本发明涉及生物医药领域，具体涉及serpine1基因及其shrna序列及在抗人肺癌中的应用。
背景技术：
：丝氨酸蛋白酶抑制剂亚家族e成员1(serpinfamilyemember1,serpine1)基因位于染色体7q22.1，它属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族。serpine1基因编码的丝氨酸蛋白酶抑制剂在组织纤溶酶原激活物(tissueplasminogenactivator,tpa)和尿激酶(urokinaseplasminogenactivator,upa)的中起着重要的抑制作用。serpine1基因与人类多种代谢性疾病有着密切相关性，有报道显示serpine1基因与肥胖症和代谢综合征相关，其转录调控区的dna甲基化水平在能量限制下与患有代谢综合征肥胖受试者的代谢相关[1]。此外还有研究表明，纤溶酶原激活物抑制剂-1(pai-1)是已知被证明衰老相关组分关键因素，其编码基因serpine1的无义突变可以防止人体内生物衰老，无义突变的serpine1等位基因携带者具有更长的寿命，其机制可能与代谢的异常改变所导致[2]。serpine1基因编码的丝氨酸蛋白酶抑制剂具有增加纤溶酶的表达功能从而引起基质的重塑，这在恶性肿瘤的发生发展中起着重要的作用，有研究证实，serpine1基因编码的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白是包括胃癌、头颈部肿瘤和胰腺癌等多种癌症预后不良的重要生物标志物。例如，miguel等研究者表明过表达serpine1基因编码蛋白通过参与细胞外基质重塑(extracellularmatrix,ecm)诱导上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,emt)过程，进而增加头颈部鳞状癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[3]。botla等研究者发现在胰腺导管腺癌中靶基因serpine1基因上游受到mir-192调控，mir-192在胰腺导管腺癌中处于低表达状态并参与emt进程，mir-192的过表达可以减少胰腺导管腺癌细胞增殖和细胞活性并诱导细胞凋亡，mir-192的过度表达可以抑制胰腺导管腺癌细胞侵袭能力，同样在裸鼠体内也验证了同样的结果，mir-192低水平导致的serpine1基因编码的pai-1蛋白上调以及引起的emt现象可以诱导胰腺导管腺癌细胞迁移并引起胰腺导管腺癌细胞侵袭表型[4]。zhu等研究者发现在胃癌中，mir-30b处于低表达水平并且可以靶向serpine1基因编码的pai-1蛋白，过表达mir-30b促进胃癌细胞凋亡和抑制胃癌细胞的增殖，且在裸鼠体内mir-30b抑制胃癌细胞致瘤性并促进胃癌细胞在体内的凋亡，通过多种胃癌细胞系和胃癌人组织样品的结果显示mir-30b与pai-1蛋白处于负表达关系[5]。肺癌是在全球恶性肿瘤恶性肿瘤的主要种类之一，近20年来，肺癌不仅发病率高，且随着环境污染和生活节奏加快，我国肺癌呈快速增长的趋势[6]。根据国家癌症中心发布的最新版的2018年中国恶性肿瘤报告，我国肺癌在男性恶性肿瘤发病率高居首位，同时也是女性恶性肿瘤中发病率仅次于乳腺癌的主要肿瘤，因此，寻找肺癌治疗的有效靶点成为目前提高城乡居民健康的主要任务。近20年来，rna干扰(rnainterference,rnai)技术经历着高速发展，rna干扰技术也为癌症治疗带来了新的曙光和革命性的转变。rnai作为一种新兴的癌症治疗方式，具有巨大的潜力和发展前景。小发夹rna(shorthairpinrna,shrna)是一类人工合成的具有紧密的发夹转弯结构rna，它可以通过rnai的原理来沉默靶基因的表达[7]。shrna可利用载体导入细胞当中，并借由u6启动子来确保shrna的表达[8]。参考文献[1]lopez-legarreap,mansegoml,zuletma,etal.serpine1,pai-1proteincodinggene,methylationlevelsandepigeneticrelationshipswithadipositychangesinobesesubjectswithmetabolicsyndromefeaturesunderdietaryrestriction[j].jclinbiochemnutr,2013,53(3):139-144.[2]khanss,shahsj,klyachkoe,etal.anullmutationinserpine1protectsagainstbiologicalaginginhumans[j].sciadv,2017,3(11):eaao1617.[3]pavonma,arroyo-solerai,cespedesmv,etal.upa/uparandserpine1inheadandneckcancer:roleintumorresistance,metastasis,prognosisandtherapy[j].oncotarget,2016,7(35):57351-57366.[4]botlask,savants,jandaghip,etal.earlyepigeneticdownregulationofmicrorna-192expressionpromotespancreaticcancerprogression[j].cancerres,2016,76(14):4149-4159.[5]zhued,lin,libs,etal.mir-30b,down-regulatedingastriccancer,promotesapoptosisandsuppressestumorgrowthbytargetingplasminogenactivatorinhibitor-1[j].plosone,2014,9(8):e106049.[6]chenw,zhengr,zengh,etal.epidemiologyoflungcancerinchina[j].thoraccancer,2015,6(2):209-215.[7]paddisonpj,caudyaa,bernsteine,etal.shorthairpinrnas(shrnas)inducesequence-specificsilencinginmammaliancells[j].genesdev,2002,16(8):948-958.[8]brummelkamptr,bernardsr,agamir.asystemforstableexpressionofshortinterferingrnasinmammaliancells[j].science,2002,296(5567):550-553.技术实现要素：本发明的目的是提供一种新的抗人肺癌的基因serpine1及其shrna序列，本发明设计的特异性shrna序列可以有效靶向抑制serpine1基因的表达，为未来肺癌基因治疗提供高效和便捷的手段。本发明的目的可以通过以下措施达到：本发明提供一种用于抑制抗人肺癌的基因serpine1的shrna，包括下述(1)第一对干扰序列或(2)第二对干扰序列：(1)第一对干扰序列：shserpine1-1-f:ucucugcccucaccaacauuc(seqidno:2)；shserpine1-1-r:gaauguuggugagggcagaga(seqidno:3)；(2)第二对干扰序列：shserpine1-2-f:gugccugguagaaacuauuuc(seqidno:4)；shserpine1-2-r:gaaauaguuucuaccaggcac(seqidno:5)。进一步的，上述(1)第一对干扰序列或(2)第二对干扰序列中的每对序列可通过4～10bp的核苷酸形成茎环区、以回文形式相连接而形成发夹结构，如loop结构序列为：uucaagaga。本发明还提供用于表达所述shrna的dna序列，包括下述(3)第一对干扰序列或(4)第二对干扰序列：(3)第一对干扰序列：shserpine1-1-f:gatcctctctgccctcaccaacattcttcaagagagaatgttggtgagggcagagattttttg(seqidno:6)；shserpine1-1-r:aattcaaaaaatctctgccctcaccaacattctctcttgaagaatgttggtgagggcagagag(seqidno:7)；(4)第二对干扰序列：shserpine1-2-f:gatccgtgcctggtagaaactatttcttcaagagagaaatagtttctaccaggcacttttttg(seqidno:8)；shserpine1-2-r:aattcaaaaaagtgcctggtagaaactatttctctcttgaagaaatagtttctaccaggcacg(seqidno:9)。本发明还提供上述shrna或上述dna序列在用于制备抗人肺癌疾病药物中的应用。本发明还提供包含作为活性成分的所述shrna的抗人肺癌组合物。本发明还提供用于表达所述shrna的重组表达载体。进一步的，本发明所述的重组表达载体，包含上述(3)第一对干扰序列或(4)第二对干扰序列中所述的dna序列。本发明还提供包含作为活性成分的所述重组表达载体的抗人肺癌组合物。本发明还提供导入所述重组表达载体的病毒。本发明构建用于表达所述shrna的重组表达载体，构建serpine1基因敲减稳转肺癌细胞株，均可通过现有技术常规手段进行。检测serpine1的mrna及蛋白质水平的表达也可通过现有基础常规方法，如qrt-pcr及westernblot等现有技术来实现。本发明还提供基因serpine1在抗人肺癌中的应用。本发明的有益效果：本shrna的重组表达载体可以有效的敲减serpine1的mrna和蛋白水平且抑制效果好，转染荧光密度在95％左右效率高，且在三种非小细胞肺癌细胞包括a549，hcc827和h1299均有效。附图说明图1是本发明第一对干扰序列测序结果，结果显示第一对干扰序列已成功插入lv3-gfp载体。图2是本发明第二对干扰序列测序结果，结果显示第二对干扰序列已成功插入lv3-gfp载体。图3是本发明三种非小细胞肺癌细胞包括a549，hcc827和h1299干扰质粒荧光密度图，结果显示两对干扰序列对三种细胞株的干扰荧光密度在95％左右。图4是本发明三种非小细胞肺癌细胞包括a549，hcc827和h1299中adamts6的mrna水平被两对干扰序列敲减后较对照组结果，qrt-pcr结果显示adamts6的mrna水平被显著抑制。图5是本发明三种非小细胞肺癌细胞包括a549，hcc827和h1299中adamts6的蛋白水平被两对干扰序列敲减后较对照组结果，westernblot结果显示adamts6的蛋白水平被显著抑制。具体实施方式下面，通过本发明的实施例更为详细地描述本发明，但本发明的范围不会受以下实施例的限制。以下实施例中所用试剂和方法，若无特别说明，均为市售产品或本领域的常规方法。实施例11.干扰质粒制备及测序：通过ncbi网站寻找serpine1基因蛋白质编码序列(sequencecodingforaminoacidsinprotein,cds)，如seqidno:1所示，设计serpine1基因的两对shrna干扰片段的表达dna序列：(3)第一对干扰序列：shserpine1-1-f:gatcctctctgccctcaccaacattcttcaagagagaatgttggtgagggcagagattttttg(seqidno:6)；shserpine1-1-r:aattcaaaaaatctctgccctcaccaacattctctcttgaagaatgttggtgagggcagagag(seqidno:7)；(4)第二对干扰序列：shserpine1-2-f:gatccgtgcctggtagaaactatttcttcaagagagaaatagtttctaccaggcacttttttg(seqidno:8)；shserpine1-2-r:aattcaaaaaagtgcctggtagaaactatttctctcttgaagaaatagtttctaccaggcacg(seqidno:9)。并进行干扰质粒克隆(lv3-gfp载体购于上海吉玛有限公司)，将克隆成功的lv3-gfp-shserpine1质粒送至测序公司进行测序，检测插入干扰片段的序列，如图1和图2所示，表明已成功插入干扰片段的序列。2.慢病毒干扰细胞荧光观察：肺癌细胞将测序成功的质粒进行转化摇菌中提后进行慢病毒包装，将病毒上清加至三株肺癌细胞株进行serpine1基因稳定敲减，随后使用1μg/ml嘌呤霉素进行筛选，使用激光共聚焦显微镜进行观察绿色荧光，检测病毒干扰效率，通过免疫荧光结果显示(图3)，对照干扰质粒和敲减干扰质粒已成功转入三种肺癌细胞株中。3.实时荧光定量pcr技术(qrt-pcr)检测rna敲减效率：(1)总rna提取：取种于6孔板中对数生长期的细胞与细胞，弃掉培养基后，pbs洗涤两遍。加入invitrogentrizol试剂500μl，5min后将细胞吹下，加入1.5mlep管中。加入100μl氯仿，剧烈震荡15s后，室温静置10min。在4℃离心机中，12,000×g转速离心15min。取上层水相200μl，加入200μl异丙醇，轻轻上下颠倒混匀后室温静置15min。4℃、12,000×g条件离心15min，弃掉上清。加入1ml预冷的75％乙醇，4℃离心机中，12,000×g转速离心5min，弃去上清。室温晾干rna，加入50μldnase/rnase-freeddh2o，在4℃溶解30min后，测定rna浓度。(2)总rna逆转录制备cdna：使用南京诺唯赞生物科技有限公司5×hiscriptⅱqrtsupermix逆转录试剂盒进行逆转录，吸取1μg的rna加入试剂盒内rnasefreeddh2o进行体积补齐，加入逆转录酶后使用梯度pcr仪器将提取的总rna逆转成cdna，逆转录程序为25℃10min，50℃30min，85℃5min,4℃。使用上海翊圣生物科技有限公司qpcrsybrgreenmastermix试剂盒，将试剂与cdna混合，加入96孔pcr板，使用abi公司steponeplus实时荧光定量pcr仪检测三株肺癌细胞株中serpine1基因的mrna敲减效果。结果如图4显示，在三种人肺癌细胞株中，针对serpine1基因设计的两对shrna序列均可以敲减serpine1的mrna水平，并且最大的敲减可以降低至对照组的1/3左右。4.蛋白免疫印迹技术(westernblot)检测蛋白质敲减效果：(1)总蛋白提取及定量1.总蛋白提取：取6cm细胞培养皿中对数生长期的细胞，弃掉培养基，pbs洗涤2次，使用南京凯基生物科技有限公司生产的蛋白裂解液ripa和mce公司生产的蛋白酶抑制剂进行蛋白裂解。用细胞刮刮下细胞，收集于干净的1.5mlep管中。将ep管置于冰上裂解30分钟，每5分钟涡旋15-30s，共计30min。将收集的液体放入离心机，以4℃，12,000×g的条件离心15min，小心收集上清液体。2.蛋白浓度测定：用碧云天生物技术有限公司bca蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，根据所测蛋白浓度将各组蛋白浓度进行体积补齐，加入5×sdsloadingbuffer，95℃煮沸10min。蛋白样品于-20℃条件保存。(2)westernblot电泳及转膜1.蛋白电泳：配置10％的sds-page胶。每孔蛋白样品上样20μl，使用上海翊圣生物科技有限公司三色预染蛋白质分子量标准，加入1×runningbuffer，80v恒压跑胶，待蛋白标准完全分开，增大电压至120v。2.蛋白转膜：跑胶结束后，按黑色夹板-滤纸-胶-pvdf膜-滤纸-白色夹板的顺序放好，放入转膜槽，加入预冷的转膜液。所用pvdf膜购于默克密理博中国有限公司，转膜条件为300ma恒流120min。将转有蛋白的pvdf膜放入5％的脱脂牛奶中封闭2h。加入一抗，4℃孵育过夜。次日用配好的pbs-t洗膜10分钟，重复三次。将膜放入二抗中在室温下孵育2h。用pbs-t洗膜三次。使用上海天能科技有限公司数码化学发光成像系统4500sf对目的蛋白进行曝光，检测三株肺癌细胞株中serpine1蛋白的敲减效果。结果如图5显示，在三种人肺癌细胞株中，针对serpine1基因设计的两对shrna序列均可以敲降serpine1蛋白水平。序列表<110>江苏省人民医院<120>serpine1基因及其shrna序列及在抗人肺癌中的应用<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1209<212>dna<213>人(human)<400>1atgcagatgtctccagccctcacctgcctagtcctgggcctggcccttgtctttggtgaa60gggtctgctgtgcaccatcccccatcctacgtggcccacctggcctcagacttcggggtg120agggtgtttcagcaggtggcgcaggcctccaaggaccgcaacgtggttttctcaccctat180ggggtggcctcggtgttggccatgctccagctgacaacaggaggagaaacccagcagcag240attcaagcagctatgggattcaagattgatgacaagggcatggcccccgccctccggcat300ctgtacaaggagctcatggggccatggaacaaggatgagatcagcaccacagacgcgatc360ttcgtccagcgggatctgaagctggtccagggcttcatgccccacttcttcaggctgttc420cggagcacggtcaagcaagtggacttttcagaggtggagagagccagattcatcatcaat480gactgggtgaagacacacacaaaaggtatgatcagcaacttgcttgggaaaggagccgtg540gaccagctgacacggctggtgctggtgaatgccctctacttcaacggccagtggaagact600cccttccccgactccagcacccaccgccgcctcttccacaaatcagacggcagcactgtc660tctgtgcccatgatggctcagaccaacaagttcaactatactgagttcaccacgcccgat720ggccattactacgacatcctggaactgccctaccacggggacaccctcagcatgttcatt780gctgccccttatgaaaaagaggtgcctctctctgccctcaccaacattctgagtgcccag840ctcatcagccactggaaaggcaacatgaccaggctgccccgcctcctggttctgcccaag900ttctccctggagactgaagtcgacctcaggaagcccctagagaacctgggaatgaccgac960atgttcagacagtttcaggctgacttcacgagtctttcagaccaagagcctctccacgtc1020gcgcaggcgctgcagaaagtgaagatcgaggtgaacgagagtggcacggtggcctcctca1080tccacagctgtcatagtctcagcccgcatggcccccgaggagatcatcatggacagaccc1140ttcctctttgtggtccggcacaaccccacaggaacagtccttttcatgggccaagtgatg1200gaaccctga1209<210>2<211>21<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ucucugcccucaccaacauuc21<210>3<211>21<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gaauguuggugagggcagaga21<210>4<211>21<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gugccugguagaaacuauuuc21<210>5<211>21<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gaaauaguuucuaccaggcac21<210>6<211>63<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gatcctctctgccctcaccaacattcttcaagagagaatgttggtgagggcagagatttt60ttg63<210>7<211>63<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7aattcaaaaaatctctgccctcaccaacattctctcttgaagaatgttggtgagggcaga60gag63<210>8<211>63<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8gatccgtgcctggtagaaactatttcttcaagagagaaatagtttctaccaggcactttt60ttg63<210>9<211>63<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9aattcaaaaaagtgcctggtagaaactatttctctcttgaagaaatagtttctaccaggc60acg63当前第1页12当前第1页12