技术领域：
本发明涉及生物化学
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，具体涉及一种台湾乳白蚁内源性β-葡萄糖苷酶的编码基因、该基因编码的蛋白质、相应的表达载体和应用。技术背景能源短缺是全球面临的严重问题，然而在混合燃料中所使用的绝大部分乙醇源于谷物发酵，存在与人争粮的问题。木质纤维素是地球上最丰富的可再生生物质资源（园林绿化垃圾、谷物秸秆、杂草、木屑及一些动物的固体粪便等），如果用纤维素酶生物降解木质纤维素产生还原糖，再进一步发酵产生乙醇，不仅提供了大量纤维素乙醇燃料，并且有助于生态环境的保护（邓天福等，2010）。此外，纤维素酶在食品、纺织、饲料、洗涤剂和中草药提取等行业或领域都有应用的广泛：提高食品的品质、缩短酒精、酱油发酵时间、提高果汁提取率和促进汁液澄清（闫训友等，2004）；纤维素酶作为饲料添加剂，可明显提高饲料的营养价值，强化消化系统的酶解功能，促进动物生长发育（胡轶和孙波，2006）；改善纺织工业棉织物的手感和外观，并且基本解决了石磨水洗工艺中存在的环境污染等问题（吴大付等，2007）。纤维素是由D-葡萄糖以β-1,4糖苷键组成的多聚糖，包括内切葡聚糖酶（endo-β-1,4-glucanases,EGs,EC3.2.1.4）、外切葡聚糖酶（exo-β-1,4-glucanases,C1）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidases,BGs,EC3.2.1.21）三种主要的类型。外切葡聚糖酶水解纤维素产生纤维二糖和葡萄糖，而多数内切葡聚糖酶作用后产生纤维二糖、少量葡萄糖和纤维三糖，β-葡萄糖苷酶作用于纤维二糖及低分子量的纤维寡糖的非还原端，水解生成葡萄糖（Klesov,1991;Watanabeetal.,2010）。β-葡萄糖苷酶是降解纤维素的关键酶系。目前从自然界中寻找高活性的纤维素酶，进行生物降解是解决纤维素酶效率和降低成本的有效途径。一些植食性昆虫特别是木食性昆虫（xylophagousinsects）能通过纤维素酶高效降解纤维素类物质，并满足自身生长发育的需要（WatanabeandTokuda,2001;2010），如食木白蚁、天牛幼虫、木蜂幼虫及鳞翅目幼虫等。其中，白蚁（等翅目Isoptera，现有证据支持其并入蜚蠊目Blattodea）是消化纤维素最有效的昆虫类群，被认为是地球上最小的高效生物反应器（Ohkuma,2003），每年消化的纤维素类物质总量巨大。台湾乳白蚁（CoptotermesformosanusShiraki）属鼻白蚁科（Rhinotermitidae）、乳白蚁属（Coptotermes），对农林树木、建筑结构造成严重危害（Lin,1987；RustandSu,2012），对纤维素类物质具有很高的降解效率。台湾乳白蚁体内具有丰富纤维素酶及其基因，目前多个台湾乳白蚁内源性纤维素酶基因已经克隆得到全长cDNA序列，其中EG酶有包括CfEG1、CfEG1b、CfEG2、CfEG3、CfEG3a、CfEG3b、CfEG4、CfEG5在内的八个同源基因（Nakashimaetal.,2002b;Zhangetal.,2009;Zhangetal.,2011），而β-葡萄糖苷酶基因仅有Glu1A、Glu1B、Glu1C、Glu1D四个同源基因（Zhangetal.,2010;Zhangetal.,2012a）。目前用纤维素酶降解纤维素的工艺中，困难在于纤维素酶效率低，对环境条件要求苛刻，而且成本高，从白蚁体内挖掘新的纤维素酶基因加以利用，是解决这一问题的有效途径之一。此外纤维素酶基因作为白蚁防治药物靶标，也是未来白蚁生物防治的发展方向。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种在不同温度下相对稳定表达的β-葡萄糖苷酶的编码基因。本发明另一目的在于提供上述编码基因编码的蛋白质。本发明还有一个目的在于提供上述编码基因的原核表达载体。本发明还有一个目的在于提供上述编码基因的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：一种台湾乳白蚁内源性β-葡萄糖苷酶的编码基因，其序列如SEQIDNO:1所示。上述台湾乳白蚁内源性β-葡萄糖苷酶的编码基因所编码的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。一种原核表达载体，用于表达台湾乳白蚁内源性β-葡萄糖苷酶的编码基因。本发明所述台湾乳白蚁内源性β-葡萄糖苷酶的编码基因对温度敏感性低，经实验证实，低温与高温胁迫不会影响该基因的表达。本发明所述台湾乳白蚁内源性β-葡萄糖苷酶的编码基因对农药胁迫作出响应，经试验证实，台湾乳白蚁取食吡虫啉后该基因表达第三天开始作出明显响应，第四天该基因表达量显著上调。该基因可用于研究白蚁纤维素酶基因表达调控机理；该基因编码的β-葡萄糖苷酶可用于纤维素降解；该基因及其表达酶类可用于纤维素乙醇燃料、食品与饲料工业的开发应用；该基因及其表达酶类可用作为白蚁防治的靶标。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供了一种新的β-葡萄糖苷酶的编码基因、引物及载体。可用于纤维素的降解、纤维素乙醇燃料、食品与饲料工业的开发应用，所述β-葡萄糖苷酶的编码基因及其表达酶类可用作为白蚁防治的靶标。附图说明图1为基因CfBG-Ib的3’RACE和5’RACEPCR结果（M为D2000DNAMaker，1为基因的5’RACEPCR扩增结果，2为基因的3’RACEPCR扩增结果）。图2为基因CfBG-Ib编码的氨基酸序列信号肽预测。图3为CfBG-Ib的三维结构（注：基于模板构建的CfBG-Ib蛋白的三维结构，模板覆盖84%的氨基酸，可信度大于90%）。图4为重组蛋白的原核表达（1、2、4是诱导的pET-32a-CfBG-Ib的原核表达，3是未诱导的pET-32a-CfBG-Ib的原核表达）。图5为温度胁迫处理24h后CfBG-Ib基因表达水平（所有数据为平均值±标准差，不同字母表示差异显著（P<0.05））。图6为温度胁迫处理24h后Glu1B基因表达水平（所有数据为平均值±标准差，不同字母表示差异显著（P<0.05））。图7为吡虫啉处理后CfBG-Ib基因表达水平（所有数据为平均值±标准差，不同字母表示差异显著（P<0.05））。图8为吡虫啉处理后Glu1B基因表达水平（所有数据为平均值±标准差，不同字母表示差异显著（P<0.05））。具体实施方式下面结合实施例，对本发明做进一步阐述。但实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。实施例11.白蚁总RNA的提取台湾乳白蚁总RNA的提取按照TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit（TaKaRa公司）使用说明进行。2.第一链cDNA合成第一链cDNA的合成使用PrimeScriptTMII1stStrandcDNASynthesisKit（TaKaRa）。3.简并引物设计采用CODEHOP（ConsensusDegenerateHybridOligonuleotidePrimers）在线软件程序设计β-葡萄糖苷酶的简并引物，可以得到数对由有简并性的核苷酸链组成的简并引物序列（其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/T，H=A/C/T，B=C/G/T，V=A/C/G，D=A/G/T，N=A/C/G/T）。PCR扩增后，取5µl产物在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，检测后剩余的产物用作切胶回收目的DNA片段。PCR产物连接采用pMDTM18-TVectorCloingKit。质粒的转化4.1大肠杆菌感受态细胞的制备：1)从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于3mlLB液体培养基的试管中，37℃摇床培养过夜；2)取0.5ml上述菌液转接到含有50mLLB液体培养基的三角烧瓶中，37℃下250rpm摇床培养2-3h，测定OD550为0.6左右；3)将菌液转移至50ml离心管中，冰上放置10min，然后于4℃，5000rpm离心5min；4)将离心管倒置以倒尽上清液，加入25ml冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min后，4℃，5000rpm离心5min；5)弃上清液后，用2.5ml冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液重悬，每份100μl分装细胞，可以直接用作转化。4.2热击法转化大肠杆菌感受态细胞：1)取两管制备好的100μlDH5α感受态细胞，其中一管加入10μl连接产物，另一管作阴性对照，两管轻轻混匀后冰上放置30min；2)42℃水浴中45s进行热激转化，然后迅速放回冰中，静置3min；3)向上述管中分别加入400μlLB液体培养基轻轻混匀，37℃震荡培养1h；4)在超净工作台中取上述转化混合液100μl，滴到含氨苄青霉素（100ug/ml）的固体LB平板上，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀后，封口膜将培养皿密封；5)在涂好的培养皿上做上标记，37℃倒置过夜培养。转化子筛选及验证5.1菌液PCR鉴定在超净工作台中挑取5个单菌落，分别接种至5mlLB液体培养基（含100μg/ml氨苄青霉素）的10ml摇菌管中，37℃，250rpm摇菌过夜培养，至OD550为0.6左右。取1μl菌液作为cDNA模板，进行PCR鉴定。在PCR管中加入以下体系：组分使用量PremixTaq10μlpMD18T-simpleprimers0.5+0.5μlcDNA模板1μldH2Oupto20μl将上述菌落PCR反应体系混匀，进行PCR扩增后，取5µl产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，经鉴定呈阳性的菌液抽提重组质粒，部分菌液4℃保存备用。质粒酶切鉴定质粒DNA的提取与纯化采用PlasmidMiniKitI（OmegaBio-Tek），具体步骤如下：1)用离心管收集1.5-5ml经菌落PCR鉴定呈阳性的菌液，12000rpm，室温离心1min，弃去上清，收集菌体于1.5ml离心管中；2)加入250μl预冷的SolutionⅠ（已加RNaseA），充分悬浮菌体沉淀；3)加入250μlSolutionⅡ，温和充分地上下颠倒离心管，至液体澄清，室温放置2min；4)加入350μlSolutionⅢ，温和充分地上下颠倒离心管8-9次，至白色沉淀不再形成，12000rpm，室温离心10min；5)把一干净HiBind®DNAMinicolumn置于一2ml收集管中，将上述离心上清液转移至HiBind®DNAMinicolumn中，12000rpm，室温离心1min；6)弃滤液，加入500μlBufferHB，12000rpm，室温离心1min；7)弃滤液，加入750μlWashBuffer（已加无水乙醇），12000rpm，室温离心1min；8)重复操作步骤7；9)弃滤液，12000rpm，室温离心1min；10)将HiBind®DNAMinicolumn置于一新的离心管中，加入50-100μl灭菌去离子水或TEBuffer至Silica膜中央，12000rpm，室温离心1min洗脱质粒DNA。质粒双酶切反应体系如下：组分使用量质粒DNAxμlQuickCutEcoRI1μlQuickCutSalI1μl10×QuickCutGreenBuffer5μldH2Oupto20μl轻轻混匀后瞬时离心，37℃保温15min。酶切产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定。测序鉴定将酶切鉴定呈阳性的菌液送华大基因进行测序，序列去载体拼接后提交至NCBI进行BLAST比对分析。纤维素酶基因全长序列的克隆6.1cDNA文库的构建为了获取白蚁纤维素酶cDNA的全长序列，采用快速扩增cDNA末端（RACE）的方法。应用SMARTer®RACEcDNAAmplificationKit（Clontech公司）构建cDNA全长文库，用作RACEPCR的模板，具体步骤如下：1)在PCR管（A管）中加入以下体系(MixtureB)：组分使用量5×First-StrandBuffer4μlDTT（100mM）0.5μldNTPs（20mM）1μlTotal5.5μl轻轻混匀后瞬时离心，室温放置备用；2)在另一PCR管中加入以下体系（5’-RACE和3’-RACE分开进行）：5’-RACE（B1管）3’-RACE（B2管）5μlRNA5μlRNA1μl5’-CDSPrimerA1μl3’-CDSPrimerA5μlRNasefreedH2O6μlRNasefreedH2OTotal11μlTotal12μl轻轻混匀后瞬时离心；3)将B1管和B2管置于PCR仪上，72℃，3min；42℃，2min，冷却后14000g，离心10s；4)B1管中加入1μlSMARTerIIAOligonucletide；5)配制以下反应体系：5’-RACEcDNA3’-RACEcDNA5.5μlBufferMixfromtubeA5.5μlBufferMixfromtubeA12μlBufferMixfromtubeB112μlBufferMixfromtubeB20.5μlRNaseInhibitor（40U/μl）0.5μlRNaseInhibitor（40U/μl）2.0μlSMARTScribeReverseTranscriptase2.0μlSMARTScribeReverseTranscriptaseTotal20μlTotal20μl轻轻混匀后瞬时离心；6)置于PCR仪上，42℃，90min；70℃，10min；7)加入90μl的Tricine-EDTABuffer稀释上述反应产物RACEcDNA，分装后-20℃保存。6.2基因特异引物的设计将简并引物扩增获得的中间片段序列输入Genbank中，进行序列比对，选出含有纤维素酶基因保守序列的序列，按照SMARTer®RACE5’/3’Kit（Clontech公司）提供的引物设计说明，设计5’-RACE和3’RACE的基因特异引物GSPs和NGSPs。所述5’-RACE和3’RACE的基因特异引物GSPs和NGSPs名称及对应的序列如下表所示：引物名称引物序列（5’-3’）GSP-BG12RGATTACGCCAAGCTTCCACAACGATTTCAGGGACACACAAGCGSP-BG11FGATTACGCCAAGCTTAGCTCGAATTGCACGGCTCTCTCCGSP-BG22RGATTACGCCAAGCTTGCCGATGCCTGGTGACTTGATTGCGSP-BG23FGATTACGCCAAGCTTTCAACGAACCGCTTACTTTCATGGGAGGNGSP-BG11RGATTACGCCAAGCTTGCCAGAACAATGCTGCTTGCTCACGNGSP-BG13FGATTACGCCAAGCTTGCTGAGGCAAATCCCAGTGGTACATCGNGSP-BG21RGATTACGCCAAGCTTCGATGCCCGCCAGGTTCACTTTATTGNGSP-BG22FGATTACGCCAAGCTTAATGTACGCTCACCCCATCTTCAGCACUPMLongTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTUPMShortCTAATACGACTCACTATAGGGC6.3RACEPCR用上述合成的cDNA作为RACEPCR的模板，采用SMARTer®RACE5’/3’Kit（Clontech公司）操作说明进行RACEPCR，具体步骤如下：1)在PCR管（C管）中加入以下体系(MasterMix)：组分使用量PCR-GradeH2O15.5μl2×SeqAmpBuffer25μlSeqAmpDNAPolymerase1μlTotal41.5μl轻轻混匀后瞬时离心，放置备用；2)在PCR管中加入以下体系(MixtureC)：5’-RACE3’-RACE2.5μl5’-RACEcDNA2.5μl3’-RACEcDNA10×UPMLong10×UPMLong5’GSP（10μM）3’GSP（10μM）41.5μlMasterMixfromtubeC41.5μlMasterMixfromtubeCTotal50μlTotal50μl3)将上述PCR反应体系轻轻混匀瞬时离心后，进行PCR扩增。4)如果RACEPCR扩增产物没有明显条带或产物出现弥散条带，则要进行nestedPCR。a.取5μlRACEPCR扩增产物，用245μl的Tricine-EDTABuffer稀释后备用；b.重复步骤1-3，其中，5μl稀释后的RACEPCR扩增产物代替RACEcDNA，UPMShort代替UPMLong，NGSP代替GSP，PCR反应程序设置为：94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸3min，循环20次。基因全长的拼接应用软件Lasergene中的Seqman程序对简并PCR获取的中间片段，以及5’RACE和3’RACEPCR获取的5’和3’末端进行拼接，最终获取纤维素酶基因的cDNA全长序列，并登录至NCBI数据库中。生物信息学分析利用SingalP4.1在线软件预测信号肽序列，用NetOGlyc分析N-连接糖基化位点，用Phyre2预测蛋白质立体模型。从BLAST核酸数据库中选取22条来自β-葡糖苷酶，利用MEGA5.1分析上述24条β-葡糖苷酶氨基酸序列和本研究1条β-葡糖苷酶，CfBG-Ib的氨基酸序列，构建系统发育树。基因的原核表达1原核表达载体的构建1.1特异引物的设计根据克隆得到的β-葡糖苷酶基因CfBG-Ib的cDNA，选取基因的ORF作为原核表达的片段，设计特异性引物。同时根据选取的原核表达载体pET-32a(+)图谱序列，在设计的特异性引物的5’端添加合适的酶切位点SacI和XhoI（下划线标示），以及保护碱基，引物名称及序列如下：引物名称引物序列（5’-3’）Ex-bgFCGAGCTCGTCATGTTAAGTGGAGCAGEx-bgRCCACTCGAGTCATAACGGAATCGTCGG1.2原核表达目的片段的PCR扩增、切胶回收、连接、转化以及测序分析1.3原核表达目的片段及原核表达载体pET-32a(+)的双酶切反应将经测序正确的目的片段和pET-32a(+)空载体分别进行双酶切反应，以得到具有相同粘性末端的片段。双酶切反应体系如下：组分使用量目的基因片段/pET-32a(+)空载体xμlQuickCutSacI1μlQuickCutXhoI1μl10×QuickCutGreenBuffer5μldH2Oupto20μl轻轻混匀后瞬时离心，37℃保温30min。双酶切反应完全后，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，然后切胶回收。连接及阳性重组质粒的筛选将上述切胶回收的具有相同粘性末端的目的片段和pET-32a(+)载体连接，连接体系如下：组分使用量带粘性末端目的基因片段10μl带粘性末端的pET-32a(+)载体4μlT4DNALigase1μl10×T4DNA连接缓冲液2μldH2Oupto20μl轻轻混匀后瞬时离心，16℃连接过夜；再将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用菌液PCR及双酶切反应筛选阳性克隆，并测序，步骤参照2.2.1.3.6。将测序鉴定正确的重组质粒转化至大肠杆菌表达型菌株Rosetta(DE3)感受态细胞中，并筛选阳性单克隆。重组蛋白的诱导表达及细菌总蛋白的提取诱导表达：1）吸取10μl测序验证过的菌液至10mL新鲜的LB液体培养基中（含100μg/ml氨苄青霉素）37℃，250rpm摇菌过夜培养；2）吸取1mL过夜培养的菌液至100mL新鲜的LB液体培养基中（含100μg/ml氨苄青霉素），37℃，250rpm摇菌培养，至OD550为0.6左右；3）向上述菌液中加入IPTG至终浓度为1mM，23℃诱导表达16h；细菌总蛋白的提取：蛋白样品的制备采用细菌蛋白抽提试剂盒提取，具体步骤如下：1）取lml菌液，在4℃，5000×g条件下离心10min，弃上清，收集菌体；2）按照每克菌体沉淀加入20mL细菌蛋白抽提试剂的比例，向菌体沉淀中加入抽提液，充分涡旋至菌体完全重悬；3）重悬后，室温孵育10min；4）15000×g条件下离心5min，转移上清至新的离心管中，即为细菌总蛋白。电泳1）配制12%的分离胶，加入凝胶模具中，然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-5cm的水层，使凝胶表面保持平整，静置45min，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，去除覆盖在分离胶上的水层；2）配制5%的浓缩胶，加至分离胶上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端，将梳子插入凝胶内，避免产生气泡，待凝胶聚合后，小心拔掉梳子；3）取10μl蛋白样品，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水加热变性5min，泠却至室温后，3000rpm的条件下离心30s，取适量上清加入SDS-PAGE凝胶加样孔内；4）接通电源，首先80V电压电泳30min后，使蛋白样品进入浓缩胶，再将电压转成120V恒压电泳直至溴酚蓝到达距离凝胶底端0.5-1cm处即可停止电泳。5）将电泳后的凝胶切除浓缩胶后，放入容器中，加入适量蒸馏水，加热至沸腾后停止；6）弃去蒸馏水，加入适量ProteinShow-G250蛋白快速染色液，加热至沸腾，继续在脱色摇床上摇动5min；7）弃去染色液，加入适量蒸馏水，加热至沸腾后停止，弃去蒸馏水，重复此步骤脱色至背景清晰；结果与分析1.白蚁总RNA的提取按照试剂盒TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit提取台湾乳白蚁总RNA，微量分光光度计检测OD260/OD280的值在1.8-2.2之间，达到了反转录的要求，用于第一链cDNA的合成。β-糖苷酶基因全长序列的克隆利用Multalin序列比对软件，将得到的中间片段与已克隆得到的台湾乳白蚁β-葡糖苷酶基因（GluA，GluB，GluC，GluD）进行核酸序列比对，发现存在显著性差异核酸序列，该β-葡糖苷酶基因中间片段分别长817bp，分别命名为CfBG-Ib。3’RACE和5’RACEPCR（图1）扩增CfBG-Ib的中间片段，得到台湾乳白蚁β-葡糖苷酶基因完整的cDNA，这个cDNA全长由包括多聚腺苷酸尾巴（polyA）的1966个碱基组成。开放阅读框（ORF）起始于第115个碱基，终止于第1806个碱基，长度为1692bp，编码563个氨基酸。利用SingalP4.1软件发现其中有一个预测的26个氨基酸的信号肽序列（图2）。利用http://www.expasy.org/网站的在线工具预测该基因编码的蛋白质分子量为64.02kDa，等电点为6.41。β-葡糖苷酶的序列分析根据蛋白序列，结合其它已知物种的β-葡糖苷酶三维结构，推测CfBG-Ib三维结构图（图3）。三维结构图显示CfBG-Ib具有糖基水解酶家族1的典型结构，8个（β/α）结构围成的桶状结构，2个催化活性中心：亲核中心（nucleophilicresidue）Glu244和酸碱催化中心（acid/baseresidue）Glu453，2个顺式肽键（cis-peptidebond）：Ala259-Pro260和Trp495-Ser496。基于BLAST搜索（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）蛋白查找表明CfBG-Ib编码蛋白属于糖苷水解酶家族1（GHF1），同时存在相应的催化位点和底物结合位点。同源性分析同样显示基因CfBG-Ib属于GHF1家族。β-糖苷酶基因的原核表达1.重组原核表达载体pET-32a-CfBG-Ib的构建经过PCR扩增，回收目的片段及pET-32a空载体的双酶切反应，带有相同粘性末端的目的片段及载体的连接，重组质粒的转化等一系列反应后，通过菌液PCR验证，扩增的PCR片段大小符合预期的大小。测序结果显示重组原核表达载体中的目的基因片段与CfBG-Ib基因ORF核酸序列一致，并且预测的蛋白序列也一致，没有发生突变和读码框移码的现象。因此，重组原核表达载体pET-32a-CfBG-Ib构建成功，可以用于进一步的重组蛋白的诱导表达。重组原核表达载体pET-32a-CfBG-Ib的诱导表达转化重组表达载体后的大肠杆菌Rosetta2(DE3)经1mMIPTG诱导后，CfBG-Ibβ-葡萄糖苷酶基因实现表达。10%SDS-PAGE电泳检测，不同于转化了空载体pET-32a的对照组细菌总蛋白，转化了重组原核表达载体pET-32a-CfBG-Ib的细菌细胞总蛋白显示出一条明显的条带，相对分子质量约82kD的融合蛋白（图4）。而预测的β-葡糖苷酶基因CfBG-Ib编码蛋白的分子质量为64.02kDa，是由于空载体pET-32a上带有分子量约为18kD的Trx-tag、S-tag和His-tag三个融合表达标签。实施例2逆境胁迫下β-葡萄糖苷酶基因表达差异1温度处理取台湾乳白蚁工蚁设置4℃、27℃、38℃三个温度梯度的温度胁迫处理，于相对湿度75%人工气候箱中培养24h。药剂处理供试白蚁的饥饿处理：取直径为150mm的玻璃培养皿，放入台湾乳白蚁工蚁120头，兵蚁10头，放入温度27℃，相对湿度75%的人工气候箱中饥饿培养24h。吡虫啉不同时间处理：取2×2cm的滤纸片，分别用60μL的丙酮和浓度为0.1mg/L的吡虫啉浸湿，室温下放置一天，使丙酮充分挥发。取直径为90mm的玻璃培养皿，每组放入丙酮充分挥发后的滤纸2片，每组放入饥饿处理后白蚁，于温度27℃，相对湿度75%的人工气候箱中培养4d，每处理24h，取10头工蚁提取RNA。荧光定量PCR3.1白蚁总RNA的提取提取各逆境胁迫处理组和对照的白蚁总RNA。第一链cDNA合成第一链cDNA的合成使用PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa），具体步骤如下：1）基因组DNA的去除在PCR管中加入以下体系（MixtureD）：组分使用量TotalRNAxμl5×gDNAEraserBuffer2μlgDNAEraser1μlRNasefreedH2Oupto10μlx根据所测TotalRNA的浓度计算，使用量在1μg以下。42℃反应5min后，4℃保存备用。2）反转录反应将以下试剂加入上述体系MixtureD中：组分使用量MixtureD10μl5×PrimeScriptBuffer4μlPrimeScriptRTEnzymeMixI1μlRTPrimerMix1μlRNasefreedH2Oupto20μl缓慢摇匀，37℃下反应15min后，85℃终止反应5s。反应产物即第一链cDNA，短时离心后存放于-20℃下，用于qPCR反应。稀释度的确定有效的定量PCR结果其进入平台期的Ct值最好在15-30之间。采用序列稀释方法稀释cDNA，以便其Ct值落在15-30之间。稀释的浓度梯度为1，1/10，1/100，1/1000，1/10000，五个浓度梯度。定量PCR引物的设计通过上述胁迫处理，用荧光定量PCR检测克隆得到的基因CfBG-Ib的差异性表达情况，同时参照已发表的台湾乳白蚁β-葡萄糖苷酶基因Glu1B表达情况比较分析。用于荧光定量PCR检测的特异性引物和内参引物如下：引物名称扩增基因引物序列（5’-3’）qPCR-BGFCfBG-IbGCCTTTCCTCTGCATTCACTGqPCR-BGRCfBG-IbCCTCAGCCCCTTCAAGACATTqPCR–Glu1B-FGlu1BTTGCCTCGTCGTCTTTGTGAqPCR–Glu1B-RGlu1BCCTTTCCATCCGCATCCCAT18S-F18SCGAGATTGAGCAATAACAGGTC18S-R18SACGTAATCAACGCGAGCTTATG3.5定量PCR反应1）在PCR管中加入以下体系（冰上操作）：组分使用量cDNA1μlSYBRPremixExTaqTM(2×)10μlPCRForwardPrimer(10μM)0.5μlPCRReversePrimer(10μM)0.5μlRNasefreedH2Oupto20μl2）应用StratageneMx3000P运行PCR反应，反应程序如下：95℃，30s，1个循环；95℃，10s，55℃，10s，72℃，20s，40个循环。在每个循环的延伸阶段收集荧光信号，进行实时监测。3）反应结束后，先加热到95℃1min，每升高1℃，记录一次荧光信号，得出扩增产物的溶解曲线。荧光定量PCR的数据分析反应结束后，确认扩增曲线和溶解曲线，采用2-△△Ct的方法进行目的基因的相对表达量分析。结果与分析1温度胁迫下台湾乳白蚁β-葡萄糖苷酶基因差异性表达结果提取温度胁迫处理组和对照组的台湾乳白蚁的总RNA，反转录为cDNA后，作为模板进行荧光定量PCR。以18S基因为内参基因，检测β-葡萄糖苷酶基因CfBG-Ib和Glu1B在不同温度胁迫下的表达情况。实时荧光定量PCR结果显示（图5~6），温度胁迫处理，β-葡萄糖苷酶的三个基因CfBG-Ib和Glu1B的相对表达量趋势一致。在低温和高温胁迫下，基因CfBG-Ib的相对表达量不存在显著差异。吡虫啉胁迫下台湾乳白蚁β-葡萄糖苷酶基因差异性表达结果提取吡虫啉胁迫处理组和对照组的台湾乳白蚁的总RNA，反转录为cDNA后，作为模板进行荧光定量PCR。以18S基因为内参基因，检测β-葡萄糖苷酶基因CfBG-Ib和Glu1B在吡虫啉胁迫下的表达情况。实时荧光定量PCR结果显示（图7~8），吡虫啉胁迫处理β-葡萄糖苷酶的三个基因CfBG-Ib和Glu1B的相对表达量趋势基本一致。前3天，三个基因的相对表达量与对照组下的相对表达量相差不大，处理的第4天，三个基因的相对表达量均明显高于对照组的相对表达量。SEQIDNO:1GAATTAGTTGAAGTTGGCGTCATATTTGACAAGTTTACAACTTGACGGCTTCCCATGGCGACTGGATAGGACGCAGATTGTGTAAGATTGAGAATATCACCGGCAACTCAAGTCATGTTAAGTGGAGCAGGTGCTTGGAGATGTTTCTTACTTTCAGTACTGTTGCTGAATTTATCAGCTACTGCCAGCGGTCGCCTTATTTCTAATATTTTGAATCCCATTTTAAGTAGTCTCGGCCTAAACTCCCAAAGTACCAAGAACACTGTTGCCCCTTCCCAATATAATGTTGTTACTACTCCCAAGAACACTGTTGCCCCTTCCCAAAGTAACACCGATCCTACCAAGAAGAACTTCACTTTTCCCGAAGACTTCTACTTTGCAGCTGCAACGGCGGCTTACCAAGCCGAAGGAGGTTGGAACGCAGACGGGAAAGGTCCTAATATCTGGGACACACTGACACACAACCATCCAGACTACATATCCGACTTCTCGAATGGTGACGTAGCAGCGGACTCCTACCACAAGTACACTGAAGACATCAAATTACTCAAGGACATTGGGGTGCAGTTTTACAGATTTTCCATATCCTGGTCACGGATACTTCCTAAGGGAAGTGTGGCAGCCATTAATCAGGCTGGTGTCGACTACTATAACAACATCATTAATGGTCTGCTAGCCGTCGGAATTCAGCCCATGGTTACGATGTACCACTGGGATTTGCCTCAGCCCCTTCAAGACATTGGAGGATGGGCCAATGATTCCATAGCCGATTTCTTCAAGGACTACGCCAGGCTTCTATATAGATTTTTCGGCGATAGAGTGAAATGGTGGATACCAATAAATGAGCCTTTCATGATAGCTAACGGATACAGTGAATGCAGAGGAAAGGCGCCGTCCCTCTGCCAGCCTGGGACGGCAGATTACCTGGCAGCCAGAACAATGCTGCTTGCTCACGCAAAAGCCTATCACGTCTACCACAACGATTTCAGGGACACACAAGCAGGTAAAGTGAGCACCTCGTTTAGCATCGACTGGCACGAACCGCGCACCAACAGTACGGCAGATATTTTAGCAGCGGAGAGAGCCGTGCAATTCGAGCTAGGGATGTTCGCTCATCCCATCTACAGTACCTCGGGGGACTATCCACCGGAAGTAAGAGCCAGAGTCGATAACAACAGCAGAGCTGAGGGCTACAATACTTCCCGCCTGCCGAAATTCACCCAAGAGGAGATAGATTACATTAAAGGGACGTGGGACTTCTTCGCATTAAATCATTACACAACTTATTGGGCCCAGGATGGACTGCAAGGGCCGGACCCTTCCCGACAGCGCGATTCGGGTGTCATGAAATCGCAAGACCCCAGCTGTCCTGAGACCAGCTCTCCGTGGTTTAGGGTTGTTCCCTGGGGATTCAGGAAGATACTGCGTTGGGTGAAGAAAGAATACAACAATCCCCCAATATTCATCACAGAGTCCGGTTACTCTGACGATGGTCGTCTCCAGGATACGGGACGGATTAAGTATTACGTAGACTACATCCGTGAGCTGCTGAAGGCAAAATACGAAGATGGATGTCAAATAATTGGCTACACTGCTTGGAGTCTAATTGACAATTTTCAATGGGAAGAAGGCTATGAGAGTAAGTTTGGGCTGGTCTACGTCAACTTCAGTGACCCTGCAAGAACTCGGATCATCAAGCAGTCAGCAAGGTTGTACAGCGAGATCATCCGCACAAGAAAAGTTCCGGACCGCTACCCGCAGTACAGCTATGACACGCAGGAATGTCACCCGACGATTCCGTTATGAAAGCTATATGAATCATAGTTCCTCACTATCGATGTTTACGAAAGAGCGCGTGCCTATGGAATTACGATGGGGAAGAATTTTTCTATTGCGTGTAAACGATTCAGACTATTAAGTGTATTATGAGAACAGAAAAATCATGAAAATATCGAAAAAAAAAAAASEQIDNO:2MLSGAGAWRCFLLSVLLLNLSATASGRLISNILNPILSSLGLNSQSTKNTVAPSQYNVVTTPKNTVAPSQSNTDPTKKNFTFPEDFYFAAATAAYQAEGGWNADGKGPNIWDTLTHNHPDYISDFSNGDVAADSYHKYTEDIKLLKDIGVQFYRFSISWSRILPKGSVAAINQAGVDYYNNIINGLLAVGIQPMVTMYHWDLPQPLQDIGGWANDSIADFFKDYARLLYRFFGDRVKWWIPINEPFMIANGYSECRGKAPSLCQPGTADYLAARTMLLAHAKAYHVYHNDFRDTQAGKVSTSFSIDWHEPRTNSTADILAAERAVQFELGMFAHPIYSTSGDYPPEVRARVDNNSRAEGYNTSRLPKFTQEEIDYIKGTWDFFALNHYTTYWAQDGLQGPDPSRQRDSGVMKSQDPSCPETSSPWFRVVPWGFRKILRWVKKEYNNPPIFITESGYSDDGRLQDTGRIKYYVDYIRELLKAKYEDGCQIIGYTAWSLIDNFQWEEGYESKFGLVYVNFSDPARTRIIKQSARLYSEIIRTRKVPDRYPQYSYDTQECHPTIPL当前第1页1 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