MTT法测定细胞生长曲线：(1)制备1mL细胞悬液。空白对照以1mL培养基代替细胞悬液。加入0.1mLMTT于37℃孵育4h，使MTT还原为蓝紫色甲月赞结晶。(2)加1mLDTW脱色液，37℃至少静置30min(甚至过液)，使甲质颗粒充分溶解。(3)吸取200μL该溶解液至96孔板孔中，在酶标仪上读取OD值，检测波长570nm，参考波长630nm。(4)每隔24h测量一个点，每个点为3个平行样品的平均值。3.试验结果：HighFive细胞生长曲线测定结果如图1所示，由生长曲线可以看出，HighFive细胞在实施例培养基中达到平顶期的时间均比对比例1短，平顶期最大细胞密度均高于对比例1，并且稳定期比对比例1培养基中培养的细胞平顶期长，因此本发明培养基比商业化的培养基更有利于昆虫细胞的生长，并且能够延长细胞的生长。本发明未详细阐述部分属于本领域公知技术。尽管前述的发明通过说明和实施例为阐明和理解目的已经相当详细地作了描述，但是很显然在所附的权利要求书的范围内仍然会有某些改变和更改。例如，在实施例一中提出的单独成分的相对量可由本领域的技术人员依照感兴趣的特定细胞系的特定需要而作修改，该需要对本领域的技术人员而言是熟知且易于利用的。通常，在实施例一中列举的特定的量可以在高约50％的范围内变动，更优选地，是在高约20％的范围内。当前第1页1 2 3