一种重组内参GAPDH抗体的制备方法及应用与流程

本发明涉及重组蛋白技术领域，具体涉及一种重组内参GAPDH抗体的制备方法及应用。

背景技术：

要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。通常会使用内参抗体来检测实验系统，或者校准实验结果。内参即是内部参照(Internal Control)，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

这样对内参抗体的质量要求就很高，目前常规两种方法：1)传统多克隆抗体(抗原免疫兔子获取抗血清后纯化得到抗体)；2)传统单克隆抗体(抗原免疫小鼠后取脾脏融合筛选出单克隆后制备腹水，纯化腹水得到抗体)；缺点：1)多克隆抗体容易出现批间差，不同批次质量参差不齐；2)多克隆抗体做WB的时候容易出现背景不干净，杂带较多等情况，受样本质量干扰影响较大；3)单克隆抗体细胞株容易丢失，丢失后重新制备周期长，而且会出现批间差。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种重组内参GAPDH抗体的制备方法及应用，以解决现有技术中所制备的抗体批间差大，周期长及检测易受样本质量干扰等问题。

本发明通过以下技术方案实现：一种重组内参GAPDH抗体的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)：获取GAPDH抗体重链及轻链可变区序列：

以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为免疫原对小鼠进行免疫后，提取脾脏mRNA，反转录得到抗体cDNA，根据抗体可变区两端的保守序列设计特异性引物，引物序列见核苷酸序列表，分别以引物VH对和引物VL对扩增重链可变区和轻链可变区，在重链可变区的上游和轻链可变区下游分别引入双酶切位点，以linker序列为接头，通过重叠延伸PCR技术将重链可变区和轻链可变区的片段连接起来，以此为连接产物为模板，以引物scFv for和scFv back进行二次PCR，得到单链抗体scFv基因片段；对scFv基因和pCAN TAB5E噬菌粒载体进行双酶切并连接，转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞中，加入M13KO7辅助噬菌体超感染后，得到抗GAPDH噬菌体单链抗体库；将抗GAPDH噬菌体单链抗体库加入至抗GAPDH蛋白包被的96孔板中进行富集筛选得到GAPDH抗体的重链可变区和轻链可变区序列；

步骤(2)：构建重链轻链表达载体：

以筛选得到的GAPDH抗体的重链可变区和轻链可变区序列作为模板进行PCR扩增，将PCR扩增得到的带胶回收并用内切酶进行双酶切，回收目的片段，载体pFUSEss-CHIg-hG1用同样的内切酶双酶切，然后用T4DNA连接酶连接载体和目的片段，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行菌落PCR，筛选阳性单克隆菌落扩增提取得到pFUSEss_CHIg重链表达质粒和pFUSE2ss_CLIg轻链表达质粒；

步骤(3)：共转293T细胞表达GAPDH抗体：

将获得的pFUSEss_CHIg重链表达质粒和pFUSE2ss_CLIg轻链表达质粒质粒混合，通过PEI缓释液转染至293T细胞中，用抗性筛选含有两种质粒的细胞株293T细胞，培养细胞株，得到GAPDH抗体。

上述技术方案中，所述步骤(1)中，linker序列为15肽序列((Gly4Ser)3)对应的45bp的基因序列。

上述技术方案中，所述步骤(1)中，抗GAPDH噬菌体单链抗体库的富集筛选的具体过程如下：将所得抗GAPDH噬菌体单链抗体库加入至抗GAPDH蛋白包被的96孔板中，于37℃下静置孵育1h，洗涤，用100mmol/L三乙胺洗脱，加入1mol/L Tris(pH8.5)进行中和,以此感染对数生长期TG1,经培养后收集菌体细胞，再次加入M13KO7辅助噬菌体进行感染，重复上述富集程序3次，挑取单菌落扩大培养，进行菌液PCR鉴定和单克隆Phage-ELISA鉴定后进行测序，得到重链和轻链可变区的序列。

上述技术方案中，所述步骤(2)中，PCR扩增具体过程如下：分别设计用于扩增重轻链可变区的引物，上游：5’-CTTGGAATTCGAGGTGAAGCTCAAGGAGTCT-3’，下游：5’-GAATCTCGAGTGTCGACACGGTGACCGTGG-3’，以筛选得到的GAPDH抗体的重链可变区和轻链可变区序列作为模板，用上述引物及Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，反应条件如下：94℃预变性2min、94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，共35个循环，最后72℃终延伸5min，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析回收纯化。

上述技术方案中，所述步骤(3)中，细胞转染的具体过程如下：转染前将293T细胞传代，保证细胞汇合度达到80％～85％，将DNA稀释液和PEI稀释液混合，静置5min后加入293T细胞中，放于37℃的二氧化碳培养箱中培养，转染48h取样检测抗体是否表达，根据检测情况确定收样时间。

本发明还提供了一种上述所述的重组内参GAPDH抗体的纯化方法，包括如下步骤：1)取亲和层析柱，先用水洗柱床，再用乙酸钠缓冲液洗涤层析柱；2)取细胞培养液，于4℃、转速12000rpm下离心10min,收集上清，用0.45μm的滤膜过滤；3)取5mL细胞培养基上清与等量的乙酸钠缓冲液混合，以0.5mL/min的速度上样，收集穿透；4)上样结束后，继续以乙酸钠缓冲冲洗至G250检测无色，用冰乙酸洗脱缓冲冲洗柱床，搜集洗脱峰，迅速用饱和碳酸钠调洗脱峰pH至中性；5)用10倍体积的超纯水洗涤层析柱，再用10mL NaCl-叠氮钠缓冲封闭层析柱，置于4℃备用；6)将洗脱峰超滤浓缩到血清等体积，装入透析袋4℃透析过夜；7)取出样品，于4℃、12000rpm下离心10min，收集上清，即为纯化后的GAPDH抗体。

本发明还提供了一种重组内参GAPDH抗体的应用，该抗体用于WB(Western Blot)实验中检测或校准实验系统。

本发明的有益效果为：本发明通过重组抗体技术制备重组内参GAPDH抗体，应用于WB(Western Blot)实验中检测或校准实验系统，能避免现有技术中采用多克隆抗体易出现批间差、杂带较多受样本质量干扰影响较大、单克隆抗体细胞株容易丢失，丢失后重新制备周期长等问题。

附图说明

图1为实施例1制备的重组内参GAPDH抗体的WB验证结果图；

图2为实施例1制备的重组内参GAPDH抗体的IF验证结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明。以下实施例仅是范例性的，仅用以对本发明的技术方案做更进一步的详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不偏离本发明技术方案的精神和范围内，对技术方案进行的修改或者替换均应涵盖在本发明的权利要求保护范围内。

实施例1

本实施例的一种重组内参GAPDH抗体的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)：获取GAPDH抗体重链及轻链可变区序列：

以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为免疫原对Balb/c小鼠进行三次免疫，在取小鼠脾脏前3d加强免疫一次，测定抗血清效价，取效价高的小鼠，取脾组织提取mRNA，反转录得到抗体cDNA，根据抗体可变区两端的保守序列设计特异性引物，引物序列见核苷酸序列表，分别以引物VH对和引物VL对扩增重链可变区和轻链可变区，扩增反应条件如下:94℃预变性5min，94℃ 45s，58℃ 1min，72℃ 45s，共进行30个循环，72℃延伸10min；在设计引物时分别在重链可变区的下游引物序列和轻链可变区的上游引物序列引入linker序列，Linker是重复三次排列组合的4个甘氨酸和1个丝氨酸((Gly4Ser)3)的15肽序列对应的45bp的基因序列，详见核苷酸序列表，在重链可变区的上游和轻链可变区下游分别引入酶切位点SfiⅠ和NotⅠ酶切位点，以linker序列为接头，通过重叠延伸SOE-PCR技术将重链可变区和轻链可变区的片段连接起来，PCR反应如下:首先在常规PCR反应体系(50μL)中加入等摩尔VL、VH基因,94℃预变性5min，94℃ 45s，68℃ 1min，72℃ 45s，共进行10个循环，72℃延伸10min；以此连接产物为模板，以引物scFv for和scFv back进行二次PCR，第二次PCR扩增反应如下：94℃预变性5min，94℃ 45s，60℃ 1min，72℃ 45s，共进行30个循环，最后72℃延伸10min，得到单链抗体scFv基因片段；对scFv基因和pCAN TAB5E噬菌粒载体进行SfiⅠ、NotⅠ双酶切并连接，转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞中并涂板，37℃过夜培养后进行菌落计数，估算库容量；将剩余转化菌液扩大培养，加入M13KO7辅助噬菌体37℃静置感染30min后，离心沉淀菌体细胞，用2×YT-AK培养基重悬，37℃震荡培养过夜，离心取上清液，加入PEG/NaCl冰浴1h，离心并重悬沉淀，经0.45μm滤膜过滤后即得到抗GAPDH噬菌体单链抗体库；将所得抗GAPDH噬菌体单链抗体库加入至抗GAPDH蛋白包被的96孔板中，于37℃下静置孵育1h，洗涤，用100mmol/L三乙胺洗脱，加入1mol/L Tris(pH8.5)进行中和,以此感染对数生长期XL1-Blue，经培养后收集菌体细胞，再次加入M13KO7辅助噬菌体进行感染，重复上述富集程序3次，挑取单菌落扩大培养，进行菌液PCR鉴定和单克隆Phage-ELISA鉴定后进行测序，得到GAPDH抗体的重链可变区和轻链可变区序列；

步骤(2)：构建重链轻链表达载体：

以筛选得到的GAPDH抗体的重链可变区和轻链可变区序列作为模板进行PCR扩增，PCR扩增如下：分别设计用于扩增重链可变区的上下游引物，上游：5’-CTTGGAATTCGAGGTGAAGCTCAAGGAGTCT-3’，下游：5’-GAATCTCGAGTGTCGACACGGTGACCGTGG-3’(下划线分别为EcoRI和XhoI酶切位点)，以筛选得到的GAPDH抗体的重链可变区和轻链可变区序列作为模板，用上述引物及Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，反应条件如下：94℃预变性2min、94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，共35个循环，最后72℃终延伸5min，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析回收纯化；

将PCR扩增得到的带胶回收并用内切酶内切酶AgeI和NcoI进行双酶切37℃过夜，回收目的片段，载体pFUSEss-CHIg-hG1用同样的内切酶双酶切37℃过夜，然后用T4DNA连接酶连接载体和目的片段，16℃下过夜，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，转化液涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，次日随机挑取8个平板上单克隆菌落进行菌落PCR，筛选阳性单克隆菌落扩增提取得到pFUSEss_CHIg重链表达质粒和pFUSE2ss_CLIg轻链表达质粒；

步骤(3)：共转293T细胞表达GAPDH抗体：

将获得的pFUSEss_CHIg重链表达质粒和pFUSE2ss_CLIg轻链表达质粒质粒混合，通过PEI缓释液转染至293T细胞中，转染前将293T细胞传代，保证细胞汇合度达到80％～85％，将DNA稀释液和PEI稀释液混合，静置5min后加入293T细胞中，放于37℃的二氧化碳培养箱中培养，转染48h取样检测抗体是否表达，根据检测情况确定收样时间；用抗性筛选含有两种质粒的细胞株293T细胞，培养细胞株后得到GAPDH抗体。

表1 核苷酸序列表

注:＊VH for中含SfiⅠ酶切位点,VL back中含NotⅠ酶切位点；序列中简并碱基符号为W＝A/T；S＝G/C；M＝A/C；R＝A/G

实施例2

一种实施例1制得的重组内参GAPDH抗体的纯化方法，包括如下步骤：1)取亲和层析柱，先用水洗柱床，再用乙酸钠缓冲液洗涤层析柱；2)取细胞培养液，于4℃、转速12000rpm下离心10min,收集上清，用0.45μm的滤膜过滤；3)取5mL细胞培养基上清与等量的乙酸钠缓冲液混合，以0.5mL/min的速度上样，收集穿透；4)

上样结束后，继续以乙酸钠缓冲冲洗至G250检测无色，用冰乙酸洗脱缓冲冲洗柱床，搜集洗脱峰，迅速用饱和碳酸钠调洗脱峰pH至中性；5)用10倍体积的超纯水洗涤层析柱，再用10mL NaCl-叠氮钠缓冲封闭层析柱，置于4℃备用；6)将洗脱峰超滤浓缩到血清等体积，装入透析袋4℃透析过夜；7)取出样品，于4℃、12000rpm下离心10min，收集上清，即为纯化后的重组内参GAPDH抗体，取出4μL抗体，用SDS-PAGE检测抗体的纯化，用Nanodrop测定抗体的浓度。

1、通过ELISA检测293T细胞株

以抗人KAPPA链抗体用包被酶标板，4℃包被过夜，5％牛奶封闭液封闭2h；，分别加入正常未转染293T细胞上清(-)和人IgG标准品(100ng/mL---+)和293T细胞表达上清，各100μL，37℃孵育30min，用ELISA洗涤液洗5次，3min/次；将HRP标记的羊抗人IgG Fcγ特异性抗体用ELISA稀释液稀释后，分别加入孔中，37℃孵育30min，用ELISA洗涤液洗5次，3min/次；加入显色液100μL/孔，37℃避光显色10min，最后加入50μL/孔2mol/L硫酸终止，用酶标仪上机检测。根据酶标仪检测结果确定抗生素双筛选的293T细胞株的抗体分泌能力。

2、用Western blot方法检测实施例1筛选出来的GAPDH抗体

WB选取HepG2细胞，A549细胞，HEK293细胞，Jurkat细胞和K562细胞，裂解后，使用制得的重组抗体作为一抗，进行WB试验。结果如图1所示。

3、用免疫荧光检测实施例1筛选出来的GAPDH抗体

采用石蜡切片和SABC法进行，结果如图2所示。

<110> 武汉华美生物工程有限公司

华, 权高

<120> 一种重组内参GAPDH抗体的制备方法及应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

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<212> PRT

<213> Mus musculus

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Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

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