一种重组内参GAPDH抗体的制备方法及应用与流程

文档序号:12399473阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种重组内参GAPDH抗体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:

步骤(1):获取GAPDH抗体重链及轻链可变区序列:

以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为免疫原对小鼠进行免疫后,提取脾脏mRNA,反转录得到抗体cDNA,根据抗体可变区两端的保守序列设计特异性引物,引物序列见核苷酸序列表,分别以引物VH对和引物VL对扩增重链可变区和轻链可变区,在重链可变区的上游和轻链可变区下游分别引入双酶切位点,以linker序列为接头,通过重叠延伸PCR技术将重链可变区和轻链可变区的片段连接起来,以此为连接产物为模板,以引物scFv for和scFv back进行二次PCR,得到单链抗体scFv基因片段;对scFv基因和pCAN TAB5E噬菌粒载体进行双酶切并连接,转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞中,加入M13KO7辅助噬菌体超感染后,得到抗GAPDH噬菌体单链抗体库;将抗GAPDH噬菌体单链抗体库加入至抗GAPDH蛋白包被的96孔板中进行富集筛选得到GAPDH抗体的重链可变区和轻链可变区序列;

步骤(2):构建重链轻链表达载体:

以筛选得到的GAPDH抗体的重链可变区和轻链可变区序列作为模板进行PCR扩增,将PCR扩增得到的带胶回收并用内切酶进行双酶切,回收目的片段,载体pFUSEss-CHIg-hG1用同样的内切酶双酶切,然后用T4DNA连接酶连接载体和目的片段,将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,进行菌落PCR,筛选阳性单克隆菌落扩增提取得到pFUSEss_CHIg重链表达质粒和pFUSE2ss_CLIg轻链表达质粒;

步骤(3):共转293T细胞表达GAPDH抗体:

将获得的pFUSEss_CHIg重链表达质粒和pFUSE2ss_CLIg轻链表达质粒质粒混合,通过PEI缓释液转染至293T细胞中,用抗性筛选含有两种质粒的细胞株293T细胞,培养细胞株后得到GAPDH抗体。

2.如权利要求1所述的重组内参GAPDH抗体的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中,linker序列为15肽序列((Gly4Ser)3)对应的45bp的基因序列。

3.如权利要求1所述的重组内参GAPDH抗体的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中,抗GAPDH噬菌体单链抗体库的富集筛选的具体过程如下:将所得抗GAPDH噬菌体单链抗体库加入至抗GAPDH蛋白包被的96孔板中,于37℃下静置孵育1h,洗涤,用100mmol/L三乙胺洗脱,加入1mol/L Tris(pH8.5)进行中和,以此感染对数生长期TG1,经培养后收集菌体细胞,再次加入M13KO7辅助噬菌体进行感染,重复上述富集程序3次,挑取单菌落扩大培养,进行菌液PCR鉴定和单克隆Phage-ELISA鉴定后进行测序,得到重链和轻链可变区的序列。

4.如权利要求1所述的重组内参GAPDH抗体的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中,PCR扩增具体过程如下:分别设计用于扩增重轻链可变区的引物,上游:5’-CTTGGAATTCGAGGTGAAGCTCAAGGAGTCT-3’,下游:5’-GAATCTCGAGTGTCGACACGGTGACCGTGG-3’,以筛选得到的GAPDH抗体的重链可变区和轻链可变区序列作为模板,用上述引物及Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增,反应条件如下:94℃预变性2min、94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s,共35个循环,最后72℃终延伸5min,PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析回收纯化。

5.如权利要求1所述的重组内参GAPDH抗体的制备方法,其特征在于:所述步骤(3)中,细胞转染的具体过程如下:转染前将293T细胞传代,保证细胞汇合度达到80%~85%,将DNA稀释液和PEI稀释液混合,静置5min后加入293T细胞中,放于37℃的二氧化碳培养箱中培养,转染48h取样检测抗体是否表达,根据检测情况确定收样时间。

6.一种如权利要求1~5所述的重组内参GAPDH抗体的纯化方法,其特征在于:包括如下步骤:1)取亲和层析柱,先用水洗柱床,再用乙酸钠缓冲液洗涤层析柱;2)取细胞培养液,于4℃、转速12000rpm下离心10min,收集上清,用0.45μm的滤膜过滤;3)取5mL细胞培养基上清与等量的乙酸钠缓冲液混合,以0.5mL/min的速度上样,收集穿透;4)上样结束后,继续以乙酸钠缓冲冲洗至G250检测无色,用冰乙酸洗脱缓冲冲洗柱床,搜集洗脱峰,迅速用饱和碳酸钠调洗脱峰pH至中性;5)用10倍体积的超纯水洗涤层析柱,再用10mL NaCl-叠氮钠缓冲封闭层析柱,置于4℃备用;6)将洗脱峰超滤浓缩到血清等体积,装入透析袋4℃透析过夜;7)取出样品,于4℃、12000rpm下离心10min,收集上清,即得纯化后的GAPDH抗体。

7.一种如权利要求1~5所述的重组内参GAPDH抗体的应用,其特征在于:所述抗体用于WB实验中检测或校准实验系统。

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