本发明涉及一种从重楼、延龄草或其它植株中提取、制备高纯度重楼皂苷vi的方法，所得样品可用于缺血性心脑血管疾病的治疗及预防。
背景技术：
重楼为百合科重楼属多年生草本植物，全世界共有27种，我国有25种，其中有19种分布于我国西南地区，多以根茎入药，是我国常用的传统中药，被历年版中国药典收载，《中华人民共和国药典》2015年版收载重楼品种为七叶一枝花parispolyphyllasmithvar.chinensis(franch.)hara和云南重楼parispolyphyllasmithvar.yunnanensis(franch.)hand.的干燥根茎。重楼性微寒，味苦，归肝经，有小毒。功效：消肿止痛，清热解毒，息风定惊，用于跌打损伤，咽喉肿痛，毒蛇咬伤，惊风抽搐等症。
重楼药材中主要含有甾体皂苷类化合物，目前已报道了近90个，根据结构类型主要分为偏诺甾体皂苷(pennogeninsaponins)和薯蓣甾体皂苷(diosgeninsaponins)，以及c-22内酯甾体皂苷、孕甾烷皂苷(pregnanesaponins)和呋甾烷型甾体皂苷(furostanolsaponins)等，大多数甾体皂苷具有较强的药理和生理活性，具有抗肿瘤、止血、抗菌、消炎、镇痛、镇静、抑制血管生成、免疫调节、抗氧化、保护肝脏与肾脏等功效，临床方面重楼皂苷广泛应用于治疗肿瘤、泌尿系统感染和妇科血症等各类疾病的治疗。近年来，许多学者对重楼皂苷的药理活性和临床应用进行深入而广泛的研究，为重楼皂苷的综合开发和利用开辟更广阔的前景，但由于重楼资源限制，影响了重楼皂苷的综合开发和利用。
重楼皂苷vi是重楼皂苷的主要有效成分之一，也是重楼药材和含重楼药材制剂质量主要控制的有效成分之一，具有较好的止血和抗肿瘤活性，对妇科血症有较好的疗效，能有效地预防小鼠结肠炎癌变。研究发现重楼皂苷vi不仅存在于重楼属药材中，而且还存在于延龄草属等相关科属植物中，为重楼皂苷vi的分离、制备和深入研究、开发提供了基础。
延龄草，别名头顶一颗珠、芋儿七、狮儿七，为百合科延龄草属植物延龄草(trilliumtschonoskiimaxim.)，含有重楼皂苷vi、延龄草苷等甾体皂苷类、黄酮苷类和苯丙素苷类等化合物。主要分布在我国湖北、西藏、云南、四川、陕西、甘肃、安徽、浙江(西北部目山)及福建武夷山等地，目前人工栽培已基本成功。
重楼皂苷vi分离、制备，目前主要用于药材化学成分分离和鉴定。孙迪等人(七叶一枝花的化学成分研究[j].食品与药品，2016，18(2)：98-101.)、李慧敏等人(延龄草化学成分的分离与鉴定[j].沈阳药科大学学报，2013，30(7)：509-516.)、文彦诗等人(滇重楼须根中的化学成分[j].西部林业科学，2015，44(6)：51-55.)、刘杨等人(金线重楼的皂苷成分研究[j].中南药学，2015，15(1)：41-43.)，主要采用甲醇、乙醇等溶剂提取、正丁醇萃取，然后将萃取液进行硅胶柱层析、反相材料柱层析或通过半制备方法，以氯仿、甲醇或乙腈等溶剂为洗脱剂，最后通过多次甲醇结晶得到，所得最终产品易存在甲醇等有机溶剂残留。另外，由于氯仿、甲醇和乙腈溶剂毒性都比较大，易挥发，长时间使用对人体伤害也比较大，且对环境污染也比较严重，限制了其在工业上的大量使用，目前只是用于少量重楼皂苷vi样品制备，不适宜规模化生产、制备重楼皂苷vi。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种从富含重楼皂苷vi(重楼皂苷vi含量大于0.1％)的重楼或其它植物中提取制备重楼皂苷vi的方法及应用。采用本发明制备重楼皂苷vi，主要使用溶剂为乙醇、乙酸乙酯和水，工艺简便可行，适用于工业化大生产，毒性小，且所用溶剂易回收、可反复使用，对环境污染较小，所得最终产物经水洗后基本不含有机溶剂残留。初步药效学研究表明，该成分对心脑血管疾病有较好的治疗作用，为下一步药物、功能食品的研发和应用奠定了基础。
本发明涉及一种从富含重楼皂苷vi的重楼、延龄草或其它植株中提取制备高纯度重楼皂苷vi的方法及应用：
1、一种高纯度重楼皂苷ⅵ的制备方法，其特征在于以下步骤：
1)重楼或延龄草干燥植株粗粉碎，用40％-95％乙醇溶液回流提取，料液比为1:10-1:50，提取次数1-4次，提取温度50-90℃，每次提取时间60-180min，提取液经过滤，合并真空浓缩成含醇量30％-50％溶液，过滤得上清液，备用，残渣弃去，主要除去小极性成分和油脂类化合物；
2)步骤1)得到的上清液上大孔吸附树脂柱，先用2-4倍柱体积30％-50％乙醇洗，主要除去极性较大的甾体皂苷等成分，再用3-5倍柱体积70％-90％乙醇洗脱，将70％-90％乙醇洗脱液合并，浓缩，即得富含重楼皂苷ⅵ的粗提取物；
3)步骤2)得到的样品，100目硅胶拌样后，上100-200目硅胶柱，进行硅胶柱层析，用3-5倍柱体积乙酸乙酯-乙醇(25:1-5:1，w/w)洗脱溶剂洗脱，薄层层析检测，将含有重楼皂苷vi成分的洗脱液合并，回收溶剂至近干；
4)步骤3)得到的样品用40％-60％乙醇溶解后上反相柱，先用2-4倍柱体积60％-70％乙醇洗脱，除去与重楼皂苷vi分子量相似和极性相近的成分，再用3-5倍柱体积75％-85％乙醇洗脱，取75％-85％洗脱液回收乙醇至基本无醇味后，放置，让其慢慢析出沉淀，沉淀部分即为重楼皂苷vi粗品；
5)步骤4)析出的沉淀过滤，用纯净水洗涤2-3次，所得沉淀部分水浴浓缩至近干，105℃干燥1-2小时，即得所需重楼皂苷ⅵ；
6)步骤5)所得高纯度重楼皂苷vi样品采用hplc检测纯度大于98％，水分小于2％。
安全性评价
将本发明所得重楼皂苷ⅵ样品进行急性毒性试验研究，结果表明小鼠半数致死量小于2.19g/kg，为临床推荐使用剂量(2mg/kg)的1095倍，死亡及存活动物剖检，未见脏器异常变化。本发明得到的重楼皂苷ⅵ样品安全性有保障。
本发明所得重楼皂苷ⅵ进行药效学研究
1)小鼠常压缺氧耐受性研究
采用小鼠常压缺氧耐受性实验对药物耐缺氧作用进行研究，结果表明重楼皂苷ⅵ40mg/kg.bw、60mg/kg.bw剂量连续给药20d，可明显延长常压缺氧条件下小鼠的存活时间，延长率分别为72.85％、77.49％。与空白对照组比较，具有显著性差异，提示重楼皂苷ⅵ具有增加心肌供氧量和提高心肌耐缺氧能力的作用。
2)对颈总动脉结扎所致小鼠大脑缺血的影响
采用颈总动脉结扎所致小鼠大脑缺血实验对药物抗脑缺血作用进行研究，结果表明重楼皂苷ⅵ40mg/kg.bw连续给药30d，可明显延长结扎颈总动脉后小鼠的存活时间，延长率为184.76％，与空白对照组比较，具有显著性差异，提示重楼皂苷ⅵ对急性脑缺血有一定保护作用。
3)对缺血再灌注所致大鼠心肌损伤的影响
在sd大鼠冠状动脉前降支结扎40分钟、再灌注2小时的心肌缺血试验中，十二指肠给予重楼皂苷ⅵ20、40、60mg/kg，能明显减轻心肌梗死的程度，缩小梗死面积，减轻梗死区重量，使梗死区占心室及心脏百分比降低；低剂量还能使sod值增加，但三剂量均对mda、ck、ldh的水平无明显影响。结果提示重楼皂苷ⅵ对心肌缺血再灌注损伤有明确保护作用。
4)对大鼠离体心脏心肌缺血所致心肌梗死的影响
在langendorff离体灌流心脏上结扎大鼠冠状动脉，观察重楼皂苷ⅵ对离体心脏血流动力学(左室压峰值lvsp、左室压最大变化速率dp/dtmax、冠脉流量caf)的影响，并以硝基四氮唑蓝(n-bt)染色法，观察其对心肌梗死范围的影响。结果表明，重楼皂苷ⅵ能够明显减轻心肌梗死程度，并能降低dp/dtmax值，增加冠脉流量，从而减弱心梗心脏的心收缩力，改善心脏供血供氧。结果提示重楼皂苷ⅵ对急性缺血的心脏有直接保护作用。
5)对中脑动脉阻断大鼠模型的影响
sd大鼠以20、40、60mg/kg/d的剂量连续5天灌胃给予重楼皂苷ⅵ，能剂量依赖地改善fecl3引起的mcao大鼠的神经功能障碍，缩小脑梗死范围，减轻脑水肿。结果提示重楼皂苷ⅵ对急性脑缺血有一定保护作用。40mg/kg的重楼皂苷ⅵ作用强度较等剂量的三七总皂苷、益脉康片稍强，但无统计学差异。
上述药效学结果表明，重楼皂苷ⅵ对缺血性心脑血管有较好的的保护作用，可用于缺血性心脑血管疾病治疗药物、功能食品等产品的开发。
稳定性研究：按《中华人民共和国药典》2015版四部9001稳定性研究有关技术指导原则要求进行加速条件下稳定性研究。
将本发明所得重楼皂苷ⅵ采用铝塑复合膜包装、在加速条件(温度40℃、相对湿度75％)下进行为期6个月的稳定性试验，结果如下：
试验结果表明，本发明所得重楼皂苷ⅵ样品在加速条件(温度40℃、相对湿度75％)下放置6个月(相当于常温条件下保存3年)，重楼皂苷ⅵ含量降低为1.40％(按要求考察期内含量降幅应小于10％)，本发明所得重楼皂苷ⅵ原料含量稳定。
具体实施方式
实施例1：
1)重楼全株干燥后粗粉碎，用40％乙醇溶液提取，料液比为1:40，提取次数2次，提取温度90℃，每次提取时间60min，提取液经过滤，上清液真空浓缩至含醇量为30％；
2)步骤1)得到的浓缩液，离心得沉淀和上清液，沉淀弃去；
3)步骤2)得到的上清液上大孔吸附树脂柱d101，分别用4倍柱体积30％乙醇、3倍柱体积70％乙醇洗脱，将70％乙醇洗脱液合并，浓缩至比重大于1.25，即得富含重楼皂苷ⅵ的提取物；
4)步骤3)得到的样品，100目硅胶拌样后，上100目硅胶柱，依次用5倍柱体积乙酸乙酯-乙醇(25:1,w/w)洗脱，薄层层析检测，将含有重楼皂苷vi成分的洗脱液合并，回收溶剂至近干；
5)步骤4)得到的样品用40％乙醇溶解后上c-18柱，依次用3倍柱体积60％和3倍柱体积80％乙醇洗脱，取80％洗脱液回收乙醇后，放置，让其慢慢析出沉淀，沉淀部分即为重楼皂苷vi粗品；
6)步骤5)析出的沉淀过滤，用纯净水洗涤2-3次，所得沉淀部分水浴浓缩至近干，105℃干燥1小时，即得所需重楼皂苷ⅵ,重楼皂苷ⅵ经hplc检测，含量为98.3％，水分1.52％。
实施例2：
1)重楼全株干燥后粗粉碎，用50％乙醇溶液提取，料液比为1:20，提取次数3次，提取温度80℃，每次提取时间120min，提取液经过滤，上清液调至含醇量为50％备用；
2)步骤1)得到的提取液，离心得沉淀和上清液，沉淀弃去；
3)步骤2)得到的上清液上大孔吸附树脂柱hpd-100，分别用4倍柱体积50％乙醇，4倍柱体积70％乙醇洗脱，将70％乙醇洗脱液合并，浓缩至比重大于1.25，即得富含重楼皂苷vi的提取物；
4)步骤3)得到的样品，100目硅胶拌样后，上100目硅胶柱，依次用4倍柱体积乙酸乙酯-乙醇(20:1，w/w)洗脱，薄层层析检测，将含有重楼皂苷vi成分的洗脱液合并，回收溶剂至近干；
5)步骤4)得到的样品用50％乙醇溶解后上c-18柱，依次用4倍柱体积60％乙醇、5倍柱体积75％乙醇洗脱，取75％洗脱液回收乙醇后，放置，让其慢慢析出沉淀，沉淀部分即为重楼皂苷vi粗品；
6)将上述析出的沉淀过滤，用纯净水洗涤2-3次，所得沉淀部分水浴浓缩至近干，105℃干燥1.5小时，即得所需重楼皂苷ⅵ,重楼皂苷ⅵ经hplc检测，含量为99.3％，水分0.98％。
实施例3：
1)重楼全株干燥后粗粉碎，用80％乙醇溶液提取，料液比为1:40，提取次数4次，提取温度70℃，每次提取时间180min，提取液经过滤，清液真空浓缩至含醇量40％；
2)步骤1)得到的浓缩液，离心得沉淀和上清液，沉淀弃去；
3)步骤2)得到的上清液上大孔吸附树脂柱hpd-700，分别用2倍柱体积50％，3倍柱体积85％乙醇洗脱，将85％乙醇洗脱液合并，浓缩至比重大于1.25，即得富含重楼皂苷ⅵ提取物；
4)步骤3)得到的样品，100目硅胶拌样后，上100目硅胶柱，依次用4倍柱体积乙酸乙酯-乙醇(16:1，w/w)洗脱，薄层层析检测，将含有重楼皂苷vi成分的洗脱液合并，回收溶剂至近干；
5)步骤4)得到的样品用60％乙醇溶解后上rp-18柱，依次用2倍柱体积70％、3倍柱体积85％乙醇洗脱，85％洗脱液回收乙醇至基本无醇味后，放置，让其慢慢析出沉淀，沉淀部分即为重楼皂苷vi粗品。
6)将上述析出的沉淀过滤，用纯净水洗涤2-3次，所得沉淀部分水浴浓缩至近干，105℃干燥2小时，即得所需重楼皂苷ⅵ,重楼皂苷ⅵ经hplc检测，含量为98.8％，水分0.86％。
实施例4：
1)重楼全株干燥后粗粉碎，用95％乙醇溶液提取，料液比为1:50，提取次数1次，提取温度50℃，提取时间180min，提取液经过滤，清液真空浓缩至含醇量50％；
2)步骤1)得到的浓缩液，离心得沉淀和上清液，沉淀弃去；
3)步骤2)得到的上清液上大孔吸附树脂柱ads-8，分别用3倍柱体积50％，3倍柱体积90％乙醇洗脱，将90％乙醇洗脱液合并，浓缩至比重大于1.25，即得富含重楼皂苷vi提取物；
4)步骤3)得到的样品，100目硅胶拌样后，上200目硅胶柱，依次用3倍柱体积乙酸乙酯-乙醇(12:1,w/w)洗脱，薄层层析检测，将含有重楼皂苷vi成分的洗脱液合并，回收溶剂至近干；
5)步骤4)得到的样品用60％乙醇溶解后上rp-18柱，依次用3倍柱体积70％和3倍柱体积85％乙醇洗脱，取85％洗脱液回收乙醇至基本无醇味后，放置，让其慢慢析出沉淀，沉淀部分即为重楼皂苷vi粗品；
6)将上述析出的沉淀过滤，用纯净水洗涤2-3次，所得沉淀部分水浴浓缩至近干，105℃干燥2小时，即得所需重楼皂苷ⅵ,重楼皂苷ⅵ经hplc检测，含量为98.6％，水分1.01％。
实施例5：
1)取延龄草全株干燥后粗粉碎，用60％乙醇溶液提取，料液比为1:30，提取次数2次，提取温度80℃，每次提取时间150min，提取液经过滤，清液真空浓缩至含醇量40％；
2)步骤1)得到的浓缩液，过滤得沉淀和上清液，沉淀弃去；
3)步骤2)得到的上清液上大孔吸附树脂柱lsa-20，分别用3倍柱体积50％，5倍柱体积75％乙醇洗脱，将75％乙醇洗脱液合并，浓缩至比重大于1.25，即得富含重楼皂苷vi提取物；
4)步骤3)得到的样品，100目硅胶拌样后，上200目硅胶柱，依次用4倍柱体积乙酸乙酯-乙醇(10:1,w/w)洗脱，薄层层析检测，将含有重楼皂苷vi成分的洗脱液合并，回收溶剂至近干；
5)步骤4)得到的样品用40％乙醇溶解后上ods柱，依次用2倍柱体积70％乙醇和4倍柱体积75％乙醇洗脱，取75％洗脱液回收乙醇至基本无醇味后，放置，让其慢慢析出沉淀，沉淀部分即为重楼皂苷vi粗品；
6)将上述析出的沉淀过滤，用纯净水洗涤2-3次，所得沉淀部分水浴浓缩至近干，105℃干燥1小时，即得所需重楼皂苷ⅵ,重楼皂苷ⅵ经hplc检测，含量为98.5％，水分1.32％。
实施例6：
1)延龄草全株干燥后粉碎，用95％乙醇溶液提取，料液比为1:10，提取次数3次，提取温度75℃，每次提取时间60min，提取液经过滤，上清液真空浓缩至含醇量50％；
2)步骤1)得到的浓缩液，离心得沉淀和上清液，沉淀弃去；
3)步骤2)得到的上清液上大孔吸附树脂柱hp-20，分别用4倍柱体积50％，4倍柱体积80％乙醇洗脱，将80％乙醇洗脱液合并，浓缩至比重大于1.25，即得富含重楼皂苷vi提取物；
4)步骤3)得到的样品，100目硅胶拌样后，上200目硅胶柱，依次用3倍柱体积乙酸乙酯-乙醇(5:1,w/w)洗脱，将含有重楼皂苷vi成分的洗脱液合并，减压回收溶剂至近干；
5)步骤4)得到的样品用60％乙醇溶解后上ods柱，依次用2倍柱体积70％乙醇、3倍柱体积85％乙醇洗脱，取85％洗脱液回收乙醇后，放置，让其慢慢析出沉淀，沉淀部分即为重楼皂苷vi粗品；
6)将上述析出的沉淀过滤，用纯净水洗涤2-3次，所得沉淀部分水浴浓缩至近干，105℃干燥2小时，即得所需重楼皂苷ⅵ，重楼皂苷ⅵ经hplc检测，含量为99.2％，水分0.92％。