一种环孢菌素同系物的分离纯化装置的制作方法

本实用新型涉及一种环孢菌素同系物的分离纯化装置。

背景技术：

环孢菌素是20世纪70年代发现的由雪白白僵菌(beauveria bassiana，原名为多孔木霉菌tolypocladium inflatum)产生的一组环状十一肽物质。其中的一个主要组分--环孢素A已作为高效免疫抑制剂广泛应用于器官移植术。它的问世引起了器官移植领域的一场革命。除免疫抑制作用外，环孢素还有一系列其它生物活性，如治疗红斑狼疮、牛皮癣等自身免疫系统疾病，抑制HIV-1病毒，逆转肿瘤多药耐药等。

目前已从雪白白僵菌中分离到20多个环孢菌素的同系物，并在多达17种真菌的代谢产物中分离到各种环孢菌素类化合物。工业上通常利用雪白白僵菌等微生物发酵生产环孢素A,在发酵过程中经常伴随着不同类型的杂质，包括产生20多个结构性质相似的同系物，现有的分离纯化装置，多采用单根切向层析柱以变换溶剂比例进行样品分离，但是这种分离方式存在以下弊端。

⑴对于极性接近的环孢菌素同系物进行分离，使用单根层析柱装置，上样量小，或是需要较长的高度与直径比例，才能达到分离效果，这就增加工业大规模生产的成本。

⑵为了获得高纯度的环孢菌素同系物，使用单根层析柱装置分离，需要重复收集、进样、分离，造成操作步骤繁杂、操作时间过长，导致某些降解成分损失。

技术实现要素：

本实用新型要解决的技术问题，在于提供一种环孢菌素同系物的分离纯化装置，其对环孢菌素同系物的分离制备量大，分离度高，获得的目标产物纯度高，分离过程高效便捷、适合自动化生产。

本实用新型是这样实现的：

一种环孢菌素同系物的分离纯化装置，所述分离纯化装置包括一样品进样器以及至少两级切向层析柱分离纯化单元，各级切向层析柱分离纯化单元包括层析柱、洗脱剂储罐、压力泵、收集液储罐，所述压力泵与洗脱剂储罐相连，所述洗脱剂储罐连接至层析柱上端，所述样品进样器连接至层析柱的上端，所述层析柱的下端设置有两个流出口，其中一个流出口接入收集液储罐，另一个流出口下一级切向层析柱分离纯化单元的层析柱相连。

进一步地，所述洗脱剂储罐与层析柱的连接管上设置有一第一通断阀门，所述样品进样器下方设置有一第二通断阀门，与收集液储罐相连的流出口上设有第三通断阀门，与下一级层析柱相连的流出口上设有第四通断阀门。

进一步地，所述层析柱的高度与内径比为10：1～20：1。

进一步地，所述层析柱的填料层为硅胶或酸性氧化铝填料层。

进一步地，所述层析柱填料层的粒径逐级降低。

本实用新型的优点在于：

本实用新型为一种多级串联的切向层析柱组合分离纯化装置，第一级柱的样品进样器一次进样，每一级有独立驱动的循环系统，可单独控制，根据实际需要设置层析柱可装填不同填料，亦或同一填料粒径可逐级降低；各级层析柱下端设置有两个流出口，每个流出口都设置有通断阀门，根据流出液化合物的纯度，接入样品收集液储罐或接入下级层析柱进一步分离。

本实用新型能够快速地对环孢菌素同系物进行有效的分离和纯化，上样量增大，可实现一次进样，多级层析，收集不同的环孢菌素同系物，样品损失量小，且可连续工作，减少操作时间，提高工作效率；另外，其对环孢菌素同系物的分离制备量大，分离度高，获得的目标产物纯度高，分离过程高效便捷、适合自动化生产。

【附图说明】

下面参照附图结合实施例对本实用新型作进一步的说明。

图1是本实用新型一种环孢菌素同系物的分离纯化装置的结构示意图。

图2是本实用新型实施例环孢菌素同系物上样液的高效液相图谱。

【具体实施方式】

请参阅图1和图2所示，对本实用新型的实施例进行详细的说明。

如图1所示，本实用新型所涉及的一种环孢菌素同系物的分离纯化装置，所述分离纯化装置包括一样品进样器1以及至少两级切向层析柱分离纯化单元2，各级切向层析柱分离纯化单元2之间相互连接，各级切向层析柱分离纯化单元2包括层析柱21、洗脱剂储罐22、压力泵23、收集液储罐24，所述压力泵23与洗脱剂储罐22相连，所述洗脱剂储罐22连接至层析柱21上端，所述样品进样器1连接至层析柱21的上端，所述层析柱21的下端设置有两个流出口25，其中一个流出口25接入收集液储罐24，另一个流出口25下一级切向层析柱分离纯化单元2的层析柱21相连。

所述洗脱剂储罐22与层析柱21的连接管上设置有一第一通断阀门26，所述样品进样器1下方设置有一第二通断阀门27，与收集液储罐24相连的流出口25上设有第三通断阀门28，与下一级层析柱21相连的流出口25上设有第四通断阀门29以及一第五通断阀门30，所述第四通断阀门29靠近流出口25，所述第五通断阀门30靠近下一级层析柱21。

所述层析柱21的高度与内径比为10：1～20：1。

所述层析柱21的填料层为硅胶或酸性氧化铝填料层。

所述层析柱21填料层的粒径逐级降低。

本实用新型的具体使用方式如下实施例所示：

分别将200-300目硅胶200L干法装入一级层析柱21、300-400目硅胶200L干法装入二级层析柱21，层析21柱的高度与内径比为10：1；取2公斤环孢菌素粗品溶解于适量丙酮，过滤，装入样品进样器1，打开第二通断阀门27，关闭第一通断阀门26，一次进样；进样完毕，关闭第二通断阀门27，打开第一通断阀门26，洗脱剂储罐22装有石油醚，启动压力泵23，将石油醚泵入层析柱21，打开第三通断阀门28，关闭第四通断阀门29，洗脱1倍柱体积后，改用丙酮：石油醚(1:8)洗脱，分部收集，收集液高效液相检测，依次收集环孢菌素D(纯度大于95％)，环孢菌素G(纯度大于95％)；至环孢菌素G收集完毕，检测有环孢菌素A出现时，改用丙酮：石油醚(1:7)洗脱，关闭第三通断阀门28，打开第四通断阀门29和第五通断阀门30，使洗脱液转入下一级切向层析柱分离纯化单元2；同时定时检测一级层析柱21的洗脱液，当检测未有环孢菌素A时，关闭第四通断阀门29和第五通断阀门30，各级切向层析柱分离纯化单元2将分别单独控制。一级切向层析柱分离纯化单元2改用丙酮：石油醚(1:6)洗脱，分部收集，收集液高效液相检测，依次收集环孢菌素B(纯度大于95％)，环孢菌素E(纯度大于90％)，环孢菌素C(纯度大于95％)；二级切向层析柱分离纯化单元2用独自的循环系统，单独控制，洗脱剂丙酮：石油醚(1:7)洗脱，分部收集，收集液高效液相检测，依次收集环孢菌素T(纯度大于95％)，环孢菌素H(纯度大于95％)，环孢菌素A(纯度大于98％)。

由于采用了上述结构，避免现有的常规层析装置，上样量小的问题，同时可以缩短制备时间，减少溶剂的使用量；在相同上样量的条件下，各同系物的纯度均显著提高，纯组分收率提高5～15％；现有的常规层析装置，无法一次使用不同填料，对于同系物极性极为接近化合物的分离，需要进行二次甚至多次柱层析分离，需要重复收集、进样、分离，造成操作步骤繁杂、操作时间过长，导致某些降解成分损失。采用了上述结构分离环孢菌素同系物，将中等极性且极性极为接近的环孢菌素T，环孢菌素H，环孢菌素A经过一级层析柱的适度分离，泵入二级层析柱采用更细的填料再次分离，可以获得最佳的制备效果。

请参阅图2所示，上述实施例洗脱获得的洗脱物采用HPLC检测，HPLC检测条件为：C18色谱柱；体积比为(430:520:50:1)的乙腈-水-叔丁基甲醚-磷酸为流动相，检测波长210nm，温度70℃。

本实用新型对环孢菌素同系物的分离制备量大，分离度高，获得的目标产物纯度高，分离过程高效便捷、适合自动化生产。且提纯后获得的目标产物纯度高，同时本发明适合自动化生产，具有很高的经济效益。

虽然以上描述了本实用新型的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本实用新型的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本实用新型的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本实用新型的权利要求所保护的范围内。