一种具有清除自由基效果的苯并异呋喃类化合物及其制备方法与应用与流程

本发明属于植物化学技术领域，具体涉及一种从烟草中首次提取得到的苯并异呋喃类化合物及其提取方法。同时，本发明化合物具有较好的抗氧化活性，在卷烟中应用能有效的清除卷烟烟气自由基。

背景技术：

烟草属草茄科烟草一年生或有限多年生草本植物，其中以烟草N.tabacum L.栽培最广，其成熟的叶片是卷烟工业的重要原料，是一种经济价值较高的作物。烟草除主要用于吸食外，还有其它较为广泛的用途。同时，烟草是世界上化学成分最为复杂的植物，次生代谢产物非常丰富，经过几十年的研究，人们目前从烟草中鉴定出来的单体化学物质就超过3000多种，而且还有许多成分尚未鉴定出来。

研究表明，除蛋白质、氨基酸、糖、磷、钙、钾等常规化学成分外，烟草中还含有大量次生代谢产物，化合物类型包括黄酮、香豆素、单宁、呋喃、苯并异呋喃、苯丙素、萜类、生物碱等。这些化合物具有多种生物活性，在抗菌、消炎、抗突变、降压、清热解毒、镇静、利尿、抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪酶等多个方面具有显著效果。呋喃类化合物属于杂环类，在天然植物中也有广泛存在该类化合物的文献报道。除具有广泛的药理作用外，呋喃还是一类重要的香气化合物，天然存在于各种水果和香料植物中，该类化合物现已广泛用于各种饮料、焙烤食品等食用香精的配方中。

本发明从烟草中分离得到了一种苯并异呋喃类化合物，活性研究表明该化合物具有较好的抗氧化活性，尤其是将其用作烟草添加剂，具有很好的清除自由基抗氧化活性的效果，对提高卷烟品质具有积极意义。目前烟草中发现苯并异呋喃类化合物的清除卷烟烟气自由基效果还未见相关文献报道过。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种苯并异呋喃类化合物；第二目的在于提供所述苯并异呋喃类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述苯并异呋喃类化合物的应用，主要用于清除卷烟主流烟气中的自由基。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一目的是这样实现的，一种具有清除自由基效果的苯并异呋喃类化合物是从烟草中分离得到，其分子式为C₁₃H₁₄O₂，结构如式(I)所示：

该化合物为浅黄色胶状物，命名为：6,8-二氢-2,2-二甲基-2H-呋喃[3,4-g]色烯，英文名为：6,8-dihydro-2,2-dimethyl-2H-furo[3,4-g]chromene。

本发明的第二目的是这样实现的，上述具有清除自由基效果的苯并异呋喃类化合物的制备方法，是以烟草为原料，依次经浸膏提取、有机溶剂萃取、MCI脱色、硅胶柱层析和高效液相色谱分离步骤制得，具体为：

A、浸膏提取：将烟草粉碎到20～40目，用5～10倍烟草重量的溶剂超声提取2～5次，每次30～60分钟，合并提取液并过滤，滤液减压浓缩至原体积的1/4，静置，滤除沉淀物，之后将所得滤液减压浓缩成浸膏a；

B、有机溶剂萃取：向浸膏a中加入重量是浸膏a重量1～2倍的水，然后用与水等体积的有机溶剂萃取3～5次，合并有机溶剂萃取相，之后将合并得到的有机溶剂萃取相减压浓缩成浸膏b；

C、MCI脱色：向浸膏b中加入是浸膏b重量3～5倍的体积浓度为50～100％甲醇水溶液，待浸膏b完全溶解后，上MCI柱，用体积浓度为90％-95％甲醇水溶液进行洗脱，合并洗脱液，之后将合并后的洗脱液减压浓缩成浸膏c；

D、硅胶柱层析：将浸膏c上硅胶柱层析，装柱硅胶为160～200目，用量为浸膏c重量6～10倍量；以体积比为1:0～0:1的氯仿和丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并减压浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；

E、高效液相色谱分离：将体积比为7:3的氯仿-丙酮洗脱得到的洗脱液，经高效液相色谱分离纯化，即得所述的苯并异呋喃类化合物。

进一步，优选的是，所述A步骤的溶剂为体积浓度为70～100％的丙酮水溶液、体积浓度为90～100％的乙醇水溶液或体积浓度为90～100％的甲醇水溶液。

进一步，优选的是，所述B步骤的有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙醚或石油醚。

进一步，优选的是，所述D步骤中浸膏c在经硅胶柱层析前，先用重量是浸膏c 1.5～3倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏c 0.8～1.2倍的80～100目硅胶拌样，之后上样。

进一步，优选的是，所述D步骤中，梯度洗脱时，所使用的氯仿和丙酮混合有机溶剂的体积比依次为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1，每个梯度洗脱到TLC点板无点后(即该梯度洗脱不出物质后)，更换下一梯度洗脱。

进一步，优选的是，所述E步骤的高效液相色谱分离纯化是以体积浓度为40％的甲醇水溶液为流动相，流速15～25ml/min，以21.2×250mm，5μm的Zorba x PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为278nm，每次进样10～100μL，收集41.6min的色谱峰，多次累加后蒸干。

以上述方法制备得到的苯并异呋喃类化合物的结构通过以下方法进行测定：

本发明化合物为浅黄色胶状物；

HRESI-MS显示其准分子离子峰为225.0898[M+Na]⁺(计算值225.0891)，结合¹H NMR和DEPT谱确定其分子式为C₁₃H₁₄O₂，不饱和度为7。

红外光谱中显示了芳环(1610、1561和1472cm^-1)的共振吸收峰。而紫外光谱在210、240、278nm有最大吸收也说明了化合物中可能存在芳环结构。

化合物的¹H和¹³C NMR谱(如表1、图1和图2)显示其含有13个碳和14个氢，包括1个1,2,4,5-四取代的苯环(C-4～C-7、C-4a和C-7a，H-7)，1个谐二甲基色烯环(C-1'～C-5'，H-1'、H-2'和H₆-4',5')，两个氧化的亚甲基(C-1和C-3；H₂-1和H₂-3)。进一步分析其HMBC相关信号，根据H₂-1和C-3、C-4a、C-7、C-7a；H₂-3和C-1、C-4、C-4a、C-7a；H-4和C-3、C-4a、C-7a；以及H-7和C-1、C-4a、C-7a的HMBC相关(如图3)可推测化合物为苯并异呋喃类结构。

化合物的HMBC谱中可观察到H-1'和C-4、C-5、C-6；H-2'和C-5，以及H-4和C-1'的远程相关，可推测谐二甲基色烯环取代在化合物的C-5和C-6位，并且C-1'位碳连接在苯环的C-4位。

至此，化合物的结构得到确定，并命名为：6,8-二氢-2,2-二甲基-2H-呋喃[3,4-g]色烯。

化合物的红外、紫外和质谱数据：UV(甲醇)，λ_max(logε)278(3.82)、240(3.68)、210(4.05)nm；IR(溴化钾压片)：ν_max 3080、2918、1610、1561、1472、1328、1275、1147、1051、864cm^-1；¹H NMR和¹³C NMR数据(500和125MHz，CDCl₃)，见表1；正离子模式ESIMS m/z 225[M+Na]⁺；正离子模式HRESIMS m/z 225.0898[M+Na]⁺(计算值C₁₃H₁₄NaO₂，225.0891)。

表1.本发明化合物的¹H NMR和¹³C NMR数据(CDCl₃)

本发明的第三目的是这样实现的：

本发明苯并异呋喃类化合物作为制备抗氧化剂的应用。

对本发明化合物进行了抗氧化活性测试，抗氧化活性以清除DPPH自由基能力的大小表示；以50μg/mL的乙醇溶液为初筛浓度，测定其清除脂性自由基DPPH的活性。取一块costar 96孔板，加入新鲜配制的DPPH乙醇溶液(浓度为6.5×10⁵mol/L)190μL/孔，加入本发明化合物样品l0μL/孔，空白孔加l0μL生理盐水，充分混匀，用封板膜封板后室温下避光静置30分钟，于UV2401分光光度计上测定仪上测定各孔吸光度值，测定波长为517nm；样品对脂性自由基DPPH清除率按下式计算:

DPPH清除率(％)＝(A_空白-A_样品)/A_空白×100％

A_空白：空白对照组吸光度值；A_样品：加样品组吸光度值。

样品平行5次检测，计算半数清除浓度IC50测定结果为4.36μg/L，表明本发明化合物具有良好的抗氧化活性和清除自由基活性。

同时提供本发明苯并异呋喃类化合物在清除卷烟烟气中的自由基中的应用。

对本发明化合物进行了清除卷烟烟气自由基效果的测试：

卷烟的叶组为：上部烟叶为15％，中部烟叶为48％，下部烟叶为23％，膨胀梗丝8％，烟草薄片6％；采用醋酸纤维嘴棒，嘴棒成型纸透气度为4500CU；卷烟纸克重为50g/m²、透气度为80CU，水松纸透气度为200CU。成品卷烟烟支的重量为0.93±0.02g，圆周为24.5mm，长度为84mm(其中嘴棒长度为25mm)。

试验化合物(本发明苯并异呋喃类化合物)用香精注射机均匀添加到卷烟过滤嘴丝束中，每支卷烟添加量为0.5～5.0mg，并以未添加试验化合物的卷烟为对照。

卷烟用RM200型20孔道自动吸烟机在标准条件下吸烟，主流烟气粒相物用44mm剑桥滤片捕集，气相部分用采样管捕集；粒相自由基用0.05mol/L N-特丁基-α-苯基氮硐的苯溶液为萃取剂从剑桥滤片溶出，并洗涤剑桥滤片，定容得粒相自由基测试液。气相自由基用自由基采样管，以0.05mol/L N-特丁基-α-苯基氮硐的苯溶液为吸收剂采集，卷烟抽吸完后取出气相自由基采样管，同时用少量吸收剂分3次冲洗通气内管外部和采样管内壁，合并吸收液和洗涤液，得气相自由基样品液。

用顺磁共振仪测定自由基，ESR分析实验条件：中心磁场＝3.385T，扫宽＝0.500T，微波频率＝1.5GHz，扫描时间＝2min，扫描次数＝5，放大倍数＝10³～10⁵(根据峰高进行调整)，样品用量20μL；根据ESR图谱中峰面积计算气相及粒相自由基数量的变化。

实验结果表明：进行5次实验，和对照样相比，添加本发明化合物的卷烟气相自由基降低率为16～24％，粒相自由基降低率在18～25％之间，该化合物对卷烟主流烟气中的自由基具有确切的清除效果。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明苯并异呋喃类化合物是首次从烟草中被分离出来的，通过核磁共振和质谱测定方法确定了为苯并异呋喃类化合物，并表征了其具体结构。试验证明本发明化合物具有良好的抗氧化活性和清除自由基活性。

附图说明

图1为本发明苯并异呋喃类化合物的核磁共振碳谱(¹³C NMR)；

图2为为本发明苯并异呋喃类化合物的核磁共振氢谱(¹H NMR)；

图3为本发明苯并异呋喃类化合物的关键HMBC相关图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

本发明所述的苯并异呋喃类化合物，是从烟草中分离得到，其分子式为C₁₃H₁₄O₂，具有下述结构：

化合物命名为：6,8-二氢-2,2-二甲基-2H-呋喃[3,4-g]色烯，英文名为：6,8-dihydro-2,2-dimethyl-2H-furo[3,4-g]chromene。

本发明所述苯并异呋喃类化合物的制备方法，是以烟草原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、MCI脱色、硅胶柱层析和高效液相色谱分离步骤制得，具体为：

A、浸膏提取：将烟草粉碎到20～40目，用5～10倍烟草重量的溶剂超声提取2～5次，每次30～60分钟，合并提取液并过滤，滤液减压浓缩至原体积的1/4，静置，滤除沉淀物，之后将所得滤液减压浓缩成浸膏a；

B、有机溶剂萃取：向浸膏a中加入重量是浸膏a重量1～2倍的水，然后用与水等体积的有机溶剂萃取3～5次，合并有机溶剂萃取相，之后将合并得到的有机溶剂萃取相减压浓缩成浸膏b；

C、MCI脱色：向浸膏b中加入是浸膏b重量3～5倍的体积浓度为50～100％甲醇水溶液，待浸膏b完全溶解后，上MCI柱，用体积浓度为90％-95％甲醇水溶液进行洗脱，合并洗脱液，之后将合并后的洗脱液减压浓缩成浸膏c；

D、硅胶柱层析：将浸膏c上硅胶柱层析，装柱硅胶为160～200目，用量为浸膏c重量6～10倍量；以体积比为1:0～0:1的氯仿和丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并减压浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；

E、高效液相色谱分离：将体积比为7:3的氯仿-丙酮洗脱得到的洗脱液，经高效液相色谱分离纯化，即得所述的苯并异呋喃类化合物。

所述A步骤的溶剂为体积浓度为70～100％的丙酮水溶液、体积浓度为90～100％的乙醇水溶液或体积浓度为90～100％的甲醇水溶液。

所述B步骤的有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙醚或石油醚。

所述D步骤中浸膏c在经硅胶柱层析前，先用重量是浸膏c 1.5～3倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏c 0.8～1.2倍的80～100目硅胶拌样，之后上样。

所述D步骤中，梯度洗脱时，所使用的氯仿和丙酮混合有机溶剂的体积比依次为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1。

所述E步骤的高效液相色谱分离纯化是以体积浓度为40％的甲醇水溶液为流动相，流速15～25ml/min，以21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为278nm，每次进样10～100μL，收集41.6min的色谱峰，多次累加后蒸干。

本发明所述的烟草不受地区和品种限制，均可以实现本发明。

实施例1

取干燥的烟草4.4kg，粗粉碎至30目，用10倍烟草重量的70％的丙酮水溶液超声提取4次，每次60分钟，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至原体积的1/4；静置，滤除沉淀物，减压浓缩成120g的浸膏a；

在浸膏a中加入240g水，用与水等体积的氯仿萃取5次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成80g浸膏b；

在浸膏b中加入240g的甲醇溶解，待浸膏b完全溶解后，上MCI柱，用6升体积浓度为90％甲醇水溶液洗脱，合并洗脱液，减压浓缩得到62g浸膏c；

在浸膏c中加入93g的丙酮溶解，然后加入100目硅胶62g拌样，拌样后，用200目硅胶372g装柱；所使用的氯仿和丙酮混合有机溶剂的体积比依次为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1，每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱，收集梯度洗脱液、减压浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分A-F，其中，对收集到的样品D(7:3)部分12g，再以40％的甲醇为流动相，流速25ml/min，21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为278nm，每次进样10μL，收集41.6min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述苯并异呋喃类化合物。

实施例2

取干燥的烟草10kg，粗粉碎至40目，用5倍烟草重量的的甲醇超声提取5次，每次30分钟，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至原体积的1/4；静置，滤除沉淀物，减压浓缩成300g浸膏a；

在浸膏a中加入350g水，用与水等体积的二氯甲烷萃取3次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成210g浸膏b；

在浸膏b中加入630g的体积浓度为50％甲醇水溶液溶解，待浸膏b完全溶解后，上MCI柱，用10升体积浓度为95％甲醇水溶液洗脱，合并洗脱液，减压浓缩得到150g浸膏c；

浸膏c中加入300g的丙酮溶解，然后加入80目硅胶180g拌样，用180目硅胶1500kg装柱，拌样后上柱；所使用的氯仿和丙酮混合有机溶剂的体积比依次为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1，每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱，收集梯度洗脱液、减压浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分A-F，其中，对收集到的样品D(7:3)部分32g，再以40％的甲醇为流动相，流速15ml/min，21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT G F反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为278nm，每次进样80μL，收集41.6min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述苯并异呋喃类化合物。

实施例3

取干燥的烟草15kg，粗粉碎至20目，用8倍烟草重量的90％的甲醇水溶液超声提取2次，每次45分钟，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至原体积的1/4；静置，滤除沉淀物，减压浓缩成460g浸膏a；

在浸膏a中加入460g水，用与水等体积的乙酸乙酯萃取4次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成300g浸膏b；

在浸膏b中加入1500g的体积浓度为85％甲醇水溶液溶解，待浸膏b完全溶解后，上MCI柱，用15升体积浓度为93％甲醇水溶液洗脱，合并洗脱液，减压浓缩得到150g浸膏c；

浸膏c中加入450g的甲醇溶解，然后加入100目硅胶120g拌样，用160目硅胶1.2kg装柱，拌样后上柱；所使用的氯仿和丙酮混合有机溶剂的体积比依次为20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1，每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱，收集梯度洗脱液、减压浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分A-F，其中，对收集到的样品D(7:3)部分32g，再以40％的甲醇为流动相，流速20ml/min，21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT G F反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为278nm，每次进样100μL，收集41.6min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述苯并异呋喃类化合物。

实施例4

实施例4与实施例3的区别在于，超声提取时，所用溶剂为95％乙醇水溶液。萃取时，采用的有机溶剂为乙醚。

实施例5

实施例5与实施例3的区别在于，超声提取时，所用溶剂为90％丙酮水溶液。萃取时，采用的有机溶剂为石油醚。

实施例6

实施例1制备得到的苯并异呋喃类化合物的结构通过以下方法进行测定；本发明化合物为浅黄色胶状物；HRESI-MS显示其准分子离子峰为225.0898[M+Na]⁺(计算值225.0891),结合¹H NMR和DEPT谱确定其分子式为C₁₃H₁₄O₂，不饱和度为7。红外光谱中显示了芳环(1610、1561和1472cm^-1)的共振吸收峰。而紫外光谱在210、240、278nm有最大吸收也说明了化合物中可能存在芳环结构。化合物的¹H和¹³C NMR谱(表1、图1和图2)显示其含有13个碳和14个氢，包括1个1,2,4,5-四取代的苯环(C-4～C-7、C-4a和C-7a，H-7)，1个谐二甲基色烯环(C-1'～C-5'，H-1'、H-2'和H₆-4',5')，两个氧化的亚甲基(C-1和C-3；H₂-1和H₂-3)。进一步分析其HMBC相关信号，根据H₂-1和C-3、C-4a、C-7、C-7a；H₂-3和C-1、C-4、C-4a、C-7a；H-4和C-3、C-4a、C-7a；以及H-7和C-1、C-4a、C-7a的HMBC相关(图3)可推测化合物为苯并异呋喃类结构。化合物的HMBC谱中可观察到H-1'和C-4、C-5、C-6；H-2'和C-5，以及H-4和C-1'的远程相关，可推测谐二甲基色烯环取代在化合物的C-5和C-6位，并且C-1'位碳连接在苯环的C-4位。至此，化合物的结构得到确定，并命名为化合物命名为：6,8-二氢-2,2-二甲基-2H-呋喃[3,4-g]色烯。

实施例7

取实施例2-5制备的化合物，为浅黄色胶状物。测定与实施例6相同，确认实施2-5制备的化合物为所述苯并异呋喃类化合物——6,8-二氢-2,2-二甲基-2H-呋喃[3,4-g]色烯。

实施例8

对化合物进行了抗氧化活性测试，抗氧化活性以清除DPPH自由基能力的大小表示；以50μg/mL的乙醇溶液为初筛浓度，测定其清除脂性自由基DPPH的活性。取一块costar 96孔板，加入新鲜配制的DPPH乙醇溶液(6.5×10⁵mol/L)190μL/孔，加入本发明化合物样品l0μL/孔，空白孔加l0μL生理盐水，充分混匀，用封板膜封板后室温下避光静置30分钟，于UV2401分光光度计上测定仪上测定各孔吸光度值，测定波长为517nm；样品对脂性自由基DPPH清除率按下式计算:

DPPH清除率(％)＝(A_空白-A_样品)/A_空白×100％

A_空白：空白对照组吸光度值；A_样品：加样品组吸光度值。

样品平行5次检测，计算半数清除浓度IC50测定结果为4.36μg/L，表明化合物具有良好的抗氧化活性和清除自由基活性。

实施例9

化合物的清除卷烟烟气自由基效果测试：

(1)卷烟的叶组为：上部烟叶为15％，中部烟叶为48％，下部烟叶为23％，膨胀梗丝8％，烟草薄片6％；采用醋酸纤维嘴棒，嘴棒成型纸透气度为4500CU；卷烟纸克重为50g/m²、透气度为80CU的，水松纸透气度为200CU。成品卷烟烟支的重量为0.93±0.02g，圆周为24.5mm，长度为84mm(其中嘴棒长度为25mm)。

试验化合物用香精注射机均匀添加到卷烟过滤嘴丝束中，每支卷烟添加量为0.5～5.0mg，并以未添加试验化合物的卷烟为对照。

(2)卷烟用RM200型20孔道自动吸烟机在标准条件下吸烟，主流烟气粒相物用44mm剑桥滤片捕集，气相部分用采样管捕集；粒相自由基用含0.05mol/L N-特丁基-α-苯基氮硐的苯溶液为萃取剂从剑桥滤片溶出，并洗涤剑桥滤片，定容得粒相自由基测试液。气相自由基用自由基采样管，以0.05mol/L N-特丁基-α-苯基氮硐的苯溶液为吸收剂采集，卷烟抽吸完后取出气相自由基采样管，同时用少量吸收剂分3次冲洗通气内管外部和采样管内壁，合并吸收液和洗涤液，得气相自由基样品液。

(3)用顺磁共振仪测定自由基，ESR分析实验条件：中心磁场＝3.385T，扫宽＝0.500T，微波频率＝1.5GHz，扫描时间＝2min，扫描次数＝5，放大倍数＝10³～10⁵(根据峰高进行调整)，样品用量20μL；根据ESR图谱中峰面积计算气相及粒相自由基数量的变化。

实验结果表明：进行5次实验，和对照样相比，添加本发明化合物的卷烟气相自由基降低率为16～24％，粒相自由基降低率在18～25％之间，该化合物对卷烟主流烟气中的自由基具有确切的清除效果。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。