无柄盘菌SC1337菌株和利用它制备三糖酯衍生物的方法与流程

本发明属于天然产物领域，具体涉及一种无柄盘菌(Pezicula sp.)SC1337菌株和利用它制备三糖酯衍生物的方法。

背景技术：

寡糖(oligosaccharides)是指由2～9个单糖单元经苷键结合而成低聚糖，根据结合的单糖个数，可分为双糖、三糖、四糖直至九糖。寡糖中有一些不能被人和动物消化吸收但具有特殊的生理学功能，被称为功能性寡糖。如水苏糖、棉籽糖、乳果糖、乳酮糖、异麦芽酮糖、低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚麦芽糖、低聚异麦芽糖、低聚异麦芽酮糖、大豆低聚糖、几丁寡糖、甘露寡糖、半乳甘露寡糖和低聚龙胆糖等，目前不少已作为添加剂广泛应用于食品领域。

当寡糖与脂肪酸缀合时形成寡糖酯，由于寡糖酯分子中同时具有亲油和亲水基团，是一类典型的非离子型生物表面活性剂。相比于离子型表面活性剂，糖酯往往具有更好的生物相容性、可生物降解性和安全性，是一类对环境友好的表面活性剂。目前糖酯已广泛地应用于食品、医药、发酵、化妆品、洗涤剂、化肥等领域。

常见三糖种类不多，如分布于甘蔗的棉子糖，龙胆根中的龙胆三糖，松柏分泌的松三糖和车前种子中的车前三糖，以及作为多糖部分水解产物的麦芽三糖等。而三糖酯的报道更为罕见。除了Smith 1997通过酶反应以海藻糖和α-甘露糖为底物合成了寡糖“6-O-α-甘露糖基海藻糖”外，没有人对海藻糖的6-O-β-L-甘露糖苷或其衍生物(包括糖酯)进行过研究，更没有关于其抗微生物(真菌)方面用途的报道。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种能产生五个对12种植物常见致病真菌有明显的抑制活性以及对水果具有保鲜效果的化合物的无柄盘菌(Pezicula sp.)SC1337。

本发明的无柄盘菌(Pezicula sp.)SC1337，其于2017年2月15日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(简称为GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼广东省微生物研究所，邮编510070)，保藏号为GDMCC No：60144。

所述的五个对12种植物常见致病真菌有明显的抑制活性以及对水果具有保鲜效果的化合物，它们都是三糖酯化合物，其糖基部分由海藻糖和海藻糖的6'位的β-L-甘露糖组成，海藻糖的2、3、4位分别与3个C5～C11的直链或支链脂肪酸相连，具体为化合物1、2、3、4和5，所述的化合物1的结构式如式1所示，化合物2的结构式如式2所示，化合物3的结构式如式3所示，化合物4的结构式如式4所示，化合物5的结构式如式5所示，

本发明的第二个目的是提供一种上述化合物1～5的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

所述的化合物1～5是从无柄盘菌(Pezicula sp.)SC1337的发酵培养物中分离得到的。

优选，具体步骤如下：

a、制备无柄盘菌SC1337的发酵培养物；

b、当发酵培养物为固体时，将发酵培养物用乙醇浸提，浸提液去除乙醇后用水制成混悬浮液，再用乙酸乙酯萃取得到萃取物，萃取物浓缩后得到乙酸乙酯提取物；或当发酵培养物为液体时，将发酵培养物用乙酸乙酯萃取得到萃取物，萃取物浓缩后得到乙酸乙酯提取物；

c、将乙酸乙酯提取物上硅胶柱，以体积比90:10～70:30的氯仿-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，用薄层层析检测合并相似的流份，收集薄层板上氯仿-甲醇体积比85:15展开时比移值0.3～0.4的流份A和比移值0.2～0.3的流份B；

将流份A进行反相硅胶柱层析，以体积分数88％的甲醇水溶液等度洗脱，收集主点集中的流份合并后在高效液相色谱以流动相为体积分数88％的甲醇水溶液纯化得到化合物5；

将流份B进行硅胶柱层析，以体积分数65％～85％的甲醇水溶液梯度洗脱，收集体积分数85％甲醇水溶液洗脱部分浓缩后在高效液相色谱以体积分数85％的甲醇水溶液为流动相分离纯化得到化合物1～4。

所述的制备无柄盘菌SC1337的发酵培养物是将无柄盘菌SC1337在小麦固体培养基上，黑暗中于24～28℃静置培养，得到固体发酵培养物，所述的小麦固体培养基由质量比1:1.5的小麦和水混合而成；或将无柄盘菌SC1337在大米固体培养基上，黑暗中于24～28℃静置培养10～30天，得到固体发酵培养物，所述的大米固体培养基由质量比1:1的大米和水混合而成；或将无柄盘菌SC1337在PDB液体培养基上，黑暗中于24～28℃摇床培养3～8天，得到液体发酵培养物，所述PDB培养基每升含马铃薯浸提物6g，葡萄糖20g，其余为水，pH 6.0～6.5。

本发明的第三个目的是提供无柄盘菌SC1337在制备化合物1、2、3、4或5中的应用。

本发明从落羽杉枝条内生菌中分离得到无柄盘菌SC1337，其能够产生五个对12种植物常见致病真菌有明显的抑制活性以及对水果具有保鲜效果的化合物，因此可以用其制备这五个对12种植物常见致病真菌有明显的抑制活性以及对水果具有保鲜效果的化合物，用于植物致病真菌的防治和水果的保鲜，具有广阔的应用前景。

无柄盘菌(Pezicula sp.)SC1337于2017年2月15日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(简称为GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼广东省微生物研究所，邮编：510070)，保藏号为GDMCC No：60144。

附图说明：

图1是无柄盘菌(Pezicula sp.)SC1337的菌落形态。

图2是无柄盘菌(Pezicula sp.)SC1337菌丝和孢子形态。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：无柄盘菌(Pezicula sp.)SC1337及其菌种鉴定

本发明的无柄盘菌(Pezicula sp.)SC1337是从华南植物园的落羽杉枝条内生菌中分离获得，分离方法为：将采集好的落羽杉枝条样品经75％乙醇表面消毒30s，再经质量分数10％次氯酸钠消毒3min，无菌水冲洗3遍后晾干，接种至PDA培养基上，放至28℃培养箱培养5d，用无菌牙签挑取目标菌落即得，所述PDA培养基每升含马铃薯浸提物6g，葡萄糖20g，琼脂20g，其余为水，pH 6.0～6.5，由此分离得到无柄盘菌(Pezicula sp.)SC1337。该菌株在PDA培养基上生长较慢，培养10d后，菌落平均直径不到4cm，边缘整齐，气生菌丝旺盛且较为疏松，呈绒毛状；菌落正面中央呈灰褐色且略带墨绿色，边缘为灰白色；菌落背面中央呈黑褐色，边缘为浅灰色稍带墨绿色；无渗出液，可溶性色素缺乏。菌丝宽2～3μm，颜色略呈淡褐色，分枝，有隔；孢子长椭圆形，淡褐色，光滑，大小为14～22×4～6μm，菌落形态和菌丝(含孢子)的形态如图1和图2所示。菌丝体以经典的CTAB法提取得到DNA，通过以ITS4(5’-3’)：TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC和ITS5(5’-3’)：GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G为引物，在10×PCR buffer 5μL，Mg²⁺(25mM)4μL，dNTPs(10mM)1μL，Primers(10μM/each)2μL，Taq酶(5U/μL)0.3μL，模板DNA(10ng/μL)5μL，ddH₂O 32.7μL的体系中，在94℃5min，94℃40s，57-52℃1min，72℃1min，cycles 35，72℃6min程序下进行PCR扩增后，经测序得到的DNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。测序结果在Genbank数据库用Blast进行检索和同源性比较，其ITS序列片段(共917bp)同源性与Pezicula cinnamomea的同源性最高，ITS相似性为96％。因此将此菌命名为：无柄盘菌(Pezicula sp.)SC1337，于2017年2月15日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(简称为GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼广东省微生物研究所，邮编510070)，保藏号为GDMCC No：60144。

实施例2：5种三糖酯衍生物的制备及其理化和波谱数据

将无柄盘菌(Pezicula sp.)SC1337在小麦固体培养基(质量比1:1.5的小麦和水混合组成)上，黑暗中于28℃静置培养12d，得到固体发酵培养物。

将固体发酵培养物(3.6L)用等体积的体积分数95％乙醇水溶液浸泡三次，每次48h，浸泡液合并后过滤，然后减压浓缩除去乙醇，并加水定容至1L，再用等体积乙酸乙酯萃取3次，将得到的乙酸乙酯萃取物合并后，再浓缩得到乙酸乙酯提取物17.6g。

乙酸乙酯提取物上硅胶柱(硅胶为100～200目，300g)，以体积比90:10～70:30的氯仿-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，用薄层层析(硅胶板)检测合并相似的流份，收集薄层板上氯仿-甲醇体积比85:15展开时比移值0.3～0.4的流份，减压浓缩得流份A 1.69g，和比移值0.2～0.3的流份，减压浓缩得流份B 8.50g；

将流份A进行反相硅胶柱层析(Develosil ODS，75μm，150g，日本富士化学公司产品)，以体积分数88％的甲醇水溶液等度洗脱，收集主点集中的流份，合并后在高效液相色谱(LC-6AD型半制备高效液相色谱仪，RID-10A检测器，日本Shimadzu公司生产；层析柱为Shim-pack PRC-ODS，10×250mm，4.5μm)以体积分数88％的甲醇水溶液为流动相，流速为5ml/min，纯化得到白色粉末化合物5(0.030g，t_R＝60min)。

取流份B 1.0g进行反相硅胶柱层析(Develosil ODS，75μm，150g)，以体积分数65％～85％的甲醇水溶液梯度洗脱，收集85％洗脱部分浓缩后经高效液相色谱(仪器和层析柱同前)，以体积分数87％的甲醇水溶液为流动相，流速为5ml/min，分离纯化得到四个白色粉末物质，分别为化合物1(0.122g，t_R＝55min)，化合物2(0.120g，t_R＝45min)，化合物3(0.010g，t_R＝33min)和化合物4(0.022g，t_R＝28min)。

化合物1，白色粉末，分子式为C₄₁H₇₂O₁₉，正离子HRESIMS m/z 891.4552[M+Na]⁺(calcd for C₄₁H₇₂O₁₉Na,891.4560)，正离子ESIMS m/z 891[M+Na]⁺，907[M+K]⁺；负离子ESIMS m/z 867[M－H]^－，903[M+Cl]^－。¹H NMR和¹³C NMR(溶剂：氘代甲醇)的数据见表1。通过以上光谱数据和二维核磁共振方法鉴定化合物1为6-O-β-L-甘露糖基-3-O-(2-甲基丁酰)-4-O-(8-甲基癸酰)-2-O-(4-甲基己酰)海藻糖，其结构式如式1所示。

其中化合物2，白色粉末，分子式为C₄₀H₇₀O₁₉，正离子HRESIMS m/z 877.4411[M+Na]⁺(calcd for C₄₀H₇₀O₁₉Na,877.4404)，正离子ESIMS m/z 877[M+Na]⁺；负离子ESIMS m/z 853[M－H]^－，889[M+Cl]^－。¹H NMR和¹³C NMR(溶剂：氘代甲醇)的数据见表1。通过以上光谱数据和二维核磁共振方法鉴定化合物2为4-O-癸酰-6-O-β-L-甘露糖基-3-O-(2-甲基丁酰)-2-O-(4-甲基己酰)海藻糖，其结构式如式2所示。

其中化合物3，白色粉末，分子式为C₃₉H₆₈O₁₉，正离子HRESIMS m/z 863.4255[M+Na]⁺(calcd for C₃₉H₆₈O₁₉Na,863.4247)，正离子ESIMS m/z 863[M+Na]⁺；负离子ESIMS m/z 839[M－H]^－，875[M+Cl]^－。¹H NMR和¹³C NMR(溶剂：氘代甲醇)的数据见表1。通过以上光谱数据和二维核磁共振方法鉴定化合物3为6-O-β-L-甘露糖基-3-O-(2-甲基丁酰)-2-O-(4-甲基己酰)-4-O-(6-甲基辛酰)海藻糖，其结构式如式3所示。

其中化合物4，白色粉末，分子式为C₃₈H₆₆O₁₉，正离子HRESIMS m/z 849.4088[M+Na]⁺(calcd for C₃₈H₆₆O₁₉Na,849.4091)，正离子ESIMS m/z 849[M+Na]⁺；负离子ESIMS m/z 825[M－H]^－。¹H NMR和¹³C NMR(溶剂：氘代甲醇)的数据见表2。通过以上光谱数据和二维核磁共振方法鉴定化合物4为6-O-β-L-甘露糖基-3-O-(2-甲基丁酰)-2-O-(4-甲基己酰)-4-O-辛酰海藻糖，其结构式如式4所示。

其中化合物5，白色粉末，分子式为C₄₃H₇₄O₂₀，正离子ESIMS m/z 933[M+Na]⁺，949[M+K]⁺；负离子ESIMS m/z 909[M－H]^－，945[M+Cl]^－。¹H NMR和¹³C NMR(溶剂：氘代甲醇)的数据见表2。通过以上光谱数据和二维核磁共振方法鉴定化合物5为6-O-β-L-甘露糖基-3-O-(2-甲基丁酰)-4-O-(8-甲基癸酰)-2-O-(4-甲基己酰)-6'-O-乙酰基海藻糖，其结构式如式5所示。

表1化合物1～3的¹H和¹³C NMR数据

*相应位置的暂定信号可以互换

表2化合物4和5的¹H和¹³C NMR数据

*相应位置的暂定信号可以互换

实施例3：实施例2得到的三糖酯(化合物1～5)的对植物常见12种科属的致病真菌的体外抑制活性试验

所用测试菌种包括：1)Alternaria solani番茄早疫病菌；2)Botryospuaeria berengeriana苹果轮纹病菌；3)Botrytis cinerea番茄灰霉病菌；4)Colletotrichum gloeosporioides芒果炭疽病菌；5)Curvularia lunata香蕉新月弯孢霉；6)Fusarium oxysporium香蕉、西瓜枯萎病菌；7)Geotrichum citri-aurantii柑橘白地霉病菌；8)Helminthosporium maydis玉米小斑病菌；9)Penicillium italicum柑橘青霉病菌；10)Peronophythora litchii荔枝霜疫霉菌；11)Rhizoctonia solani水稻纹枯病菌；12)Ustilaginoidea virens稻曲病菌。

以滤纸片琼脂扩散法测定化合物1～5的抗真菌活性：将活化好的测试菌分别接种到装有PDA固体培养基的培养皿中，用T型涂布器涂均匀备用；待测试样品以甲醇溶解，配成50mg/mL，实验时取10μL滴加到滤纸片(直径为6mm)上，于超净工作台上晾干，使每滤纸片最终含有样品500μg，然后将滤纸片贴放于上述培养皿中，28℃黑暗条件下培养72或96h后测量抑菌宽度(抑菌宽度为抑菌圈平均直径)，以加入等体积甲醇的滤纸片作阴性对照。

结果显示三糖酯提取物和化合物1～5均可以抑制以上各种植物真菌的生长，结果见表3，抑菌圈宽度为10～22mm。上述三糖酯提取物为含有化合物1～4的混合物，其中化合物1、2、3、4质量比约为60:35:4:1。

表3三糖酯提取物和化合物1～5对12种植物致病真菌的体外抑制活性

实施例4：实施例2得到的三糖酯提取物对采后柑橘贮藏中保鲜实验

供试样品：实施例2得到的三糖酯提取物(含化合物1、2、3、4质量比约为60:35:4:1，由这四种化合物混合而成)以少量乙醇溶解，用水稀释为200、400、600mg/L作为处理溶液。

将柑橘果实在处理溶液中浸泡5min，晾干后，将果实置于经75％酒精表面灭菌晾干的塑料筐中，用0.02mm的聚乙烯薄膜袋包装密封，于25℃贮藏15天，观察并记录其感病指数，感病指数计算方法为：0为无明显感染；1为轻微感染；2为感染面积为果实的≤1/4；3为感染面积为果实的1/4-1/2；4为感染面积≥1/2，感病指数＝∑(感病等级×相应果实数量)/(5×果实总数量)×100％。每处理设3个重复，每重复用果约60个。

供试水果：砂糖橘采自从化果园。

实验结果如表4所示。该三糖酯提取物对采后柑橘贮藏过程中的真菌发生发展有明显的抑制作用，优于常用化学抗真菌剂福美双，与特克多相当，具有明显的防腐保鲜作用。该三糖酯提取物的抑菌保鲜效果略差于化学抗真菌剂百可得，但百可得由于毒性较高，2004年起即被欧盟禁止使用。

表4三糖酯提取物对采后柑橘果实贮藏中对致病真菌的抑制活性

序列表

<110> 中国科学院华南植物园

<120> 无柄盘菌SC1337菌株和利用它制备三糖酯衍生物的方法

<160> 1

<210> 1

<211> 917

<212> DNA

<213> 无柄盘菌（Pezicula sp.）SC1337

<400> 1

CGAGGTCACC TTGATAGATT GGGGGTTGCT GGCCAGCATC CGCCGGGCGT CTGTAGCGAG 60

AGTATGTACT ACGCTTAGAG CCAGACGGCG CCGCCACTGA TTTTAAGGCA CACCGGGACC 120

GGTGACGCCC AAGACCAAGC AGAGCTTGAG GGTGTAATGA CGCTCGAACA GGCATGCCCC 180

CCGGAATACC AAGGGGCGCA ATGTGCGTTC AAAGATTCGA TGATTCACTG AATTCTGCAA 240

TTCACATTAC TTATCGCATT TCGCTGCGTT CTTCATCGAT GCCAGAACCA AGAGATCCGT 300

TGTTGAAAGT TTTAACTATT ATATAGTACT CAGACGACAC TGACATTCAG GTTTGGGAGT 360

CCTCTGGCGG GCGCGCCCTA GCCGGAGCCA GGGGCAGGGC CGGAGCCCCG CGGCCCGCCA 420

AAGCAACAAA GGTATAACGA CACAGGGTGG GAGGTCTACC CGAAGGGCAG AGTCTCTGTA 480

ATGATCCCTC CGCAGGTTCA CCTACGGAGC GGTTTACGTT CTTGCGAATC CCCAGCACGT 540

TTCCGCGCCG GCCCGACTAT ATCTTAAGCA GGAGAACCTC CTACCCACAA CCACTTAGTC 600

TGTGAACGTT CCCCTGGTCT AGGGGCTTCG CTGCGGATCG TCCATTCCAG CACCTGACTG 660

GATCCTCCGG GGTTGTTACT CTACCCTGTG CAGTTAACAC AGGCCCCTAC TGCATCCCTA 720

CAGTAGGTTA GTACCCAGAG GCTTTAGGAC TTCCCCGCAA TTCGATCGTG TTGCAACTCC 780

GCCGTTGGGC GTCGTCACTT GCGTGCCTCC TTATTTAGAG TCGCGAGAGC CCCCTTTCGG 840

GGTGCAAAGG CTTCCTCAAG TTCGCTGCAG AGAGATCACT GCTCTACGGA GACCTTGTAC 900

TTTTTTTTAT TACTTCC 917