本发明属于分子生物学领域，具体地说，涉及抑制乙型肝炎病毒hbv的sirna分子、及其在制备抗hbv药物中的用途。
背景技术：
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus，hbv)感染导致的传染性疾病，也是最严重类型的病毒性肝炎，它可造成慢性肝病，导致患者发生肝硬化和肝细胞肝癌的风险增高，严重威胁人类健康。hbv是一种嗜肝性dna病毒，属嗜肝dna病毒科(hepadnaviridae)，全基因组长约3.2kb，为部分双链环状dna，其基因组共有四个开放阅读框(openreadingframe，orf)，编码蛋白包括表面抗原(s基因)、核心抗原(c基因)、聚合酶蛋白(p基因)和x蛋白(c基因)。据世界卫生组织报道，全球大约有20亿人感染hbv，其中约有2.5-3.5亿的人为慢性乙肝感染者，估计每年有60万人死于hbv相关的肝脏疾病或肝细胞肝癌。hbv可急性引起肝脏炎症、呕吐、黄疸，在少数情况下引起严重的爆发性疾病和死亡。hbv也会造成慢性肝脏感染，以后可能发展成肝硬化或肝癌。hbv的传播主要是通过母婴传染、未经保护的性传播、输血和注射毒品造成的感染，传播途径与人类免疫缺陷病毒(艾滋病毒)相同。hbv的传染性比艾滋病毒强50-100倍，hbv在体外可存活至少7天以上。目前主要是通过接种乙型肝炎疫苗来预防乙型肝炎的发生，但不能用于治疗。目前有数种药物通过阻断hbv聚合酶来抑制hbv的复制，如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定等。但是停药后复发率高，长期服用则可导致病毒变异，在用药一段时间后容易产生耐药性，使得临床抗病毒治疗面临极大的挑战。近几年，rna干扰(rnainterfering，rnai)技术的迅速发展，部分rna药物已进入临床试验阶段，为疑难杂症尤其是多因素的疾病如癌症、病毒感染开辟了全新的治疗途径。2016年12月23日，美国食品和药物管理局fda批准了首个用于治疗脊髓性肌萎缩的rna药物spinraza(nusinersen)的上市申请，标志着rna药物正式加入药物大军，成为继化学药物、生物蛋白药物之后的第三大新药类型。rnai技术是通过小干扰rna(smallinterferingrna，sirna)干扰特定靶基因信使rna(mrna)的表达，来达到治疗疾病的目的，是基因治疗的重要组成部分。rnai是由双链rna(double-strandedrna，dsrna)引发的转录后基因沉默，作用机制是：核糖核酸酶iii家族的dicer酶，与dsrna结合，将其剪切成21-23nt及3'端突出的sirna，随后sirna与rna诱导沉默复合物(rna-inducedsilencingcomplex，risc)结合，解旋成单链，活化的risc受已成单链的sirna引导，序列特异性地结合到靶基因的mrna上并将其切断，引发靶mrna的特异性分解，从而阻断其表达。rnai已作为一种简单有效的基因敲除的技术，广泛地应用于功能基因组学研究以及抗病毒、抗肿瘤治疗的研究中。本发明提供了一种用rnai技术来抑制hbv的方法。应用rna干扰技术，用靶向至hbv基因的sirna作为靶向药物，在hbv基因组的转录后进行干扰，有效抑制hbv的蛋白表达，从而抑制病毒复制，该方法特异性强、效率高、副作用小、可持续用药，且能弥补目前乙型肝炎治疗药物的不足，在不久的将来可能成为一种新的治疗乙型肝炎的手段。技术实现要素：为了提供有效地治疗乙型肝炎的新途径，本发明设计并筛选出一系列具有抑制hbv活性的rna分子，可以特异性靶向hbv基因组转录本，达到抑制hbv的目的。因此，本发明的第一个目的在于提供一种抑制hbv的sirna分子，其由正义链和反义链组成，其中正义链选自奇数n(n＝1-159)序列号的seqidno:1-159，反义链选自与上述奇数n相对应的偶数n+1(2-160)序列号的seqidno:2-160。具体而言，本发明的sirna分子是由选自下组的正义链和反义链组成的双链rna分子：正义链seqidno:1、反义链seqidno:2；正义链seqidno:3、反义链seqidno:4；正义链seqidno:5、反义链seqidno:6；正义链seqidno:7、反义链seqidno:8；正义链seqidno:9、反义链seqidno:10；正义链seqidno:11、反义链seqidno:12；正义链seqidno:13、反义链seqidno:14；正义链seqidno:15、反义链seqidno:16；正义链seqidno:17、反义链seqidno:18；正义链seqidno:19、反义链seqidno:20；正义链seqidno:21、反义链seqidno:22；正义链seqidno:23、反义链seqidno:24；正义链seqidno:25、反义链seqidno:26；正义链seqidno:27、反义链seqidno:28；正义链seqidno29:、反义链seqidno:30；正义链seqidno:31、反义链seqidno:32；正义链seqidno:33、反义链seqidno:34；正义链seqidno:35、反义链seqidno:36；正义链seqidno:37、反义链seqidno:38；正义链seqidno:39、反义链seqidno:40；正义链seqidno:41、反义链seqidno:42；正义链seqidno:43、反义链seqidno:44；正义链seqidno:45、反义链seqidno:46；正义链seqidno:47、反义链seqidno:48；正义链seqidno:49、反义链seqidno:50；正义链seqidno:51、反义链seqidno:52；正义链seqidno:53、反义链seqidno:54；正义链seqidno:55、反义链seqidno:56；正义链seqidno:57、反义链seqidno:58；正义链seqidno:59、反义链seqidno:60；正义链seqidno:61、反义链seqidno:62；正义链seqidno:63、反义链seqidno:64；正义链seqidno:65、反义链seqidno:66；正义链seqidno:67、反义链seqidno:68；正义链seqidno:69、反义链seqidno:70；正义链seqidno:71、反义链seqidno:72；正义链seqidno:73、反义链seqidno:74；正义链seqidno:75、反义链seqidno:76；正义链seqidno:77、反义链seqidno:78；正义链seqidno:79、反义链seqidno:80；正义链seqidno:81、反义链seqidno:82；正义链seqidno:83、反义链seqidno:84；正义链seqidno:85、反义链seqidno:86；正义链seqidno:87、反义链seqidno:88；正义链seqidno:89、反义链seqidno:90；正义链seqidno:91、反义链seqidno:92；正义链seqidno:93、反义链seqidno:94；正义链seqidno:95、反义链seqidno:96；正义链seqidno:97、反义链seqidno:98；正义链seqidno:99、反义链seqidno:100；正义链seqidno:101、反义链seqidno:102；正义链seqidno:103、反义链seqidno:104；正义链seqidno:105、反义链seqidno:106；正义链seqidno:107、反义链seqidno:108；正义链seqidno:109、反义链seqidno:110；正义链seqidno:111、反义链seqidno:112；正义链seqidno:113、反义链seqidno:114；正义链seqidno:115、反义链seqidno:116；正义链seqidno:117、反义链seqidno:118；正义链seqidno:119、反义链seqidno:120；正义链seqidno:121、反义链seqidno:122；正义链seqidno:123、反义链seqidno:124；正义链seqidno:125、反义链seqidno:126；正义链seqidno:127、反义链seqidno:128；正义链seqidno129:、反义链seqidno:130；正义链seqidno:131、反义链seqidno:132；正义链seqidno:133、反义链seqidno:134；正义链seqidno:135、反义链seqidno:136；正义链seqidno:137、反义链seqidno:138；正义链seqidno:139、反义链seqidno:140；正义链seqidno:141、反义链seqidno:142；正义链seqidno:143、反义链seqidno:144；正义链seqidno:145、反义链seqidno:146；正义链seqidno:147、反义链seqidno:148；正义链seqidno:149、反义链seqidno:150；正义链seqidno:151、反义链seqidno:152；正义链seqidno:153、反义链seqidno:154；正义链seqidno:155、反义链seqidno:156；正义链seqidno:157、反义链seqidno:158；或者正义链seqidno:159、反义链seqidno:160。优选地，本发明的sirna分子是由选自下组的正义链和反义链组成的双链rna分子：正义链seqidno:25、反义链seqidno:26；正义链seqidno:41、反义链seqidno:42；正义链seqidno:43、反义链seqidno:44；正义链seqidno:53、反义链seqidno:54；正义链seqidno:65、反义链seqidno:66；正义链seqidno:67、反义链seqidno:68；正义链seqidno:85、反义链seqidno:86；正义链seqidno:113、反义链seqidno:114；或者正义链seqidno:157、反义链seqidno:158。可选地，本发明提供的sirna分子的正义链3’端和/或反义链3’端含有0～2个突出碱基“nn”，其中两个n相同或者不同，并且各自独立地是腺嘌呤脱氧核苷酸(da)、胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dt)、胞嘧啶脱氧核苷酸(dc)、鸟苷酸脱氧核苷酸(dg)、腺嘌呤核苷酸(a)、尿嘧啶核苷酸(u)、胞嘧啶核苷酸(c)或鸟苷酸核苷酸(g)的任何一种。优选地，本发明提供的sirna分子的正义链3’端和/或反义链3’端含有2个胸腺嘧啶脱氧核苷酸dtdt。在一种优选的实施方式中，上述sirna分子可以两种以上比如两个、三个、或四个组合在一起形成双链rna分子(dsrna分子)，分别靶向hbv基因组转录本的不同区域，达到抑制hbv基因表达的目的。对于该新的双链rna分子(dsrna分子，为了与前述的sirna分子相区别，本文中将其命名为“组合式dsrna(分子)”。本发明的组合式dsrna由正义链和反义链组成，其中正义链包含两种以上选自奇数序列号的正义链seqidno:1-159，相对应地，与正义链互补的反义链包含两种以上选自与上述奇数相对应的偶数序列号的反义链seqidno:2-160。以其中正义链包含两种正义链1和正义链2的组合式dsrna为例，本发明的组合式dsrna由正义链和反义链组成，其中正义链包含正义链1和正义链2，正义链1为seqidno:3，正义链2为seqidno:71；与正义链互补的反义链包含反义链1和反义链2，反义链1为反义链seqidno:4，反义链2为seqidno:72。以此类推。再以其中正义链包含三种正义链1、正义链2和正义链3的组合式dsrna为例，本发明的组合式dsrna由正义链和反义链组成，其中正义链包含正义链1、正义链2和正义链3，正义链1为seqidno:3，正义链2为seqidno:71，正义链3为seqidno:149；与正义链互补的反义链包含反义链1、反义链2和反义链3，反义链1为反义链seqidno:4，反义链2为seqidno:72，反义链3为反义链seqidno:150。以此类推。可选地，本发明的组合式dsrna中，上述正义链中的正义链1、正义链2和正义链3彼此之间可以设有起连接作用的间隔序列；相对应地，与正义链互补的反义链中的反义链1、反义链2和反义链3彼此之间可以设有起连接作用的间隔序列，这些间隔序列与靶基因序列不同源。可选地，本发明提供的组合式dsrna分子的正义链3’端和/或反义链3’端含有0～2个突出碱基“nn”，其中两个n相同或者不同，并且各自独立地是腺嘌呤脱氧核苷酸(da)、胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dt)、胞嘧啶脱氧核苷酸(dc)、鸟苷酸脱氧核苷酸(dg)、腺嘌呤核苷酸(a)、尿嘧啶核苷酸(u)、胞嘧啶核苷酸(c)或鸟苷酸核苷酸(g)的任何一种。优选地，本发明提供的组合式dsrna分子的正义链3’端和/或反义链3’端含有2个胸腺嘧啶脱氧核苷酸dtdt。在一种实施方式中，上述sirna分子或者组合式dsrna分子可以呈现为rna表达框形式。因此，本发明的第二个目的在于提供上述sirna分子或者组合式dsrna分子的表达框，这种rna表达框是一种dna分子。所述rna表达框的分子结构为：rna聚合酶iii型启动子(比如u6启动子)-rna转录模板-rna聚合酶iii型启动子(比如h1启动子)；rna聚合酶ii型启动子-rna正义链转录模板-环状序列-rna反义链专利模板-rna聚合酶ii型启动子转录终止信号；或者rna聚合酶iii型rna启动子-rna正义链转录模板-环状序列-rna反义链专利模板-rna聚合酶iii型启动子转录终止信号(或polya尾)。在一种实施方式中，对于本发明的sirna分子，可将其制备成下述的sirna表达框：rna聚合酶iii型启动子(比如u6启动子)-sirna转录模板-rna聚合酶iii型启动子(比如h1启动子)；rna聚合酶ii型启动子-sirna正义链转录模板-环状序列-sirna反义链专利模板-rna聚合酶ii型启动子转录终止信号；或者rna聚合酶iii型rna启动子-sirna正义链转录模板-环状序列-sirna反义链专利模板-rna聚合酶iii型启动子转录终止信号(或polya尾)。比如可将sirna分子制备成下述的sirna表达框：u6启动子-sirna转录模板-h1启动子。类似地，对于本发明的组合式dsrna分子，可将其制备成下述的rna表达框：rna聚合酶iii型启动子(比如u6启动子)-dsrna转录模板-rna聚合酶iii型启动子如h1启动子，或rna聚合酶ii型启动子-dsrna正义链转录模板-环状序列-dsrna反义链专利模板-rna聚合酶ii型启动子转录终止信号；或rna聚合酶iii型rna启动子-dsrna正义链转录模板-环状序列-dsrna反义链专利模板-rna聚合酶iii型启动子转录终止信号(或polya尾)。比如可将dsrna分子制备成下述的dsrna表达框：u6启动子-dsrna转录模板-h1启动子。本发明的第二个目的在于提供上述sirna分子或者组合式dsrna分子、rna表达框在制备抗hbv药物中的用途。其中，本发明的sirna分子、组合式dsrna分子、rna表达框、或者包含rna表达框的质粒可以作为抗hbv药物的有效成分。在一种优选的实施方式中，上述抗hbv药物中包含一种上述sirna分子、或者两种以上sirna分子的混合物。更优选抗hbv药物中包含一种上述sirna分子。当抗hbv药物中包含两种以上sirna分子时，这些sirna分子的混合物靶向hbv基因组比如聚合酶蛋白p基因的不同位点，故可称为“多靶sirna”或“多靶sirna组合”。比如，形成多靶sirna组合的sirna分子是由选自下组的正义链和反义链组成的双链rna分子：正义链seqidno:25、反义链seqidno:26；正义链seqidno:41、反义链seqidno:42；正义链seqidno:43、反义链seqidno:44；正义链seqidno:53、反义链seqidno:54、正义链seqidno:65、反义链seqidno:66；正义链seqidno:67、反义链seqidno:68；正义链seqidno:85、反义链seqidno:86；正义链seqidno:113、反义链seqidno:114；或者正义链seqidno:157、反义链seqidno:158。优选地，形成多靶sirna组合的sirna分子是由选自下组的正义链和反义链组成的双链rna分子：正义链seqidno:25、反义链seqidno:26；正义链seqidno:43、反义链seqidno:44；正义链seqidno:53、反义链seqidno:54；正义链seqidno:67、反义链seqidno:68。在另一种优选的实施方式中，上述抗hbv药物中包含一种上述组合式dsrna分子。在另一种优选的实施方式中，上述抗hbv药物中包含一种上述sirna表达框、或者两种以上sirna表达框的混合物。更优选抗hbv药物中包含一种上述sirna表达框。在另一种优选的实施方式中，上述抗hbv药物中包含一种上述组合式dsrna分子的表达框。优选地，上述药物是注射剂型或口服剂型。优选地，上述药物还包含必要的佐剂。体外实验证明，本发明提供的sirna分子或者组合式dsrna分子的反义链可特异性地与hbv基因组转录本结合，使其降解，从而干扰转录后翻译过程，抑制hbv蛋白质翻译和病毒复制，达到治疗乙型肝炎的目的。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。在本文中，术语“sirna”、“sirna序列”、“sirna分子”、“双链sirna”、或“双链sirna分子”可以互换，它们表示的意思和范围相同。其中，sirna是正义链和反义链退火形成的双链结构。在本文中，术语“dsrna”、“dsrna序列”、“dsrna分子”、“双链rna”、或“双链rna分子”可以互换，它们表示的意思和范围相同，都是正义链和反义链退火形成的双链结构。术语“组合式dsrna”是指两种以上sirna组合在一个分子中形成新的双链rna分子。本文中，术语“(偶数)与上述奇数相对应”是指偶数n+1与奇数n形成一一对应的关系，其中奇数n选自1-159，相应地，偶数n+1选自2-160。比如奇数序列号的正义链seqidno:1与偶数序列号的反义链seqidno:2相对应、奇数序列号的正义链seqidno:3与偶数序列号的反义链seqidno:4相对应、奇数序列号的正义链seqidno:159与偶数序列号的反义链seqidno:160相对应，依次类推。本文中，术语“rna表达框”包括sirna表达框和组合式dsrna表达框。为方便起见，对于本发明的rna表达框，在本文中可将“u6启动子-sirna转录模板-h1启动子”简写为“u6-sirna转录模板-h1”或“u6-sirna-h1”或“sirna表达框”，它们表示的意思和范围相同。类似地，可将“u6启动子-dsrna转录模板-h1启动子”简写为“u6-dsrna转录模板-h1”或“u6-dsrna-h1”或“dsrna表达框”，它们表示的意思和范围相同。本发明的sirna分子筛选于针对hbv基因组的功能保守区而制备的sirna分子库，本发明采用专利号为zl200710024217.6的方法制备了sirna分子库，其优点在于所制备得到的sirna位点随机分布，长度可控，可以提高有效靶位点的命中率。sirna的制备可采用多种方法，比如：化学合成法、体外转录、酶切长链dsrna、载体表达sirna、pcr合成sirna表达元件等，这些方法的出现为研究者提供了可选择的空间，可以更好地获得基因沉默效率。本发明从sirna分子库中筛选出来的较为理想的sirna共有80个，分子长度为16-31个碱基对(bp)。它们的正义链和反义链分别为奇数序列号seqidno:1-159和偶数序列号seqidno:2-160，具体序列已列于表1中。出于治疗乙型肝炎的应用目的，可将本发明的sirna分子、表达sirna分子的表达框、或者包含sirna表达框的质粒、组合式dsrna分子、表达组合式dsrna的表达框、或者包含组合式dsrna表达框的质粒作为药物有效成分直接给药于受药者身上特定部位，比如病灶组织。本发明的药物的剂型可以为多种形式，只要适合于相应疾病的给药、并且恰当地保持sirna分子和/或组合式dsrna分子、以及表达rna分子的dna(包括表达框和质粒)的活性。比如，对于注射用给药系统，剂型可以是冻干粉。对于皮肤给药，剂型可以选择软膏或涂液。任选地，上述药物剂型中可以包含任何药学可接受的辅助剂(佐剂)，只要其适合于相应的给药体系、并且恰当地保持sirna分子和/或组合式dsrna分子、以及表达rna分子的dna(包括表达框和质粒)的活性。实施例材料和方法本文中的rna分子和引物序列由百奥迈科生物技术有限公司合成；表达载体由百奥迈科生物技术有限公司亚克隆制备。实施例1hbv基因组全位点sirna分子库的制备从hepg22.2.15细胞中获取hbv基因组dna，hepg22.2.15细胞含2个拷贝的hbv基因组，能稳定分泌hbsag、hbeag、hbcag及dane颗粒，并可检测到细胞内hbv的dna和rna等中间复制体，其含有hbv的血清亚型为ayw(genbankaccessionnumber：u95551)，按照专利(cn100570022c)的方法构建hbv基因组的sirna分子库。实施例2sirna表达框的制备与sirna靶点筛选1.sirna表达框的制备1.1pcr扩增制备u6-sirna转录模板-h1表达框：从实施例1制备的hbv基因组的sirna分子库中进行筛选，取80个sirna阳性克隆质粒为模板，用pfudna聚合酶(百奥迈科)通过pcr的方法扩增制备u6-sirna转录模板-h1表达框。各pcr反应体系为50μl反应体系：0.5μl模板dna(10-50ng)，1μl5’u6引物(10μm)，1μl3’h1引物(10μm)，1μldntp(10mm)，0.5μlpfudna聚合酶，用ddh2o补足到50μl。反应条件为：95℃1min预变性，95℃15sec变性，58℃30sec退火，72℃30sec延伸，20个循环。1.0％琼脂凝胶电泳检测，pcr产物条带单一，片段大小符合实验要求(未图示)。所用引物序列：5’u6引物：5’-aaggtcgggcaggaagagggc-3’；3’h1引物：5’-tatttgcatgtcgctatgtgttct-3’。1.2表达框pcr产物纯化：1.0％琼脂糖凝胶电泳分离pcr扩增得到的表达框，并用琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化凝胶产物。纯化后的dna再次进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，纯化后的u6-sirna转录模板-h1表达框纯度和浓度符合要求，用紫外分光光度计测得制备后的表达框浓度约为200ng/μl。2.sirna靶点筛选2.1细胞培养：hepg22.2.15细胞在含10％fbs的dmem培养基(thermo公司)中，37℃、5％co2培养箱培养。2.2细胞铺板并转染：将细胞按2.5×105个/ml接种到96孔细胞培养板中，37℃、5％co2培养箱培养过夜至汇合度约50％。用2000转染试剂(thermo公司)，按说明书将0.2μg/孔的“u6-sirna转录模板-h1表达框dna”转染至细胞中。未转染的细胞作为阴性对照(nc)。2.3mrna表达水平检测：用实时定量pcr检测各实验组中hbv聚合酶基因的mrna水平表达水平，取4μlrna为模板进行实时定量pcr反应。用基因特异性引物检测样本中hbv聚合酶mrna表达水平，同时扩增看家基因gapdh作为内参对照。每个反应做3个平行实验。建立如下10μl反应体系：2μl模板rna，5μl2×one-stepqpcrmix，0.2μl正向引物(10μm)，0.2μl反向引物(10μm)，用无rnase水补足体系至10μl。反应条件：42℃反转录30min，95℃预变性10min，95℃变性20sec，60℃退火30sec，循环35次。实时定量pcr引物序列：hbv正向引物：5’-tgtggttatcctgcgttaatg-3’；hbv反向引物：5’-gcgtcagcaaacacttgg-3’；gapdh正向引物：5’-gaaggtgaaggtcggagtc-3’；gapdh反向引物：5’-gaagatggtgatgggatttc-3’。2.4结果分析：用2-δδct法分析各sirna转录模板转染的细胞中hbv基因组转录本(mrna)的相对表达水平，实验结果如表1中所示。表1：各sirna序列及其转录模板对hbv基因组转录本表达水平的抑制作用表中“s”代表正义链(sensestrand)，“as”代表反义链(antisensestrand)。由表1中数据可见，各sirna转录模板转染细胞后，hbv基因组转录本(hbvmrna)的相对表达水平≤0.5，即这80种sirna的转录模板的沉默效果≥50％。实施例3体外筛选sirna1.细胞培养：hepg22.2.15细胞在含10％fbs的dmem培养基(thermo公司)中，37℃、5％co2培养箱培养。2.细胞铺板并转染：将细胞按2.5×105个/ml接种到96孔细胞培养板中，37℃、5％co2培养箱培养过夜至汇合度约50％。用2000转染试剂(thermo公司)，按说明书将50nm的sirna转染至细胞中，阴性对照(negativecontrol，nc)选取与人基因无同源性的sirna，其具体序列是：正义链：5’-uucuccgaacgugucacgudtdt-3’；反义链：5’-acgugacacguucggagaadtdt-3’3.rna提取：转染后48h，用冷的pbs洗涤细胞数次，离心去上清后，用risorna提取试剂(百奥迈科)提取细胞中的rna，按试剂说明书操作。4.mrna表达水平检测：用实时定量pcr检测各实验组中hbv聚合酶基因(p基因)的mrna水平表达水平，取4μlrna为模板进行实时定量pcr反应。用基因特异性引物检测样本中hbv聚合酶mrna表达水平，同时扩增看家基因gapdh作为内参对照。每个反应做3个平行实验。建立如下10μl反应体系：2μl模板rna，5μl2×one-stepqpcrmix，0.2μl正向引物(10μm)，0.2μl反向引物(10μm)，用无rnase水补足体系至10μl。反应条件：42℃反转录30min，95℃预变性10min，95℃变性20sec，60℃退火30sec，循环35次。5.结果分析：用2-δδct法分析各sirna转染细胞后hbv聚合酶基因转录本(hbvmrna)的相对表达水平，实验结果如表1中所示。表2：sirna分子对hbv聚合酶基因转录本表达水平的抑制作用表中“s”代表正义链(sensestrand)，“as”代表反义链(antisensestrand)。由表2中数据可见，各sirna转染细胞后，有38种sirna导致hbvmrna的相对表达水平≤0.4，即沉默效果≥60％。其中，有12个sirna分子导致hbvmrna的相对表达水平≤0.2，即沉默效果≥80％，它们包括：正义链为seqidno:3、反义链为seqidno:4的hbv1602；正义链为seqidno:25、反义链为seqidno:26的hbv1613；正义链为seqidno:27、反义链为seqidno:28的hbv1614；正义链为seqidno:43、反义链为seqidno:44的hbv1622；正义链为seqidno:49、反义链为seqidno:50的hbv1625；正义链为seqidno:71、反义链为seqidno:72的hbv1636；正义链为seqidno:81、反义链为seqidno:82的hbv1641；正义链为seqidno:93、反义链为seqidno:94的hbv1647；正义链为seqidno:99、反义链为seqidno:100的hbv1650；正义链为seqidno:109、反义链为seqidno:110的hbv1655；正义链为seqidno:149、反义链为seqidno:150的hbv1675；以及正义链为seqidno:151、反义链为seqidno:152的hbv1676。本发明筛选出的sirna分子中，有4个sirna分子可导致hbvmrna的相对表达水平≤0.2，并且其转录模板导致hbvmrna的相对表达水平≤0.4，它们包括：正义链为seqidno:3、反义链为seqidno:4的hbv1602；正义链为seqidno:71、反义链为seqidno:72的hbv1636；正义链为seqidno:93、反义链为seqidno:94的hbv1647；或者正义链为seqidno:149、反义链为seqidno:150的hbv1675。实验表明它们对于hbv基因的沉默效果突出。实施例4多靶sirna组合1.细胞培养：hepg22.2.15细胞在含10％fbs的dmem培养基(thermo公司)中，37℃、5％co2培养箱培养。2.细胞铺板并转染：将细胞按2.5×105个/ml接种到96孔细胞培养板中，37℃、5％co2培养箱培养过夜至汇合度约50％。用2000转染试剂(thermo公司)，按说明书将50nm的sirna混合物(两种sirna分子的摩尔浓度比为1：1。三种sirna分子摩尔浓度比为1：1：1)转染至细胞中，阴性对照(negativecontrol，nc)选取与人基因无同源性的sirna。3.rna提取：转染后48h，用冷的pbs洗涤细胞数次，离心去上清后，用risorna提取试剂(百奥迈科)提取细胞中的rna，按试剂说明书操作。4.mrna表达水平检测：用实时定量pcr检测各实验组中hbv聚合酶基因(p基因)的mrna水平表达水平，取4μlrna为模板进行实时定量pcr反应。用基因特异性引物检测样本中hbv聚合酶mrna表达水平，同时扩增看家基因gapdh作为内参对照。每个反应做3个平行实验。建立如下10μl反应体系：2μl模板rna，5μl2×one-stepqpcrmix，0.2μl正向引物(10μm)，0.2μl反向引物(10μm)，用无rnase水补足体系至10μl。反应条件：42℃反转录30min，95℃预变性10min，95℃变性20sec，60℃退火30sec，循环35次。5.结果分析：用2-δδct法分析各sirna混合物转染细胞后hbv聚合酶基因转录本(hbvmrna)的相对表达水平，实验结果如表3中所示。表3多靶sirna组合对hbv聚合酶基因转录本表达水平的抑制作用多靶sirna组合mrna相对表达水平hbv1622+hbv16270.16hbv1622+hbv16340.24hbv1627+hbv16340.14hbv1622+hbv1627+hbv16340.18hbv1613+hbv1627+hbv16340.15由表3中数据可见，采用hbv1613、hbv1622、hbv1627和hbv1634这四种靶向hbv基因组不同位点的sirna形成5种组合，各组合的sirna混合物在转染细胞后都会导致hbvmrna的相对表达水平≤0.24，即沉默效果≥76％，表明这四种sirna分子形成的5种组合都能够有效地抑制hbv聚合酶基因，具有联合给药的应用前景。序列表<110>百奥迈科生物技术有限公司<120>抑制hbv的sirna分子及其应用<130>shpi1700261<160>160<170>patentinversion3.5<210>1<211>19<212>rna<213>人工序列<400>1auuccacaaccuuucacca19<210>2<211>19<212>rna<213>人工序列<400>2uggugaaagguuguggaau19<210>3<211>23<212>rna<213>人工序列<400>3uauccauggcugcuaggcugugc23<210>4<211>23<212>rna<213>人工序列<400>4gcacagccuagcagccauggaua23<210>5<211>19<212>rna<213>人工序列<400>5gagcaaacacagcaaaucc19<210>6<211>19<212>rna<213>人工序列<400>6ggauuugcuguguuugcuc19<210>7<211>20<212>rna<213>人工序列<400>7ccaaccuccaaucacucacc20<210>8<211>20<212>rna<213>人工序列<400>8ggugagugauuggagguugg20<210>9<211>22<212>rna<213>人工序列<400>9uccccaaccuccaaucacucac22<210>10<211>22<212>rna<213>人工序列<400>10gugagugauuggagguugggga22<210>11<211>25<212>rna<213>人工序列<400>11gcacgucgcauggagaccaccguga25<210>12<211>25<212>rna<213>人工序列<400>12ucacgguggucuccaugcgacgugc25<210>13<211>22<212>rna<213>人工序列<400>13gguuaucgcuggaugugucugc22<210>14<211>22<212>rna<213>人工序列<400>14gcagacacauccagcgauaacc22<210>15<211>24<212>rna<213>人工序列<400>15cucuguuguccucucccgcaaaua24<210>16<211>24<212>rna<213>人工序列<400>16uauuugcgggagaggacaacagag24<210>17<211>22<212>rna<213>人工序列<400>17accgcacggaggccuuuugggg22<210>18<211>22<212>rna<213>人工序列<400>18ccccaaaaggccuccgugcggu22<210>19<211>20<212>rna<213>人工序列<400>19ucucuuuacgcggacucccc20<210>20<211>20<212>rna<213>人工序列<400>20ggggaguccgcguaaagaga20<210>21<211>21<212>rna<213>人工序列<400>21cgucgcauggagaccaccgug21<210>22<211>21<212>rna<213>人工序列<400>22cacgguggucuccaugcgacg21<210>23<211>21<212>rna<213>人工序列<400>23gccuauugauuggaaaguaug21<210>24<211>21<212>rna<213>人工序列<400>24cauacuuuccaaucaauaggc21<210>25<211>22<212>rna<213>人工序列<400>25cuuucccccacuguuuggcuuu22<210>26<211>22<212>rna<213>人工序列<400>26aaagccaaacagugggggaaag22<210>27<211>22<212>rna<213>人工序列<400>27gauucuuucccgaccaccaguu22<210>28<211>22<212>rna<213>人工序列<400>28aacugguggucgggaaagaauc22<210>29<211>21<212>rna<213>人工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