一种阳离子聚合物及其制备方法和应用与流程

本发明属于高分子材料技术领域，具体涉及一种阳离子聚合物及其制备方法和应用。

背景技术：

近几十年来，聚合物纳米材料由于其在药物传递、基因转染和抗感染等领域的应用前景得到了广泛而深入的研究。然而，由于人体内复杂的生理环境，聚合物纳米材料难以跨越多重生理屏障和细胞屏障而到达作用靶点。由于所有生物体的细胞膜表面都带负电荷(t.yeung,etal.,science,2008,319,210-213)，研究者们发现到带有阳离子的纳米粒子能够与带负电荷的细胞表面通过静电相互作用相结合，并有效刺穿细胞膜(a.verma,etal.,small,2010,6,12-21；y.obata,etal.,journalofcontrolledrelease,2010,142,267-276)。例如，近十年来陆续发现的细胞穿透肽或细胞膜融合肽均为带有正电荷的天然多肽，能够以非受体依赖的非经典内吞方式直接穿过细胞膜进入细胞，并且不受细胞类型的限制，在细胞生物学、基因治疗及药物学领域具有很高的研究价值和应用前景(g.l.bidwelliii,etal.,journalofcontrolledrelease,2009,135,2-10)。对于合成材料，阳离子型脂质体和树状大分子已经被用来运输药物进入细胞。其中两亲性阳离子聚合物能自组装形成带有正电荷的纳米粒子，不仅可以浓缩dna，还能与带负电的细胞膜相互作用，提高纳米粒子的细胞内在化能力(m.ding,etal.,biomacromolecules,2014,15,2896-2906；m.ding,etal.,biomaterials,2011,32,9515-9524；k.saha,etal.,small,2013,9,300-305)，因而在抗肿瘤药物传输、基因转染和抗菌等领域引起了广泛的关注。

此外，基于生物体内正常组织和病灶区域以及不同细胞器中具有不同的ph值的特点(n.rapoport,progressinpolymerscience,2007,32,962-990)，具有质子缓冲能力的阳离子聚合物一方面能在病理环境下特异性增加表面电荷，提高细胞相互作用的靶向性，另一方面能够发挥类似“质子海绵”的作用来破坏内涵体膜，从而帮助纳米载体实现内涵体逃逸和向特定细胞器的传输，提高转染效率和疗效(w.gu,etal.,biomacromolecules,2013,14,3386-3389)。目前广泛研究的具有质子化能力的阳离子聚合物，如聚乙烯亚胺(pei)(j.liu,etal.,bioconjugatechemistry,2010,21,1827-1835；cn104419004a)、聚甲基丙烯酸n,n-二甲基氨基乙酯(pdmaema)(s.lin,etal.,biomacromolecules,2007,9,109-115；cn104861098a)和聚酰胺胺树状大分子(pamam)(r.esfand,etal.drugdiscoverytoday,2001,6,427-436；cn103435815a)等，由于较强的dna结合能力和一定的膜穿透性已经广泛应用于药物和基因传输。然而，这些阳离子聚合物材料大多数缺乏降解性能，不仅造成药物和基因的释放困难，并且可能导致对生物体的毒性。聚赖氨酸作为一种阳离子多肽，具有良好的生物相容性、优异的生物可降解性能和独特的高级构象，但其侧链阳离子基团主要为一级胺结构，质子化缓冲能力不够高，导致入胞效率相对较低，缺乏内体破坏能力，并且转染活性比支化pei低一个数量级，限制了其应用。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述缺陷，提供一种阳离子聚合物。所得阳离子聚合物为改性的聚赖氨酸衍生物，所得阳离子聚合物具有多层次多级支化胺结构，具有可控的质子缓冲能力，从而易于对聚合物的膜穿透性、转染能力、细胞相互作用进行调控。

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种阳离子聚合物，所述阳离子聚合物含有式i所述的结构：

式i中，r1为碳原子数为5～40的叔胺或季铵基团，r2为氢原子或r1；0≤m<156，0<n≤156；/表示式i所示结构中的赖氨酸与赖氨基酸衍生物为嵌段共聚或无规共聚；优选的r1为碳原子数为8～22的叔胺或季铵基团。m为赖氨酸残基数，n为含r1和r2基团的赖氨酸衍生物的残基数。

进一步，所述r1选自：(3-二甲氨基丙基)乙基酰胺、(3-二乙胺基丙基)异丙基酰胺、乙基酰氧乙基二甲基胺、异丙基酰氧乙基二甲基胺、异丙基酰氧乙基二异丙基胺、(2-二异丙基氨基乙基)异丙基酰胺、异丙基酰氧乙基-4-吗啉、(6-二乙胺基己基)乙基酰胺、2-羟基丙基二甲氨基甲基醚、n,n,n,n-四甲基-2-乙基酰氧基-丙二胺、[(3-乙基酰氧甲基)苄基]哌啶、[3-(1-咪唑基)丙基]乙基酰胺、(3-乙基酰胺丙基)三甲基氯化铵、(3-异丙基酰胺丙基)三甲基氯化铵、[2-(异丙基酰氧基)乙基]三甲基氯化铵、[2-(异丙基酰氧基)乙基]三丙基溴化铵、(4-乙基苄基)三甲基氯化铵、乙基酰氧甲基十八烷基二甲基氯化铵、[(2-乙基酰氧基)十六烷基]三甲基氯化铵、[(2-乙基酰氧甲基)二十一烷酰氧丙基]三甲基氯化铵、n-十二烷基-n-2-羟基乙基-n-乙基酰氧乙基苯甲基氯化铵、乙基酰胺甲基双十六烷基甲基溴化铵或2-羟基丙基三甲基氯化铵。

进一步，式i中，s＝n/(m+n)，0＜s≤100％，优选的10≤s≤80％。

进一步，所述阳离子聚合物的结构还包括聚合物m结构，所述聚合物m为聚乙二醇、聚酯、聚碳酸酯、聚氨酯、聚脲、聚氨基酯、聚酯酰胺或聚氨基酸中的至少一种。

进一步，所述阳离子聚合物的结构式如式ii-式ⅹ所示：

上述结构式中，peg-聚乙二醇，pcl-聚己内酯(聚酯)，pla-聚乳酸(聚酯)，plg-聚氨基酸，pu-聚氨酯，pur-聚脲，pzlg-聚氨基酸。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供上述阳离子聚合物的制备方法，所述制备方法为：聚赖氨酸或聚赖氨酸共聚物，与叔胺或季铵衍生物单体通过加成反应，在聚赖氨酸或聚赖氨酸共聚物侧链上的自由氨基上引入仲胺、叔胺或季铵基团，即得到所述阳离子聚合物。

进一步，所述制备方法为：将聚赖氨酸或聚赖氨酸共聚物与碱、有机溶剂搅拌溶解，然后加入叔胺或季铵衍生物单体，0～90℃条件下反应12～72h，最后将反应液透析后冻干得到所述阳离子聚合物。

进一步，上述方法中，聚赖氨酸共聚物为聚赖氨酸和聚合物m的共聚物，聚合物m与聚赖氨酸衍生物的质量比为10～90：10～90。

进一步，上述方法中，所述叔胺或季铵衍生物单体选自：(3-丙烯酰胺丙基)三甲基氯化铵、(3-甲基丙烯酰丙基)三甲基氯化铵、(3-二甲氨基丙基)丙烯酰胺、(3-二乙胺基丙基)甲基丙烯酰胺、丙烯酸-2-(二甲氨基)乙酯、甲基丙烯酸-2-(二甲氨基)乙酯、甲基丙烯酸-2-(二异丙基氨基)乙酯、(2-二异丙基氨基乙基)甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸-2-(4-吗啉基)乙酯、[2-(甲基丙烯酰氧)乙基]三甲基氯化铵、[2-(甲基丙烯酰氧)乙基]三丙基溴化铵、(6-二乙胺基己基)丙烯酰胺、2,3-环氧丙基三甲基氯化铵、2,3-环氧丙基二甲氨基甲基醚、丙烯酸-1,3-二(二甲氨基)异丙酯、(4-乙烯基苄基)三甲基氯化铵、丙烯酰氧甲基十八烷基二甲基氯化铵、[(2-丙烯酰氧基)十六烷基]三甲基氯化铵、[(3-丙烯酰氧甲基)苄基]哌啶、[(2-丙烯酰氧甲基)二十一烷酰氧丙基]三甲基氯化铵、n-十二烷基-n-2-羟基乙基-n-丙烯酰氧乙基苯甲基氯化铵、丙烯酰胺甲基双十二烷基甲基溴化铵、丙烯酰胺甲基双十六烷基甲基溴化铵或[3-(1-咪唑基)丙基]丙烯酰胺等化合物中的至少一种。

进一步，上述方法中，叔胺或季铵衍生物单体与：聚赖氨酸或聚赖氨酸共聚物中赖氨酸残基数量的摩尔比为1：10～50：1；优选为：1：2～10：1。

进一步，上述方法中，所述有机溶剂为乙腈、甲醇、乙醇、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、丙酮、二氧六环或水中的至少一种。

进一步，上述方法中，所述碱为无机碱或有机碱；所述有机碱为二乙胺、三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶、甲基吡啶或4-二甲氨基吡啶；所述无机碱为碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、或氢氧化钾。本发明中，碱、有机溶剂的加入量使得聚赖氨酸或其衍生物中的氨基脱盐溶解即可。所述碱的添加量为聚赖氨酸或聚赖氨酸共聚物质量的2～10％。

本发明要解决的第三个技术问题是提供一种提高聚赖氨酸或聚赖氨酸共聚物质子化缓冲能力的方法，即在聚赖氨酸或聚赖氨酸共聚物侧链上的自由氨基上引入仲胺、叔胺或季铵基团。

进一步，所述提高聚赖氨酸或聚赖氨酸共聚物质子化缓冲能力的方法为：聚赖氨酸或聚赖氨酸共聚物，与叔胺或季铵衍生物单体通过加成反应，在聚赖氨酸或聚赖氨酸共聚物侧链上的自由氨基上引入仲胺、叔胺或季铵基团。

进一步，所述提高聚赖氨酸或聚赖氨酸共聚物质子化缓冲能力的方法为：将聚赖氨酸或聚赖氨酸共聚物与碱、有机溶剂搅拌溶解，然后加入叔胺或季铵衍生物单体，0～90℃条件下反应12～72h，最后将反应液透析后冻干得即可。

本发明要解决的第四个技术问题是：上述阳离子聚合物在自组装、药物或基因传输、抗菌中的应用。

本发明与已有技术相比，具有以下优点和有益效果：

1、本发明提供的阳离子聚合物为改性的聚赖氨酸衍生物，具有良好的生物相容性和生物降解性能，且降解产物为天然氨基酸，具有非常好的生物安全性。

2、本发明可通过选择r1和r2基团的种类、碳原子数以及s的大小，调控阳离子聚合物的质子化能力。

3、本发明提供的阳离子聚合物具有多层次多级支化胺结构，具有可控的质子缓冲能力，从而易于对聚合物的膜穿透性、转染能力、细胞相互作用进行调控。

4、本发明所得阳离子聚合物与质子缓冲能力比较强的pei、pamam相比，其生物相容性和生物降解性能较好；与聚赖氨酸相比，其具有更高层次的伯、仲、叔、季支化胺结构，因此质子缓冲能力、质子化能力可控性、细胞穿透能力和转染效果更好。

5、本发明提供的阳离子聚合物具有独特的二级构象，并且可以通过侧基结构的改变来调控构象及其响应性，对聚合物的使用效果和生理活性具有重要的意义。

6、本发明提供的阳离子聚合物的制备过程简单，反应速率较快，后处理简单，易于推广。

7、本发明提供的阳离子聚合物在自组装、药物或基因传输、抗菌等领域具有较大的应用价值。

附图说明

图1为对比例1所得共聚物的核磁共振氢谱图。

图2为实施例2制备的阳离子聚合物的核磁共振氢谱图。

图3为实施例3制备的阳离子聚合物的核磁共振氢谱图。

图4为实施例2和3制备的阳离子聚合物及对比例1所得共聚物的红外谱图。

图5为实施例2和3制备的阳离子聚合物及对比例1所得共聚物的凝胶渗透色谱图。

图6a为实施例2和3制备的阳离子聚合物及对比例1所得共聚物的ph滴定曲线，图6b为实施例2和3制备的阳离子聚合物及对比例1所得共聚物的ph～质子化程度(α)曲线。

图7为实施例2和3制备的阳离子聚合物及对比例1所得共聚物的圆二色谱图。

图8为实施例2和3制备的阳离子聚合物及对比例1所得共聚物与hela细胞培养1h和2h后的流式细胞术结果。

具体实施方法：

本发明提供一种阳离子聚合物，其实质上是得到一种改性聚赖氨酸或其衍生物，即在聚赖氨酸或其衍生物的“侧链”上引入多层次的仲胺、叔胺或季铵基团；引入的位置为侧链末端的自由氨基，具体可采用季铵盐或叔胺衍生物单体与氨基进行加成反应，可在引入位点处也形成仲胺或叔胺结构。

以下列举的是本发明的若干具体实施例子，但值得指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的普通专业人员根据上述发明的内容对本发明所作出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1：

将0.2g聚赖氨酸(数均分子量为1500)、0.01g氢氧化钾加入反应瓶，加入乙腈/蒸馏水(v:v＝2:1)混合溶剂8ml搅拌溶解；然后加入2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(0.49g，其与赖氨酸残基的摩尔比，即反应当量比为2:1)的乙醇溶液，在室温下反应12h；反应结束后将反应液透析后冻干得到阳离子聚合物。

实施例2：

将0.45g聚乙二醇-聚赖氨酸共聚物(聚乙二醇数均分子量为5000，聚赖氨酸数均分子量为2560)和0.02g氢氧化钠加入反应瓶，加入甲醇/蒸馏水(v:v＝3:1)的混合溶剂12ml搅拌溶解；然后加入(3-二甲氨基丙基)丙烯酰胺(0.58g，其与赖氨酸残基的摩尔比，即反应当量比为3:1)的甲醇溶液，在冰浴下反应24h；反应结束后将反应液透析后冻干得到阳离子聚合物。

实施例3：

将0.45g聚乙二醇-聚赖氨酸共聚物(聚乙二醇数均分子量为5000，聚赖氨酸数均分子量为2560)和0.025g氢氧化钠加入反应瓶，加入四氢呋喃12ml搅拌溶解；然后加入(3-丙烯酰胺丙基)-三甲基氯化铵(0.77g，其与赖氨酸残基的摩尔比，即反应当量比为3:1)的甲醇溶液，在冰浴下反应2h，然后室温反应48h；反应结束后将反应液透析后冻干得到阳离子聚合物。

对比例1：

聚乙二醇-聚赖氨酸共聚物通过本领域常规技术手段合成，其中聚乙二醇数均分子量为5000，聚赖氨酸数均分子量为2560。

实施例4：

将2.5g聚乙二醇-聚赖氨酸-聚己内酯共聚物(聚乙二醇数均分子量为5000，聚赖氨酸数均分子量为19200，聚己内酯数均分子量为3000)和0.4ml三乙胺加入反应瓶，加入15ml二甲基甲酰胺搅拌溶解；然后加入[3-(1-咪唑基)丙基]丙烯酰胺(2.48g，其与赖氨酸残基的摩尔比，即反应当量比为1:1)的二甲基甲酰胺溶液，在室温下反应24h；反应结束后将反应液透析后冻干得到阳离子聚合物。

实施例5：

将0.75g聚乙二醇-聚赖氨酸-聚谷氨酸共聚物(聚乙二醇数均分子量为2000，聚赖氨酸数均分子量为640，聚谷氨酸数均分子量为1935)和氢氧化钠(0.03g)加入反应瓶，加入10mln,n-二甲基乙酰胺/蒸馏水(v:v＝4:1)搅拌溶解；然后加入丙烯酸-1,3-二(二甲氨基)异丙酯(6.55g，其与赖氨酸残基的摩尔比，即反应当量比为40:1)的甲醇溶液，在室温下反应72h；反应结束后将反应液透析后冻干得到阳离子聚合物。

实施例6：

将1.64g聚乙二醇-聚赖氨酸-聚乳酸共聚物(聚乙二醇数均分子量为3000，聚赖氨酸数均分子量为5120，聚乳酸数均分子量为4320)和0.34g二异丙基乙胺加入反应瓶，加入17ml乙腈溶剂搅拌溶解。然后加入丙烯酰胺甲基双十六烷基甲基溴化铵(0.68g，其与赖氨酸残基的摩尔比，即反应当量比为1:5)的乙腈溶液，90℃下反应24h；反应结束后将反应液透析后冻干得到阳离子聚合物。

实施例7：

将2.04g聚赖氨酸-聚氨酯共聚物(聚赖氨酸数均分子量为15360，聚氨酯数均分子量为3000)和0.35g三乙胺加入反应瓶，加入17ml二甲基亚砜溶剂60℃搅拌溶解。然后加入[(3-丙烯酰氧甲基)苄基]哌啶(5.12g，其与赖氨酸残基的摩尔比，即反应当量比为5:3)的二甲基亚砜溶液，室温反应48h；反应结束后将反应液透析后冻干得到阳离子聚合物。

实施例8：

将2.31g聚乙二醇-聚赖氨酸-聚脲共聚物(聚乙二醇数均分子量为5000，聚赖氨酸数均分子量为3840，聚脲数均分子量为20000)和0.15g氢氧化钾加入反应瓶，加入20ml二甲基亚砜/蒸馏水(v:v＝3:1)搅拌溶解。然后加入甲基丙烯酸-2-(二异丙基氨基)乙酯(2.08g，其与赖氨酸残基的摩尔比，即反应当量比为10:1)的二甲基亚砜溶液，室温反应48h；反应结束后将反应液透析后冻干得到阳离子聚合物。

实施例9：

将1.25g聚赖氨酸-聚谷氨酸苄脂共聚物(聚赖氨酸数均分子量为4480，聚脲数均分子量为6570)和0.10g二异丙基乙胺加入反应瓶，加入12ml二甲基甲酰胺溶液搅拌溶解。然后加入n-十二烷基-n-2-羟基乙基-n-丙烯酰氧乙基苯甲基氯化铵(0.18g，其与赖氨酸残基的摩尔比，即反应当量比为1:10)的二甲基甲酰胺溶液，80℃下反应24h；反应结束后将反应液透析后冻干得到阳离子聚合物。

以实施例2和3的产物为例，并选择相同聚合度的聚赖氨酸共聚物作为对比例1进行技术效果评价。图1-3为对比例1及实施例2和3制备的阳离子聚合物的核磁共振氢谱图，其中δ1.50～2.35，δ3.50处为聚合物侧链亚甲基的峰，δ3.85处为聚乙二醇链段中乙氧基质子的化学位移，实施例2制备的阳离子聚合物中侧链甲基的峰在δ3.00ppm处(图2)，实施例3制备的阳离子聚合物中侧链季铵甲基的特征峰位于δ3.23处(图3)。

图4为实施例2和3制备的阳离子聚合物及对比例1所得共聚物的红外谱图，由图4可知，侧链修饰后两种聚合物的特征峰位置相似，n-h峰(3500～3300cm^-1)，酰胺i带峰(1690～1650cm^-1)，酰胺ii带峰(1600cm^-1)，酰胺iii带峰(1400cm^-1)，醚键特征峰(1275～1020cm^-1)都能找到归属(图4)。

另外，图5为实施例2和3制备的阳离子聚合物及对比例1所得共聚物的凝胶渗透色谱图；从gpc结果可以看出实施例2和3制备的阳离子聚合物的分子量比对比例1所得共聚物大，证明化学反应的成功。

为了研究本发明所提供的阳离子聚合物的质子化能力，以实施例2和实施例3以及对比例1为例进行了ph滴定实验，结果如图6所示。由图6可以看出，实施例2和实施例3制备的阳离子聚合物相比对比例1所得共聚物具有更好的质子缓冲能力，其能够将对比例1所得共聚物的pka值从10.6分别降低到6.8和7.5，这是因为实施例2和3制备的阳离子聚合物具有多层次和多级支化胺结构。该实验证明本发明可通过对侧链r基的选择，可以实现阳离子聚合物的质子化能力的调控，从而有望进一步对聚合物的膜穿透性、转染能力、细胞相互作用进行调节。

为了进一步证明本发明提供的阳离子聚合物具有独特的二级构象，对实施例2和3所制备的阳离子聚合物及对比例1所得共聚物进行圆二色谱测试；结果如图7所示，对比例1所得共聚物在水溶液中主要为无规卷曲结构，实施例2制备的阳离子聚合物表现为含有β折叠的混合构象，实施例3制备的阳离子聚合物则呈现为含有α螺旋的混合构象。该结果说明本发明可以通过改变侧链r基团的结构来调控阳离子聚合物的二级构象，对聚合物的使用效果和生理活性具有重要的意义。

为了评价本发明提供的阳离子聚合物的膜穿透性能和细胞相互作用，使用异硫氰酸荧光素酯标记对比例1所得共聚物、实施例2和3制备的阳离子聚合物，并与hela肿瘤细胞共同培养1h和2h，用流式细胞术检测细胞内的荧光强度，结果如图8所示。由图8可见，实施例2和3制备的阳离子聚合物的入胞效率均显著高于对比例1所得共聚物，并且实施例2制备的阳离子聚合物相比实施例3制备的阳离子聚合物具有更好的细胞穿透性能，这说明本发明提供的阳离子聚合物不仅有效提高聚赖氨酸的入胞能力，而且可以通过侧链基团的选择调节阳离子聚合物的膜渗透性和细胞内在化性能。

尽管上面结合实施例描述了本发明，但是本领域技术人员应该清楚，在不脱离权利要求的精神和范围的情况下，可以对上述实施例进行各种修改。