2‑乳酰氨基苯甲酸的制备方法与应用与流程

本发明属于药物合成和药理学领域，涉及2-乳酰氨基苯甲酸的制备方法与应用，具体涉及(R)-2-乳酰氨基苯甲酸(R-HPABA)和(S)-2-乳酰氨基苯甲酸(S-HPABA)的制备方法和新的医药用途。

背景技术：

众所周知，手性化合物虽然具有相同的物理化学性质，但它们的药效学、药代动力学(吸收、分布、代谢和排泄)甚至毒理学特性可能会不同，尤其这些过程涉及到与一些生物大分子(酶、载体、受体等)发生相互作用时，手性化合物的不同对映体可能会表现出不同的特点。

目前已有很多抗血栓药物被开发和应用，根据作用靶点及作用机制的不同分为抗血小板凝集药、抗凝血药和溶栓药。其中阿司匹林和氯吡格雷是临床公认用于治疗血小板凝集相关疾病的药物，如在治疗血栓和动脉粥样硬化方面疗效均较好。上述类似药物在抗血栓方面已有大量研究且已在临床上被长期应用，但存在治疗窗窄、出血风险、药物抵抗等副作用，同时其他意想不到的药物相互作用也一直是人们关注的焦点。

2-乳酰氨基苯甲酸是从微生物的代谢产物中提取分离得到的新化合物，并可以通过化学合成的方法得到，却没有像阿司匹林一样的胃肠道无刺激作用，有可喜的医疗用途。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供(R)-2-乳酰氨基苯甲酸和(S)-2-乳酰氨基苯甲酸的制备方法。

本发明的目的在于提供(R)-2-乳酰氨基苯甲酸和(S)-2-乳酰氨基苯甲酸的一种新的医疗用途。

本发明的目的还在于提供(R)-2-乳酰氨基苯甲酸和(S)-2-乳酰氨基苯甲酸一对手性对映体新的药理活性。

本发明的再一个目的在于提供(R)-2-乳酰氨基苯甲酸和(S)-2-乳酰氨基苯甲酸在制备抗血小板凝聚或抗血栓药物中的应用。

本发明提供了具有如下通式的苯甲酸类化合物：

式中，R₁＝—H；—Na；—(CH₂)_n—CH₃(n＝0～3)

R₂＝—H；—CH₃；—(CH₂)_n—CH₃(n＝0～2)

R₃＝—H；—F；—Cl；—Br

R₄＝—H；—F；—Cl；—Br

R₅＝—H；—F；—Cl；—Br。

具体地，本发明提供了如下结构的化合物(R)-2-乳酰氨基苯甲酸和(S)-2-乳酰氨基苯甲酸，英文名为R-/S-2-lactoylaminobenzoic acid：

所述(R)-2-乳酰氨基苯甲酸和(S)-2-乳酰氨基苯甲酸分别为：

本发明所提供的(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸，其合成方法具体步骤如下：

(a)L-乳酸(IIa)或D-乳酸(IIb)与乙酰氯(III)在无水四氢呋喃或者乙酸酐中作用得到中间体(IV)，反应温度和反应时间分别为10～40℃和2～15小时，L-乳酸(或D-乳酸)与乙酰氯物质的量比为0.3～0.5:1；

(b)中间体(IVa，IVb)与氯化亚砜作用得到中间体(Va，Vb)，反应温度和反应时间为40～80℃和1～4小时；

(c)中间体(Va，Vb)与邻氨基苯甲酸甲酯(VI)在无水乙醚条件下反应生成中间体(VIIa，VIIb)，两者物质的量比为1～3:5，反应温度10～40℃，反应时间1～24小时；

(d)中间体(VIIa，VIIb)与碳酸钾溶液在甲醇中反应得到中间体(VIIIa，VIIIb)，中间体(VIIIa，VIIIb)与氢氧化钠溶液在四氢呋喃中反应得到R-/S-HPABA(Ia，Ib)，反应温度15～35℃，反应时间1～20小时；或者中间体(VIIa，VIIb)与氢氧化钠溶液在四氢呋喃和甲醇中反应直接得到R-/S-HPABA(Ia，Ib)，反应温度10～40℃，反应时间1～24小时。

上述步骤(d)中，有两种方法可以得到2-乳酰氨基苯甲酸；两种方法所用有机溶剂均为四氢呋喃和甲醇，前者与碳酸钾溶液反应，物质的量比为1～2:5；后者与氢氧化钠溶液反应，物质的量比为1～2:5。

上述步骤(d)中，反应完全后用二氯甲烷萃取并用盐酸调节pH至1～4。

上述合成方法中，所涉及的原料、中间体及反应路线如下：

本发明中，所述的(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸具有显著的抗血小板凝集和抗血栓活性。且其制备原料来源广泛，成本不高，对胃无刺激作用，和阿司匹林相比具有较强优势，有十分喜人的应用前景。

附图说明

图1为(R)-2-乳酰氨基苯甲酸、(S)-2-乳酰氨基苯甲酸血小板毒性图。

图2为(R)-2-乳酰氨基苯甲酸、(S)-2-乳酰氨基苯甲酸对环氧酶-1(COX-1)活性影响图。

具体实施方式

以下以具体实施例更具体地说明本发明，但并不意味着限制本发明。

实施例1.(S)-2-乳酰氨基苯甲酸的化学合成制备

1.1试剂：L-乳酸、邻氨基苯甲酸甲酯、乙酰氯、氯化亚砜、四氢呋喃、无水乙醚、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯

1.2合成方法：

1.2.1中间体(IVa)的合成

取L-乳酸12.0g(133.3mmol)于250ml三口反应瓶中，加入无水四氢呋喃24ml，-10～0℃搅拌下滴加乙酰氯19.2ml(266.6mmol)后，室温搅拌5h，35℃减压浓缩得无色油状液体14.6g，收率83.2％。

1.2.2中间体(Va)的合成

取中间体(IVa)14.6g(110.6mmol)于250ml反应瓶中，加入氯化亚砜48ml，50℃反应2h，40℃减压浓缩得淡黄色油状液体15.6g，收率93.7％。

1.2.3中间体(VIIa)的合成

取邻氨基苯甲酸甲酯(VI)60.0g(395.8mmol)于500ml反应瓶中，加入无水乙醚150ml，-10～0℃搅拌下加入中间体(Ⅴa)15.6g(103.7mmol)，室温搅拌3h后，抽滤，滤液依次用盐酸、水、饱和氯化钠洗涤，减压浓缩得淡黄色结晶24.7g，收率89.9％。

1.2.4(S)-2-乳酰氨基苯甲酸(Ia)的合成

取中间体(VIIa)12.0g(45.28mmol)于250ml反应瓶中，加入甲醇60ml，室温滴加碳酸钾溶液后搅拌2h，乙酸乙酯150ml萃取3次，合并有机相，减压浓缩得中间体(VIIIa)，即2-乳酰胺基苯甲酸甲酯9.0g，收率89.1％，MS(ESI)：m/z＝223.0624；取中间体(VIIIa)9.0g(40.36mmol)于250ml反应瓶中，加入四氢呋喃60ml，室温滴加氢氧化钠溶液后搅拌1.5h，二氯甲烷150ml萃取3次，弃去二氯甲烷萃取液，水相用盐酸调节pH至1～4，静置析出结晶，抽滤，干燥，得2-乳酸氨基苯甲酸7.51g，收率88.9％。

取中间体(VIIa)12.7g(47.92mmol)于500ml反应瓶中，加入四氢呋喃60ml、甲醇40ml，室温滴加氢氧化钠溶液后搅拌3h，二氯甲烷200ml萃取3次，弃去二氯甲烷萃取液，水相用盐酸调节pH至1～4，静置析出结晶，抽滤，干燥，得S-2-乳酸氨基苯甲酸8.79g，收率87.8％。

表1.(S)-2-乳酰氨基苯甲酸¹H-NMR及¹³C-NMR谱

MS数据：对于该化合物来说，其高分辨质谱给出分子离子峰ESI-MS(positive ion mode):232.0582[M+Na]⁺，分子式：C₁₀H₁₁O₄N。

实施例2.(R)-2-乳酰氨基苯甲酸的化学合成制备

方法除L-乳酸替换成D-乳酸外，其余与1.2合成方法相同，按照S-2-乳酸氨基苯甲酸的合成方法，得到R-2-乳酸氨基苯甲酸8.50g，总收率52.9％。

实施例3.(R)-2-乳酰氨基苯甲酸、(S)-2-乳酰氨基苯甲酸抗血小板凝聚活性研究

3.1试剂

阿司匹林(ASP，纯度＞99.5％)，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸(自制，光学纯度＞99.3％)，(S)-2-乳酰氨基苯甲酸(自制，光学纯度＞98.8％)，二甲基亚砜(DMSO),二磷酸腺苷(ADP)，胶原(COLL)，花生四烯酸(AA)，血栓素B₂(TXB₂)酶联免疫检测试剂盒,6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)酶联免疫检测试剂盒，环氧酶-1(COX-1)酶联免疫检测试剂盒，乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒，羧甲基纤维素钠(CMC-Na)。

3.2实验动物

日本大耳白兔，雄性，SPF级，体重2-3kg，SCXK2014-0002。

KM小鼠，雄性，SPF级，体重18-22g，SCXK2015-0001。

SD大鼠，雄性，体重220-250g，SCXK2015-0001。

3.3实验方法

3.3.1抗血小板凝集

家兔耳缘静脉取血，用3.8％的枸橼酸钠抗凝(全血与抗凝剂体积比9:1)，室温下离心(500-800rpm/min,10min)制备富集血小板血浆(PRP)。分离出PRP后，再离心(3000rpm/min,10min)制备贫血小板血浆(PPP)，用PPP调0。取PRP200μL加入等摩尔浓度的R-/S-HPABA DMSO溶液5μL，空白对照组加等容积溶媒DMSO，温育2min后，以ADP20μL、AA 20μL、COLL 20μL为诱导剂，测定血小板聚集反应，对结果进行方差分析。

3.3.2血小板毒性试验

乳酸脱氢酶(LDH)被认为是细胞活力的一个指标，因此，本试验以测定LDH的释放量来评价(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸对血小板毒性。(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸(150μg/mL)与PRP孵育不同时间，按照说明书的要求，用LDH毒性检测试剂盒测定。LDH释放量的程度是以占最大释放量(0.3％的Triton X-100)的百分比表示的。

3.3.3出血时间测定

KM小鼠，随机分为8组，每组8只。分组如下：阿司匹林100mg/kg(阳性对照组)，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸低、中、高剂量组(50，100和200mg/kg)，CMC-Na(空白对照组)。灌胃给药，每天一次，连续给药7天。最后一次给药后1h，乌拉坦麻醉(1g/kg,i.p.)。从老鼠的尾尖切断约5mm的长度，并迅速插入37℃的生理盐水中。观察15min内从开始出血到再次出血所用的时间，并记录。

3.3.4凝血时间测定

实验分组和给药如1.3.3所示，于最后一次给药1h后，乌拉坦麻醉。用毛细管眼眶采血，滴两滴在干净载玻片的两端，开始计时，每隔30s用细针头挑一下，直到出现血丝停止计时，所需的时间即为凝血时间。

3.3.5血浆血栓素B₂(TXB₂)和6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)的测定

SD大鼠，随机分为8组，每组5只。分组如下：阿司匹林100mg/kg(阳性对照组)，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸低、中、高剂量组(50，100和200mg/kg)，CMC-Na(空白对照组)。灌胃给药，每天一次，连续给药7天。最后一次给药后1h，乌拉坦麻醉(1g/kg,i.p.)。腹主动脉取血，制备PRP，分析前放置于-20℃条件下保存。按照说明书的要求TXB₂和6-keto-PGF1α酶联免疫试剂盒测定其浓度。

3.3.6环氧酶-1(COX-1)活性的测定

SD大鼠，随机分为4组，每组5只。分组如下：阿司匹林100mg/kg(阳性对照组)，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸(200mg/kg)，CMC-Na(空白对照组)。灌胃给药，每天一次，连续给药7天。最后一次给药后1h，乌拉坦麻醉(1g/kg,i.p.)。腹主动脉取血，制备PRP，分析前放置于-20℃条件下保存。按照说明书的要求COX-1酶联免疫试剂盒测定其浓度。

3.4实验结果

3.4.1抗血小板凝集

实验结果见表2-4。

表2.R-/S-HPABA对ADP诱导的家兔血小板聚集作用

**P<0.01vs空白对照组

表3.R-/S-HPABA对COLL诱导的家兔血小板聚集作用

*P<0.05vs空白对照组

表4.R-/S-HPABA对AA诱导的家兔血小板聚集作用

*P<0.05vs空白对照组

从表2-4中可以看出，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸与对照组相比较有显著性差异，作用与阿司匹林的抗血小板凝聚作用相当，且两个对映体之间的作用没有显著性差异。

该发明实验结果表明，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸具有一定的抗血小板凝聚作用。

3.4.2 R-/S-HPABA对血小板毒性测定

实验结果见附图1，从图1中可知，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸与对照组相比较没有显著性差异，且两个对映体之间的作用没有显著性差异。

该发明实验结果表明，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸对血小板没有毒性，其抗血小板凝聚作用不是由于细胞毒性产生的。

3.4.3出血时间和凝血时间的测定

实验结果见表5。

表5.R-/S-HPABA对出血时间和凝血时间的影响

^*p<0.05vs.空白对照组

从表5中可以看出，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸与对照组相比较有显著性差异，作用与阿司匹林的作用相当，且两个对映体之间的作用没有显著性差异。

该发明实验结果表明，R-/S-2-乳酰氨基苯甲酸可使凝血时间延长，出血时间有所延长，但没有显著延长，因此，不会发生出血风险。

3.4.4血浆血栓素B₂(TXB₂)和6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)的测定

实验结果见表6。

表6.R-/S-HPABA对TXB₂和6-keto-PGF1α的影响

^*p<0.05vs.空白组.

从表6中可以看出，与空白组相比，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸显著抑制血栓素B₂的生成，增加6-酮-前列腺素F1α的生成。

3.4.5环氧酶-1(COX-1)活性的测定

实验结果见附图2，从图2中可知，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸和阿司匹林与对照组相比较能显著抑制COX-1的活性，且S-2-乳酰氨基苯甲酸的作用与阿司匹林作用相当，效果优于R-2-乳酰氨基苯甲酸。

该发明实验结果表明，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸的抗血小板凝聚作用可能是通过抑制环氧酶-1的活性，进一步抑制血栓素A₂(TXB₂的前体化合物)的生成。

实施例4.(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸抗血栓活性研究

4.1试剂

阿司匹林(ASP，纯度＞99.5％)，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸(自制，光学纯度＞99.3％)，(S)-2-乳酰氨基苯甲酸(自制，光学纯度＞98.8％)，羧甲基纤维素钠(CMC-Na)。

4.2实验动物

KM小鼠，雄性，SPF级，体重18-22g，SCXK2015-0001。

SD大鼠，雄性，体重220-250g，SCXK2015-0001。

4.3实验方法

4.3.1胶原-肾上腺素诱导的肺血栓

KM小鼠，随机分为8组，每组10只。分组如下：阿司匹林100mg/kg(阳性对照组)，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸低、中、高剂量组(50，100和200mg/kg)，CMC-Na(空白对照组)。灌胃给药，每天一次，连续给药7天。最后一次给药后1h，尾静脉注射胶原(500μg/kg)和肾上腺素(50μg/kg)混合液，诱导肺血栓。观察并记录15min内小鼠偏瘫、死亡或者恢复的数量。抑制率(％)＝((空白组死亡数量–给药组死亡数量)/空白组死亡数量)×100％。

4.3.2颈动脉血栓

SD大鼠，随机分为8组，每组5只。分组如下：阿司匹林100mg/kg(阳性对照组)，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸低、中、高剂量组(50，100和200mg/kg)，CMC-Na(空白对照组)。灌胃给药，每天一次，连续给药7天。最后一次给药后1h，乌拉坦麻醉(1g/kg,i.p.)。颈动脉穿线法诱导动脉血栓，手术3h后，剪下动脉血栓(约1cm)，滤纸吸干并沉重。抑制率(％)＝(A-A₁)/A×100％，A空白组血栓的湿重，A₁表示给药组血栓的湿重。

4.4实验结果

4.4.1胶原-肾上腺素诱导的肺血栓

实验结果见表7。

表7.R-/S-HPABA对胶原-肾上腺素诱导的肺血栓的影响

^*p<0.05vs.阿司匹林组。

^#p<0.05vs.相同浓度的S-HPABA。

从表7中可以看出，与空白组相比(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸能够显著提高肺血栓的恢复率。与阿司匹林相比，中、高剂量的(R)-2-乳酰氨基苯甲酸和高剂量的(S)-2-乳酰氨基苯甲酸作用优于阿司匹林，且中、高剂量的(R)-2-乳酰氨基苯甲酸作用大于相同浓度的S-2-乳酰氨基苯甲酸。

该发明实验结果表明，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸具有抗肺血栓的作用。其抗血栓作用可能是通过其抗血小板凝集作用产生的。

4.4.2颈动脉血栓

实验结果见表8。

表8.R-/S-HPABA对颈动脉血栓的影响

^*p<0.01vs.空白组。

从表8中可以看出，与空白组相比(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸能够显著抑制动脉血栓的的重量。作用与阿司匹林相当，且两对映体之间没有显著性差异。

该发明实验结果表明，(R)-2-乳酰氨基苯甲酸或(S)-2-乳酰氨基苯甲酸具有抗动脉血栓的作用。其抗血栓作用可能是通过其抗血小板凝集作用产生的。