一种拮抗水稻黄单胞菌的溶杆菌及其分离方法与应用与流程

本发明属于水稻病害防治技术领域，涉及一种拮抗水稻黄单胞菌的溶杆菌及其分离方法与应用。

背景技术：

水稻黄单胞菌(x.oryzae)，包括水稻白叶枯病菌(xanthomonasoryzaepv.oryzae)和水稻条斑病菌(xanthomonasoryzaepv.oryzicola)两个致病变种，分别引起水稻白叶枯病(bacterialblight，bb)和细菌性条斑病(bacterialleafstreak，bls)。目前，生产上对这两个病害的防治主要依靠抗病品种和化学农药。化学农药主要包括农用链霉素、叶枯灵、叶枯唑、噻唑锌等。化学农药防治具有防效好、见效快、成本低等优点，但长期过量并不当地施用引起的“3r”(残留、再猖獗、抗性)问题已经成为食品质量安全和生态安全关注的焦点。因此，寻找新的生防微生物或其代谢产物并开发为生态安全、环境友好的生物农药将是今后病害绿色防治的发展方向。

溶杆菌属(lysobacter)细菌属于黄单胞科。截止2016年底，国际上已鉴定的溶杆菌属细菌有43个种，其中产酶溶杆菌(l.enzymogenes)、抗生素溶杆菌(l.antibioticus)、变棕溶杆菌(l.brunescens)和胶状溶杆菌(l.gummosus)这四个种具有高效抗菌活性和植物病害生防潜力，是一类新型植物病害生防细菌。这类细菌对植物病原真菌、卵菌、革兰氏阴性细菌(g^－)、阳性细菌(g⁺)和线虫都有显著的拮抗作用，其作用机理为：(1)产生小分子抗菌次生代谢物质；(2)分泌产生大量胞外酶，包括几丁质酶、β-1,3-葡聚糖、蛋白酶和纤维素酶；(3)诱导植物产生抗病性；(4)较好的定殖能力。因此，分离鉴定对水稻黄单胞菌具有拮抗活性的溶杆菌菌株，从中获得抗菌活性物质，可为新型农用抗生素的开发和水稻黄单胞菌病害的防治提供新途径。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种拮抗水稻黄单胞菌的溶杆菌及其分离方法与应用，该溶杆菌为革兰氏阴性细菌，且对水稻条斑病菌和水稻白叶病菌具有明显的拮抗作用，具有被开发为生物农药的潜能。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：

一种拮抗水稻黄单胞菌的溶杆菌，分类命名为溶杆菌(lysobactersp.)oh23，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，保藏编号：cgmccno.13677，保藏日期：2017年2月23日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明所述的菌株lysobactersp.oh23分离于江苏水稻根际土壤，其形态学及生理生化学特征如下：

形态学特征：在na培养基、tsa培养基、lb培养基生长良好，菌落黄色；10％tsa培养基生长较差，菌落白色；利用tsa培养基、lb培养基、10％tsa培养基培养时菌落边缘平整，na培养基上菌落边缘呈锯齿状；革兰氏阴性细菌，无鞭毛，可游动，单菌落扁平状，具有扩散性。

生理生化特征：简单碳源生长试验、几丁质酶活性、过氧化氢酶活性呈阳性；甲基红活性、v-p试验呈阴性；不能水解淀粉酶，能利用柠檬酸盐，能液化明胶。

16srdna特征：16srdna序列与lysobactersp.两个分离物(genbank:kx022851.1、km083544.1)及l.brunescens三个分离物(genbank:nr_041004.1、kf911330.1、ku984674.1)的16srdna部分序列同源性高达100％，并结合其生理生化特征，将菌株oh23鉴定为溶杆菌(lysobactersp.)。

上述拮抗水稻黄单胞菌的溶杆菌lysobactersp.oh23在抑制水稻黄单胞菌中的应用。

上述应用，操作步骤如下：挑取lysobactersp.oh23单菌落培养获得od600＝1.0的菌液，取50μl水稻黄单胞菌菌液(od＝1.0)，稀释100倍后铺于na平板上，吹干，再取3μllysobactersp.oh23菌液滴于含有病原菌菌液的平板上，28℃培养观察。

有益效果

lysobactersp.oh23对水稻白叶枯病菌不同菌株的生长具有显著抑制作用，对水稻条斑病菌rs105菌株拮抗效果明显，对其他菌株也表现出一定的抑制能力。lysobactersp.oh23对环境友好，是新型的生防细菌，具有开发为绿色农药的潜力，为防治水稻黄单胞菌引起的病害提供了新的途径。

附图说明

图1为本发明lysobactersp.oh23在不同培养基上培养的菌落形态；

图2为lysobactersp.oh23的电镜照片；

图3为lysobactersp.oh23对不同水稻白叶枯病菌拮抗效果对比图；

图4为lysobactersp.oh23对不同水稻条斑病菌拮抗效果；

图5为为lysobactersp.oh23的系统发育树；

图6为用mega软件中的邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树。

具体实施方式

1材料和方法

1.1试验菌株、培养基

试验菌株：水稻白叶枯病菌(xanthomonasoryzaepv.oryzae)不同菌株、水稻条斑病菌(xanthomonasoryzaepv.oryzicola)不同菌株。

培养基：

na培养基：牛肉浸膏3g，tryptone5g，yeastextract1g，蔗糖10g，蒸馏水1l，ph7.0-7.2，固体培养基分装后另加琼脂17g/l。

lb培养基：tryptone10g，nacl10g，yeastextract5g/l，蒸馏水1l，固体培养基分装后另加琼脂17g/l。

tsa培养基：trypticsoybroth30g，蒸馏水1l，固体培养基分装后另加琼脂17g/l。

10％tsa培养基：trypticsoybroth3g，蒸馏水1l，固体培养基分装后另加琼脂17g/l。

1.2土壤细菌的分离

取江苏水稻根际土样10份，经2mm土壤筛过筛，称取10g于装有90ml无菌水的三角瓶中(内有玻璃珠若干)，摇床振荡30min后10倍梯度稀释5次。吸取稀释液100μl于na培养基上涂布，28℃培养2天。稀释度以每个平板上菌落数100-300个为宜，挑取不同类型的菌落于相应培养基进一步纯化得lysobactersp.oh23菌株，纯化3次后-70℃保存。

1.3拮抗细菌对植物病原细菌的抑菌活性检测

挑取lysobactersp.oh23单菌落在na液体培养基中培养24-48h，1％接种量接种于新的na液体培养基，获得od600＝1.0的细菌菌液。取50μl病原菌菌液(od600＝1.0)，稀释100倍后铺于na平板上，吹干备用。取3μl拮抗细菌菌液(od600＝1.0)滴于含有病原菌的平板上，28℃培养2d。lysobactersp.oh23对水稻白叶枯病菌的不同菌株抑制作用显著(图3)，对水稻条斑病菌rs105菌株抑制效果明显，而对其他菌株拮抗作用较弱(图4)。

1.4拮抗菌株的鉴定

1.4.1菌落形态观察与电镜观察

菌落形态：取od600＝1.0的lysobactersp.oh23菌液5μl分别于10％tsa、tsa、na、lb培养基中央，28℃培养2-4d，观察形态。在na培养基上，菌落由嫩黄色变为金黄色，表面平坦，边缘锯齿状；在tsa、lb上，菌落金黄色，边缘整齐；在10％tsa上，生长不良，菌落白色(图1)。

电镜观察：

(1)将lysobactersp.oh23菌液划线于na培养基，在菌落生长新鲜处，使用少量灭菌水冲洗菌落，并轻轻晃动培养皿，使灭菌水在新鲜菌落周围反复冲洗，配制成菌悬液。

(2)在石蜡板上滴加1～2滴新鲜的pta负染液。

(3)取新的铜网片吸附菌悬液，置于干净的滤纸上晾干。

(4)待铜网片上的菌悬液七八成干时，将铜网片吸附菌悬液的一面接触负染液，漂浮染色15s。

(5)从负染液中取出铜网片，用滤纸吸干多余的负染液，日光灯下烤45s，使其干燥。

(6)将制作好的样品，放置于透射电镜日立h-650中，在80千伏下观察细胞

形态。oh23呈现杆状，无鞭毛(如图2)。

1.4.216srdna鉴定

利用tiangen细菌基因组提取试剂盒提取lysobactersp.oh23菌株的基因组dna，作为16srdna扩增模板，通用引物fd2(5'-agagtttgatcatggctcag-3')和rp1(5'-acggttaccttgttacgactt-3')。pcr反应体系(25μl)：10×buffer2.5μl；dntp(1.25mm)2μl；正向引物(20pmol/μl)0.5μl；反向引物(20pmol/μl)0.5μl；trans-taq聚合酶0.3μl；模板(10ng/μl)0.3μl；ddh2o18.9μl。pcr反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min30s、29个循环，72℃延伸8min。pcr反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测，见图5。

含有目的片段的pcr产物利用axygenpcrcleanup试剂盒进行纯化回收，将纯化产物进行测序，所得序列长度为1390bp。

将所得序列与ncbi核酸数据库进行同源性比对分析，挑选部分相似性高的菌株与lysobactersp.oh23菌株进行系统发育分析，用mega软件中的邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树，见图6，由图可知lysobactersp.oh23与l.brunescens遗传距离最近。

oh2316srdna序列，长度为1390bp：

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<110>江苏省农业科学院

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