本发明涉及一种重组ecorv限制性内切酶的制备方法。
背景技术：
限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型(typei)、第二型(typeii)及第三型(typeiii)。
第一型限制酶同时具有修饰及识别切割的作用；另有识别dna上特定碱基序列的能力，通常其切割位距离识别位可达数千个碱基之远。例如：ecob、ecok。
第二型限制酶只具有识别切割的作用，修饰作用由其他酶进行。所识别的位置多为短的回文序列；所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列。是遗传工程上，实用性较高的限制酶种类。例如：banhi、hindiii。
第三型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修饰及识别切割的作用。可识别短的不对称序列，切割位与识别序列约距24～26个碱基对。例如：hinfiii。
ii型限制与修饰系统所占的比例最大，达93％。
其中ii型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割dna，产生带3′-羟基和5′-磷酸基团的dna产物，需mg2+的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需sam。识别序列主要为4～6bp，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。
本发明中的ecorv限制性内切酶即属于ii型限制酶其识别位点为：
5’-gat^atc-3’
5’-cta^tag-3’
通过切割t与a之间的磷酸二酯键使3’端带有磷酸基团，5’端带有羟基。
ecorv作为一个普通的限制性内切酶，它在生物领域很常见，有关ecorv蛋白性质特征及功能机制也早有报道。目前商品化ecorv蛋白的价格较为适中，许多生物公司都有此类产品。通过对本蛋白的研发可以增加在产品方面的竞争力。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种重组ecorv限制性内切酶的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，重组ecorv限制性内切酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)表达质粒pcreatduet-ecorv-甲基化酶的构建；
(2)ecorv与甲基化酶蛋白的诱导表达与鉴定；
(3)ecorv与甲基化酶蛋白的纯化与鉴定。
作为优选，步骤(1)具体包括以下步骤：
(4)ecorv与甲基化酶的基因合成
根据密码子优化后的基因序列，直接进行基因合成；
(5)gibson重组连接
将pcreatduet通过酶切进行线性化，线性化产物与步骤(4)的基因合成产物进行无缝克隆；
(6)重组产物转化
将上述重组连接产物20μl转移到top10感受态细胞中，冰上静置30min，42℃热激90s，冰上再静置2min；加入600ullb液体培养基，37℃摇床200rpm摇45min，涂布于含50ug/ml卡那霉素的lb平板中，37℃培养箱培养过夜；
(7)重组克隆的鉴定
随机挑取至少4个克隆，接入4ml含卡那霉素lb中；37℃摇床220rpm摇过夜，抽提质粒并测序。
作为优选，步骤(2)具体包括以下步骤：
(8)重组质粒转化大肠杆菌
将上述鉴定为阳性的重组质粒pcreatduet-ecorv-甲基化酶转入感受态bl21(de3)中，涂布于含卡那霉素的lb平板上，37℃倒置培养过夜；
(9)iptg诱导蛋白表达
挑单克隆于含卡那霉素lb中，37℃摇床，220rpm培养过夜，以1∶100接过夜菌于4ml含卡那霉素lb板中，继续培养2.5h，od600nm达到0.6～0.8时加入iptg至0.5mm，于15℃过夜诱导蛋白表达；
(10)sds-page鉴定
取2ml菌液12000rpm离心1min收集菌体，加入100μl的1×上样缓冲液，煮沸5min，冷却后12000rpm离心1min，取10μl样品进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，取下凝胶利用快染仪染色脱色10min，观察诱导前后蛋白条带的变化，结果显示目的蛋白有表达。
作为优选，步骤(3)具体包括以下步骤：
(11)ecorv-甲基化酶蛋白的诱导表达
将过夜培养已转入pcreatduet-ecorv-甲基化酶的bl21(de3)菌液以1∶100接于800ml含卡那霉素lb中，37℃摇床，220rpm培养2h，od600nm达到0.6-0.8时，加入iptg至0.5mm，于15℃过夜诱导蛋白表达，8000rpm离心10min，收集菌体，-20℃保存；
(12)细菌蛋白表达形式的分析
-20℃冻存菌体按每克湿菌5ml的比例加入细菌裂解液，超声破菌，4℃，16000rpm离心15min，沉淀在底部，分别取上清、包涵体做sds-page，结果显示ecorv蛋白一部分存在于上清中；
(13)ecorv蛋白的纯化
收集菌体加入裂解液重悬，超声破碎后离心，16000rpm离心15min，将上清液置于干净的50ml的离心管中加入2mlni柱，4℃孵育2h，裂解液洗柱100ml；利用含有20mm咪唑的裂解液洗脱30ml，含有500mm咪唑的裂解液洗脱5ml；以ecorv储存液作为流动相过分子筛superdex200，根据紫外吸收值收集含目的蛋白的洗脱液，将目的蛋白液用12％的sds-page进行检测。
本发明的有益效果是：
本发明应用蛋白纯化系统，superdex200分子筛层析对蛋白进行提纯，经纯化工艺摸索及条件优化，整个纯化过程仅需5～6h，极大简化了纯化过程及时间，从而保证了酶活性，有利于酶产量的提高，且纯化后ecorv经酶活力及纯度鉴定，其比活力为3.5×106u/mg，提纯20倍，得率为30％，产量达7.8×106units/gwetcell，在产量和效率上较之前报道均有很大提高。该纯化工艺的新方法，为研发及生产其他ii型限制性内切酶奠定了基础。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明作进一步阐述。
1.菌种
宿主菌大肠杆菌top10、bl21(de3)及表达载体pcreatduet。
2.试剂
限制性内切酶为neb(北京)有限公司产品；pcreatduet为通用生物系统(安徽)有限公司研发；dna聚合酶为通用生物系统(安徽)有限公司蛋白部自产；胶回收及质粒小抽试剂盒为axygen产品；nintabeads6ff购自常州天地人和生物科技有限公司；t4dna连接酶购自thermo公司。
3.蛋白酶基因合成
ecorv蛋白酶与甲基化酶基因由通用生物系统(安徽)有限公司基因部根据基因序列直接合成，5’及3’分别带有pcreatduet的同源臂。
4.pcreatduet-ecorv-甲基化酶表达载体的构建
将ecorv蛋白酶基因及线性化载体pcreatduet利用利用重组酶进行同源重组，重组产物转化大肠杆菌top10，抽提质粒由本公司测序部进行测序验证。
5.pcreatduet-ecorv-甲基化酶表达及产物纯化
将测序正确的阳性重组子转化到大肠杆菌bl21(de3)中挑取单菌落转化到30ml含卡那霉素(50mg/ml)的lb液体培养基中，37℃培养过夜，次日按1∶100接种至800ml含卡那霉素的液体培养基中，37℃培养，当od600达到0.5时加入iptg(终浓度0.5mm)于15℃诱导过夜。
收集菌体加入裂解液重悬，超声破碎后离心，16000rpm离心15min，将上清液置于干净的50ml的离心管中加入2mlni柱，4℃孵育2h，裂解液洗柱100ml。利用含有20mm咪唑的裂解液洗脱30ml，含有500mm咪唑的裂解液洗脱5ml。以ecorv储存液作为流动相过分子筛superdex200，根据紫外吸收值收集含目的蛋白的洗脱液，将目的蛋白液用12％的sds-page进行检测。
6.将目的蛋白纯化产物进行酶切验证。
以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。