抗IDO1蛋白单克隆抗体及其用途的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及可特异结合IDO1蛋白的单克隆抗体Umab126、产生所述单克隆抗体的细胞株及应用该抗体用于诊断的方法和用途。

背景技术：

IDO1是一种细胞内含亚铁血红素的酶，通过催化氧化裂解色氨酸分子中的吲哚环，从而使色氨酸沿犬尿酸途径分解代谢。IDO1在多种肿瘤组织中有高表达，通过降低肿瘤微环境中色氨酸浓度来抑制淋巴细胞的增值。因此，目前认为IDO1的高表达是导致机体对肿瘤产生免疫耐受的重要因素之一。目前临床上常用免疫组织化学(IHC)病理实验检测肿瘤细胞中蛋白的表达状况，然而IHC实验的核心为特异性结合蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对IDO1蛋白的单克隆抗体对IHC检测IDO1表达水平具有重要的意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种结合特异性较高的IDO1蛋白的单克隆抗体，及其在制备用于检测IDO1蛋白的免疫检测工具中的应用。

本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏日期为2016年4月27日，保藏编号为CGMCC No.12286。

本发明还提供了一种特异性结合IDO1蛋白的单克隆抗体Umab126，由上述杂交瘤细胞株产生。

本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：

(1)重组表达载体的构建：根据IDO1ORF核苷酸序列(IDO1ORF核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，1212bp；IDO1氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)

设计引物PCR扩增IDO1ORF第1bp位到第1209bp位序列，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI，插入表达载体pCMV6-Entry，构建IDO1氨基酸序列第1位到第289位的重组表达质粒pCMV6-rIDO1；上游扩增引物序列，SEQ ID NO.3:CACGCGATCGCATGGCACACGCTATGGAAAACT下游扩增引物序列SEQ ID NO.4:ACCGACGCGTCTTCCTTCAAAAGGGATTTCTCA

(2)IDO1重组蛋白的表达与纯化：将IDO1重组表达质粒转化HEK293T细胞，裂解离心获得上清，DDK亲和层析柱纯化，获得纯化的IDO1重组蛋白；

(3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的IDO1重组蛋白免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗IDO1特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为Umab126，亚型鉴定为IgG1；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得IDO1单克隆抗体Umab126。分别通过Western Blot、免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

进一步采用OriGene高密度蛋白芯片对上述单克隆抗体的特异性进行验证：OriGene高密度蛋白芯片上包含10,000个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵，每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。

本发明将所述单克隆抗体Umab126与上述芯片杂交并确定阳性信号位点，结果显示本发明所述单克隆抗体Umab126特异性结合IDO1蛋白，而与其他蛋白无交叉反应。

本发明还提供了单克隆抗体Umab126在制备用于检测IDO1蛋白的免疫检测工具中的应用。

具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

在具体的实施例中，本发明提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体Umab126，可检测组织细胞中IDO1的表达状况。

本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。其中所述肿瘤具体是指肿瘤细胞的增殖与IDO1的表达密切相关的肿瘤，包括但不限于黑色素瘤、肺癌、结肠癌、乳腺癌。

与现有技术相比，本发明提供了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为CGMCC No.12286)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体Umab126。本发明还提供了单克隆抗体Umab126在制备用于检测IDO1蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体Umab126的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体Umab126在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与IDO1蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了IDO1蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤浸润淋巴细胞内IDO1蛋白表达水平，可应用于黑色素瘤、肺癌、结肠癌、乳腺癌等肿瘤免疫微环境的检测。

保藏信息

用于保藏的杂交瘤细胞株Umab126的分类命名为：IDO1鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位简称：CGMCC；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2016年4月27日；

保藏编号：CGMCC No.12286。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1克隆位点设计如图，其中底纹部分为ORF区；

图2示实施例2重组IDO1蛋白Western blot检测结果图，以anti-DDK检测重组IDO1蛋白在HEK293T细胞中的表达，其中左侧泳道为转染空载体的HEK293T细胞裂解液为抗原的检测结果、右侧泳道为转染pCMV6-rIDO1质粒的HEK293T细胞裂解液抗原的检测结果；

图3示实施例2重组IDO1蛋白SDS-PAGE结果图，用抗DDK亲和层析柱纯化重组IDO1蛋白，纯化后的蛋白通过SDS-PAGE胶电脉、考马斯亮蓝染色；

图4示实施例3以单克隆抗体Umab126识别完整的IDO1(Full length IDO1,IDO1-FL)蛋白的Western blot检测结果图。泳道1为转染pCMV6-Entry的细胞裂解液；泳道2为转染pCMV6-IDO1-FL的细胞裂解液；

图5示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人乳淋巴结组织免疫组化结果图(一抗为IDO1单克隆抗体Umab126)；

图6示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人扁桃体组织免疫组化结果图(一抗为IDO1单克隆抗体Umab126)；

图-7示实施例5 OriGene蛋白芯片鉴定结果图(一抗为IDO1单抗Umab126，1:100；二抗为DyLight649-conjugated AffiniPure Fragment Goat-anti-Mouse IgG，1:400)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、IDO1重组表达质粒的构建

以从美国傲锐东源生物科技有限公司获得的质粒RC206592(含IDO1ORF 1212bp)为模板，设计两条引物并分别引入酶切位点SgfI和MluI，克隆入表达载体pCMV6-Entry，建立IDO1重组表达质粒。克隆位点设计如图1所示。

实施例2、IDO1重组蛋白的表达与纯化

1、转染HEK293T细胞：HEK293T细胞以1:3传至培养皿中继续培养；取7.5mLDMEM(无血清及抗生素)至50mL管中，加入300μLPEI MegaTran1.0混匀；加入75μg IDO1重组表达质粒DNA至混匀液中，混匀并静置30分钟；分别取515μL至各培养皿中于37℃5％CO₂培养箱中培养。转染24小时后，每皿细胞添加25μL2M丁酸钠至终浓度5mM。

2、裂解细胞：转染48小时后，进行细胞裂解。吸去培养基，加入1mLPBS进行漂洗，吸去PBS。加入1mL裂解缓冲液，使用前加入蛋白酶抑制剂PI和PMSF。置于冰盒中在摇床上振荡，收集所有培养皿中得裂解液，4℃离心，收集上清。取少量上清采用WB鉴定重组IDO1的表达，结果图2。

3、DDK亲和层析柱纯化：以0.45μM，33mm PVDF膜滤器过滤离心后的裂解液上清并转入15mL管，加入混合好的Beads 1mL，封口后放入360度混匀器中，于4℃结合2小时；取出15mL管，将裂解液倒入BIO-RAD层析柱中，并接住穿透液，滴尽后穿透液取样WB检测；以裂解缓冲液冲洗柱料1-2次，滴尽后再用TBST冲洗Beads 3次，滴尽后用0.1M Glycine pH3.5洗脱，第一次200μL，滴尽不收集，第二、三次各500μL，第三次250μL，收集至一个1.5mL离心管中，并迅速加入NaH₂PO₄(pH＝11.0)中和至pH7.0左右，每管加入甘油至终浓度为10％，Tween-80至终浓度为0.1％。纯化后的重组IDO1蛋白用SDS-PAGE鉴定，见图3。

由图2结果可见，转染pCMV6-rIDO1质粒的HEK293T细胞裂解液中WB检测后在45kD处有明显的特异条带，与多肽的理论分子量45kD基本相符。表明细胞中重组IDO1蛋白特异表达。

由图3结果可见，纯化的蛋白在PAGE胶45kD处有明显的特异条带，与多肽的理论分子量45kD基本相符。表明已获得了纯度较好的IDO1重组蛋白。

实施例3、IDO1单克隆抗体的制备与筛选

根据标准方法用重组产生的纯化的IDO1蛋白片段用于对Balb/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。具体方法如下：

1、动物免疫：经过纯化的IDO1抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄Balb/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用Balb/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％PEG(PH 8.0)1mL，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，MC定容到50mL，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行培养。

3、筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用IDO1纯化重组蛋白进行ELISA测试。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取OD280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株为Umab126。

4、腹水单抗的制备与纯化：10-12周龄的雄性Balb/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，一周后每只小鼠用1mL注射器腹腔注射经PBS洗涤重悬的单克隆细胞悬液，细胞用量为5×10⁶/只，每株抗体打2只小鼠。待小鼠腹水积聚后收集腹水，离心取上清，亲和层析法进行腹水纯化，根据抗体亚型选择相应柱料，细胞株Umab126产生的单抗为IgG1，采用protein G进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、WB检测、分装、冻存在-20℃。其中WB检测结果见图4。

由图4结果可见，泳道2在分子量约45kD处有特异的条带，表明单克隆抗体Umab126能特异地Western blot检测完整的全长IDO1蛋白。

实施例4、单克隆抗体Umab126为一抗的免疫组化检测

(1)实验方法：

1、取福尔马林固定的人淋巴结组织与人扁桃体组织块进行石蜡包埋，使用Finesse组织切片机进行切片，组织厚度为6μm。

2、脱蜡与水化：分析纯二甲苯3×10min，无水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去离子水浸泡3min×3次

3、加入抗原修复液(0.01M，pH6.0枸橼酸钠缓冲液)高压锅高压热修复3min，待高压锅温度降至约90℃时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3min×3次。

4、使用3％过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置10min。去离子水浸泡5min×3次。

5、加上封闭液(PBS+5％脱脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

6、去除封闭液，勿冲洗，加入IDO1单抗(Umab126)，稀释比：1:150，使用封闭液进行稀释。置于湿盒中，37℃孵育60min。PBST(0.1％Tween-20)洗涤2次，每次洗涤5min。PBST(0.02％Tween-20)洗涤1次，每次洗涤5min。

7、滴加Polink-试剂盒2(Catlog No.D37-15)试剂1，37℃孵育10-20分钟。使用PBS洗涤3次，每次5min。滴加Polink-2试剂盒(Catlog No.D37-15)试剂2，37℃孵育10-20分钟，使用PBS洗涤3次，每次5min。

8、应用DAB溶液(中杉金桥ZLI-9019)显色，显色3～10min。蒸馏水洗涤。

9、苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1％盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置1min。

10、脱水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5min x 3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性树胶封片。

11、镜检，见图5-6。

(2)实验结果：

由图5-6结果可见，在人淋巴结组织与人扁桃体组织中可见到特异性胞浆染色。结果与IDO1在细胞内的定位及组织表达特异性一致，表明单克隆抗体Umab126可用于免疫组织化学检测IDO1蛋白的水平。

实施例5、单克隆抗体Umab126的特异性检测

OriGene高密度蛋白芯片上包含10,000个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一种蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵，每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。以下为使用OriGene蛋白(OriGene Cat PA100001)芯片进行Umab126抗体鉴定实验的实验方法：

1、将一张蛋白芯片放在50mL离心管中，使用40mL去离子水浸润芯片，置于摇床上，室温混合30分钟。弃掉去离子水，使用10mLPBST平衡芯片。室温处理10分钟。

2、向50mL离心管中加入40mL5％脱脂牛奶(用PBST进行稀释)置于摇床上，室温封闭30分钟。

3、使用封闭液(5％脱脂牛奶)稀释一抗Umab126，稀释比列为1:100。

4、将洁净的封口膜粘贴到实验台上，滴加250-300μL一抗在封口膜上。

5、将蛋白芯片从封闭液中抽出，将蛋白芯片NC膜的一面朝下，从芯片的一边接触抗体，慢慢滑下，依靠液体表面张力，抗体将慢慢浸润芯片NC膜，直至整张NC膜浸润在一抗溶液中。整个操作过程避免产生气泡。将芯片移到4℃环境下，静置，一抗孵育过夜。在芯片上加盖培养皿盖，其上黏附一张湿纸巾，以防止长时间孵育导致抗体蒸发。

6、第二天将芯片移至50mL离心管中，使用PBST漂洗芯片两次，去除多余的抗体。使用40mL PBST(0.1％Tween-20)洗涤芯片，置于摇床上混合均匀，洗涤三次，每次洗涤5min。

7、使用封闭液(5％脱脂牛奶)稀释二抗DyLight649-conjugated AffiniPure Fragment Goat-anti-Mouse IgG，稀释比例为1:400。

8、按照上述步骤4，步骤5进行二抗孵育操作。室温孵育1小时。在芯片上方用铝箔纸遮盖，以防止发生信号漂白。

9、按照上述步骤6，使用PBST洗涤芯片。

10、使用去离子水冲洗芯片，以去除残余的盐分和变性剂。

11、室温干燥芯片，确保芯片完全干燥。

12、使用芯片扫描仪读取荧光信号。

13、根据BSA-Cy3以及BSA-Cy5确定芯片方向以及阳性信号的位点。

14、根据阳性信号位点找出对应蛋白裂解液ID，根据裂解液数据库信息，查找到对应蛋白名称，NCBI录入号(accession number)，蛋白ID，蛋白大小等信息。

结果如图7所示，单抗Umab126在OriGene蛋白芯片上能特异地识别IDO1蛋白，表明单抗Umab126的特异性较好。

<110>无锡傲锐东源生物科技有限公司

<120>抗IDO1蛋白单克隆抗体及其用途

<210> 1

<211>1212

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

ORIGIN

1 ATGGCACACG CTATGGAAAA CTCCTGGACA ATCAGTAAAG AGTACCATAT TGATGAAGAA

61 GTGGGCTTTG CTCTGCCAAA TCCACAGGAA AATCTACCTG ATTTTTATAA TGACTGGATG

121 TTCATTGCTA AACATCTGCC TGATCTCATA GAGTCTGGCC AGCTTCGAGA AAGAGTTGAG

181 AAGTTAAACA TGCTCAGCAT TGATCATCTC ACAGACCACA AGTCACAGCG CCTTGCACGT

241 CTAGTTCTGG GATGCATCAC CATGGCATAT GTGTGGGGCA AAGGTCATGG AGATGTCCGT

301 AAGGTCTTGC CAAGAAATAT TGCTGTTCCT TACTGCCAAC TCTCCAAGAA ACTGGAACTG

361 CCTCCTATTT TGGTTTATGC AGACTGTGTC TTGGCAAACT GGAAGAAAAA GGATCCTAAT

421 AAGCCCCTGA CTTATGAGAA CATGGACGTT TTGTTCTCAT TTCGTGATGG AGACTGCAGT

481 AAAGGATTCT TCCTGGTCTC TCTATTGGTG GAAATAGCAG CTGCTTCTGC AATCAAAGTA

541 ATTCCTACTG TATTCAAGGC AATGCAAATG CAAGAACGGG ACACTTTGCT AAAGGCGCTG

601 TTGGAAATAG CTTCTTGCTT GGAGAAAGCC CTTCAAGTGT TTCACCAAAT CCACGATCAT

661 GTGAACCCAA AAGCATTTTT CAGTGTTCTT CGCATATATT TGTCTGGCTG GAAAGGCAAC

721 CCCCAGCTAT CAGACGGTCT GGTGTATGAA GGGTTCTGGG AAGACCCAAA GGAGTTTGCA

781 GGGGGCAGTG CAGGCCAAAG CAGCGTCTTT CAGTGCTTTG ACGTCCTGCT GGGCATCCAG

841 CAGACTGCTG GTGGAGGACA TGCTGCTCAG TTCCTCCAGG ACATGAGAAG ATATATGCCA

901 CCAGCTCACA GGAACTTCCT GTGCTCATTA GAGTCAAATC CCTCAGTCCG TGAGTTTGTC

961 CTTTCAAAAG GTGATGCTGG CCTGCGGGAA GCTTATGACG CCTGTGTGAA AGCTCTGGTC

1021 TCCCTGAGGA GCTACCATCT GCAAATCGTG ACTAAGTACA TCCTGATTCC TGCAAGCCAG

1081 CAGCCAAAGG AGAATAAGAC CTCTGAAGAC CCTTCAAAAC TGGAAGCCAA AGGAACTGGA

1141 GGCACTGATT TAATGAATTT CCTGAAGACT GTAAGAAGTA CAACTGAGAA ATCCCTTTTG

1201 AAGGAAGGTT AA

//

<210> 2

<211>403

<212> PRT

<213>人工序列

<400> 2

ORIGIN

1 MAHAMENSWT ISKEYHIDEE VGFALPNPQE NLPDFYNDWM FIAKHLPDLI ESGQLRERVE

61 KLNMLSIDHL TDHKSQRLAR LVLGCITMAY VWGKGHGDVR KVLPRNIAVP YCQLSKKLEL

121 PPILVYADCV LANWKKKDPN KPLTYENMDV LFSFRDGDCS KGFFLVSLLV EIAAASAIKV

181 IPTVFKAMQM QERDTLLKAL LEIASCLEKA LQVFHQIHDH VNPKAFFSVL RIYLSGWKGN

241 PQLSDGLVYE GFWEDPKEFA GGSAGQSSVF QCFDVLLGIQ QTAGGGHAAQ FLQDMRRYMP

301 PAHRNFLCSL ESNPSVREFV LSKGDAGLRE AYDACVKALV SLRSYHLQIV TKYILIPASQ

361 QPKENKTSED PSKLEAKGTG GTDLMNFLKT VRSTTEKSLL KEG

//