一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法与流程

文档序号:12411332阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法,其特征在于,将已提取的骨髓用红细胞裂解液进行处理后分离获得骨髓单个核细胞,清洗后将所得的骨髓单个核细胞接种到预包被纤维连接蛋白的培养皿中利用完全培养基进行培养,培养一段时间后,利用胰蛋白酶消化细胞后,接种到培养瓶中进行差速贴壁培养和差速消化培养;

所述完全培养基,是在无血清培养基EGM2中添加胎牛血清、血管内皮生长因子、糖皮质激素、维生素C、上表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子,集落刺激因子和血小板源性生长因子后制成。

2.根据权利要求1所述的一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法,其特征在于,所述完全培养基是在无血清培养基中添加10%(V/V)胎牛血清FBS,8~12ng/mL血管内皮生长因子VEGF,0.4‰(V/V)糖皮质激素,1‰(V/V)维生素C,1‰(V/V)上表皮生长因子EGF,5ng/mL碱性成纤维细胞成长因子bFGF,2ng/mL集落刺激因子CSF,1‰(V/V)血小板源性生长因子PDGF。

3.根据权利要求1所述的一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法,其特征在于,步骤如下:

1)在无菌条件下提取小鼠股骨后,利用缓冲溶液将骨髓冲洗下来,获得骨髓原液;

2)按照体积比为骨髓原液:红细胞裂解液=1:5的比例向步骤1)所得的骨髓原液中加入红细胞裂解液进行处理,处理后获得骨髓单个核细胞溶液;

3)利用缓冲溶液清洗步骤2)所得骨髓单个核细胞溶液三次后,再将所得骨髓单个核细胞接种到预包被纤维连接蛋白的培养皿中利用完全培养基进行37℃恒温培养;

4)待细胞增长至约1×106/孔时,用胰蛋白酶消化细胞,重新接种至25cm的培养瓶中继续培养;

5)将步骤3)所得的细胞进行差速贴壁培养和差速消化培养。

4.根据权利要求3所述的一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法,其特征在于,步骤3)骨髓单个核细胞接种的密度是5×105/孔;所述培养皿的直径为60mm。

5.根据权利要求3所述的一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法,其特征在于,步骤3)所述完全培养基是在无血清培养基中添加10%(V/V)胎牛血清FBS,10ng/mL血管内皮生长因子VEGF,0.4‰(V/V)糖皮质激素,1‰(V/V)维生素C,1‰(V/V)上表皮生长因子EGF,5ng/mL碱性成纤维细胞成长因子bFGF,2ng/mL集落刺激因子CSF,1‰(V/V)血小板源性生长因子PDGF。

6.根据权利要求3所述的一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法,其特征在于,接种在培养皿后的骨髓单个核细胞在37℃的恒温培养箱中进行恒温培养,培养至细胞密度为1×106/孔后,用胰蛋白酶消化细胞,重新接种至25cm的培养瓶中继续培养。

7.根据权利要求6所述的一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法,其特征在于,所述胰蛋白酶的浓度为0.25%,消化时间为3min。

8.根据权利要求3所述的一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法,其特征在于,具体步骤如下:

1)将小鼠麻醉后,在无菌条件下取小鼠股骨,利用磷酸盐缓冲溶液将骨髓冲洗下来,获得骨髓原液;

2)按照体积比为骨髓原液:红细胞裂解液=1:5的比例加入红细胞裂解液,室温静置5min后,在1000rpm下离心5min后弃掉上清液获得骨髓单个核细胞;

3)利用磷酸盐缓冲溶液清洗步骤2)所得骨髓单个核细胞溶液三次后,再将所得骨髓单个核细胞按照5×105/孔的接种密度接种到预包被纤维连接蛋白的完全培养皿中在37℃下进行恒温培养,培养至细胞单个核细胞密度为1×106/孔后,在每个孔中加入1ml的0.25%胰酶消化处理3min,获得胰酶消化细胞;

4)将步骤3)所得的胰酶消化后的细胞转移至培养瓶中进行差速贴壁培养和差速消化培养。

9.权利要求1-8所述任一方法在制备治疗心脑血管疾病、外周血管疾病、肿瘤等疾病和创伤愈合药物中的应用。

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