盐生草HgNHX基因启动子序列及其应用的制作方法

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种盐生植物hgnhx(盐生草液泡膜na⁺/h⁺反转运体)基因启动子序列克隆及其应用。

背景技术：

启动子为位于相应调控基因5'端上游区域，是调控基因转录的中心，与rna聚合酶识别及结合后开启基因的转录过程，包含多种能与转录因子相结合的顺式作用元件，可参与调控下游相应基因的表达，使的植物能够有效调控生长发育和应对外界环境的变化。植物中的启动子主要分为组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子三种类别。各类别启动子启动的基因表达特性呈现多样性，且存在明显的种属差异性，植物中有些基因的启动子并不只属于其中一种类别，有时会表现出其他类别启动子的特性。

当前，随着分子生物学技术的迅速发展和转基因技术手段的逐步完善，使得通过转基因手段提高植物(作物)产量、品质和对逆境胁迫的适应能力成为现实。虽然优异外源基因的获得在很大程度上促进了转基因育种的发展，但如何提高外源基因在转基因植株中的表达量及组织表达特异性也严重制约了转基因技术的应用价值与范围，究其主要原因在于优良基因启动子的缺乏，如当前转基因技术中，组成型启动子仍主要以camv35s为主。因此，发掘植物中新的启动子，并对其功能进行研究，对植物转基因技术的发展具有重要的经济价值和应用价值。

盐生草(halogetonglomeratus)作为我国西北旱区特有盐生植物，其主要的耐盐特性在于肉质化叶片的盐分液泡区隔化。一般认为nhx(液泡膜na⁺/h⁺反转运体)基因是负责盐分液泡区隔化的主要转运体，因此，位于盐生草nhx基因上游的启动子作为重要的顺式作用元件，克隆其启动子序列，并对其进行功能分析，可为提高植物(作物)盐分液泡区隔化的育种实践提供重要的启动子序列资源。

技术实现要素：

本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种盐生草hgnhx基因启动子序列，以丰富植物转基因育种实践中基因启动子的选择。

本发明的又一目的在于提供了一种盐生草hgnhx基因启动子序列的制备方法，并进行生物信息学分析，在能够实现快速、准确的获得该启动子序列的同时，明晰了其序列特征。

本发明的还一目的在于提供了一种盐生草hgnhx基因启动子序列在植物抗逆转基因技术领域中的应用。证实了盐生草hgnhx基因启动子属于组成型启动子类型，为其在植物转基因育种实践中的应用提供依据。

本发明以盐生草hgnhx基因5’端上游1527bp核苷酸序列作为全长启动子序列，以此为模板，设计不同的上游引物f1、f2、f3、f4及下游引物r，通过pcr扩增获得hgnhx1基因上游长度分别为615bp(seqno1.)、938bp(seqno2.)、1178bp(seqno3.)和1527bp(seqno4.)的缺失不同长度启动子片段，分别命名为第一片段启动子、第二片段启动子、第三片段启动子和hgnhx基因全长启动子，并进行序列特征的生物信息学分析，然后分别与gus报告基因融合后转化拟南芥，并对阳性克隆植株不同组织、不同发育时期进行gus染色检测，确定各hgnhx基因缺失不同长度片段启动子在转基因植株中行使正常功能，具有组成型启动子特性。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种盐生草hgnhx基因启动子序列，其主要特点在于以hgnhx基因全长启动子为模板，构建出hgnhx1基因缺失长度为615bp第一片段启动子，序列为seqno1；

或以hgnhx基因全长启动子为模板，构建出hgnhx1基因缺失长度为938bp第二片段启动子，序列为seqno2；

或以hgnhx基因全长启动子为模板，构建出hgnhx1基因缺失长度为1178bp第三片段启动子，序列为seqno3：

所述的盐生草hgnhx基因启动子序列，所述的hgnhx基因全长启动子位于hgnhx基因编码区5’端上游，全长为1527bp，其序列如seqno4：

所述的盐生草hgnhx基因启动子序列，其特异性扩增引物分别为：

所述的seqno1.上游引物f1为5’-ttaagtatatgaggaagatcagctc-3’；

所述的seqno2.上游引物f2为5’-tcagcaaaagtttcattggcat-3’；

所述的seqno3.上游引物f3为5’-tttttgtctctcctttcttctag-3’；

所述的seqno4.上游引物f4为5’-tattcactgattccccgcaca-3’；

各序列共同下游引物r为5’-tgtatactcacacccaaaagctcc-3’。

所述的盐生草hgnhx基因启动子序列，其均为组成型启动子。

所述的盐生草hgnhx基因启动子序列，其与抗逆相关基因融合转入植物体中，实现基因的正常表达。所述的盐生草液泡膜na⁺/h⁺反转运体hgnhx基因启动子序列的制备方法，其步骤为：

盐生草hgnhx基因启动子序列克隆中，参照ctab法提取盐生草基因组dna，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测质量，分别用上游引物f1：5’-ttaagtatatgaggaagatcagctc-3’、f2：5’-tcagcaaaagtttcattggcat-3’、f3：5’-tttttgtctctcctttcttctag-3’、f4：5’-tattcactgattccccgcaca-3’及共同下游引物r：5’-tgtatactcacacccaaaagctcc-3’(由上海生工生物工程有限公司合成)来扩增hgnhx1基因上游长度分别为615bp第一片段启动子、938bp第二片段启动子、1178bp第三片段启动子、1527bp的所述的hgnhx基因全长启动子，pcr扩增体系为10×extaqbuffermg²⁺plus2.5μl，dntpmixture各2.5mm2μl，上游引物10μm1μl，下游引物10μm1μl，dna1μl，extaq酶5u/μl0.2μl，ddh2o17.3μl，总体积25μl。其中

第一片段启动子反应程序为94℃预变性4min；94℃30s，62℃30s，72℃30-45s，35个循环；72℃延伸7-8min；

第二片段启动子反应程序为94℃预变性4min；94℃30s，62℃30s，72℃45s-1min，35个循环；72℃延伸7-8min；

第三片段启动子反应程序：94℃预变性4min；94℃30s，56℃30s，72℃1min-1min15s，35个循环；72℃延伸7-8min；

所述的hgnhx基因全长启动子反应程序：94℃预变性4min；94℃30s，64℃30s，72℃1min30s-1min45s，35个循环；72℃延伸7-8min。

上述所得4个pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，并用takaraminibestdna胶回收试剂盒(大连宝生物工程有限公司)，参照该试剂盒说明书操作步骤对pcr产物进行回收，接着将回收产物与pmd19-t(大连宝生物工程有限公司)载体连接，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，筛选蓝白斑，并进行菌落pcr鉴定，电泳检测包含有目标条带的菌液送上海生工生物工程公司进行测序，测序结果分别如seqno1.，seqno2.，seqno3.和seqno4.所示。

所述的盐生草hgnhx基因启动子序列在植物抗逆转基因技术领域中的应用：

第一片段启动子在植物抗逆转基因技术领域中的应用；

第二片段启动子在植物抗逆转基因技术领域中的应用；

第三片段启动子在植物抗逆转基因技术领域中的应用。

该发明的有益效果在于：

1.公开了盐生草hgnhx基因缺失不同长度片段的启动子序列，并证实可在转基因拟南芥中行使正常功能，具有组成型启动子的特性，且这些启动子序列中含有各种响应非生物逆境胁迫和激素响应功能元件，是植物(作物)抗逆转基因育种中优异的启动子资源。

2.本发明中所述的盐生草hgnhx基因缺失不同长度片段的启动子序列长度分别为615bp、938bp、1178bp和1527bp，序列均较短，降低了基因重组的和遗传转化操作难度，对植物(作物)中抗逆基因的表达具有重要应用价值。

附图说明：

图1为hgnhx基因上游启动子缺失不同长度片段的pcr扩增。m：d1000或2000marker；1-3或4为pcr产物。

a:δ1的扩增；b:δ2的扩增；c：δ3的扩增；d:δ4(全长)的扩增；

图2为hgnhx基因上游启动子不同片段表达载体双酶切鉴定。m:d15000marker；δ1-δ4:双酶切结果；

图3为hgnhx基因上游启动子不同片段转化拟南芥植株pcr鉴定。m:d1000或2000marker；1-3为pcr产物，wt为野生型对照；

a:δ1的扩增，b:δ2的扩增，c：δ3的扩增，d:δ4(全长)的扩增；

图4为δ4转基因拟南芥幼苗、花序的gus染色分析；

a-b:转基因拟南芥；c:野生拟南芥；d:转基因拟南芥花序；e:野生拟南芥花序；

图5为不同缺失长度片段hgnhx启动子片段启动gus基因在拟南芥中的表达；

a:δ1转基因拟南芥；b:δ2转基因拟南芥；c:δ3转基因拟南芥；d:δ4(全长)转基因拟南芥；e:野生型拟南芥。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，并非限制本发明。下面实施例的实验方法和试剂等，若无特殊说明，均为常规方法和试剂。

以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下面对本发明的内容进行详细的说明。

实施例1：hgnhx基因启动子序列克隆

首先，参照ctab法提取盐生草基因组dna，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测质量，用上游引物f1(5’-ttaagtatatgaggaagatcagctc-3’)、下游引物r(5’-tgtatactcacacccaaaagctcc-3’)来扩增hgnhx1基因上游第一片段启动子△1(615bp)；

用上游引物f2(5’-tcagcaaaagtttcattggcat-3’)、下游引物r(5’-tgtatactcacacccaaaagctcc-3’)来扩增hgnhx1基因上游长度第二片段启动子△2(938bp)；

用上游引物f3(5’-tttttgtctctcctttcttctag-3’)、下游引物r(5’-tgtatactcacacccaaaagctcc-3’)来扩增hgnhx1基因上游第三片段启动子△3(1178bp)；

用上游引物f4(5’-tattcactgattccccgcaca-3’)、下游引物r(5’-tgtatactcacacccaaaagctcc-3’)来扩增hgnhx1基因上游全长△4(1527bp)的启动子片段，上述引物全部由上海生工生物工程有限公司合成。

pcr扩增体系均为10×extaqbuffer(mg²⁺plus)2.5μl，dntpmixture(各2.5mm)2μl，上游引物(10μm)1μl，下游引物(10μm)1μl，dna1μl，extaq酶(5u/μl)0.2μl，ddh2o17.3μl，总体积25μl。其中

△1反应程序为94℃预变性4min；94℃30s，62℃30s，72℃30-45s，35个循环；72℃延伸7-8min；

△2反应程序为94℃预变性4min；94℃30s，62℃30s，72℃45s-1min，35个循环；72℃延伸7-8min；

△3反应程序：94℃预变性4min；94℃30s，56℃30s，72℃1min-1min15s，35个循环；72℃延伸7-8min；

△4反应程序：94℃预变性4min；94℃30s，64℃30s，72℃1min30s-1min45s，35个循环；72℃延伸7-8min。

上述所得4个pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，并用takaraminibestdna胶回收试剂盒(大连宝生物工程有限公司)，参照该试剂盒说明书操作步骤对pcr产物进行回收，接着将回收产物与pmd19-t(大连宝生物工程有限公司)载体连接，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，筛选蓝白斑，并进行菌落pcr鉴定，电泳检测包含有目标条带的菌液送上海生工生物工程公司进行测序，测序结果分别为seqno1.，seqno2.，seqno3.和seqno4.。

序列为seqno1；

序列为seqno2；

序列为seqno3：

序列seqno4：

实施例2：hgnhx基因启动子序列表达载体构建

根据表达载体构建的需要，在实施例1中hgnhx基因上游不同长度片段启动子的上下游引物上添加酶切位点scai和bamhi，设计seqno1.，seqno2.，seqno3.和seqno4.上游引物：

f1为5’-aaaagtactttaagtatatgaggaagatcagctc-3’、

f2为5’-aaaagtacttcagcaaaagtttcattggcat-3’、

f3为5’-aaaagtacttttttgtctctcctttcttctag-3’、

f4为5’-aaaagtacttattcactgattccccgcaca-3’，及共同下游引物为r为5’-cgcggatcctgtatactcacacccaaaagctcc-3’(均由上海生工生物工程有限公司合成)。pcr扩增体系为10×extaqbuffer(mg²⁺plus)2.5μl，dntpmixture(各2.5mm)2μl，上游引物(10μm)1μl，下游引物(10μm)1μl，dna1μl，extaq酶(5u/μl)0.2μl，ddh2o17.3μl，总体积25μl。其中：

△1反应程序为94℃预变性4min；94℃30s，64℃30s，72℃30s-45s，35个循环；72℃延伸7-8min；

△2反应程序为94℃预变性4min；94℃30s，64℃30s，72℃45s-1min，35个循环；72℃延伸7-8min；

△3反应程序：94℃预变性4min；94℃30s，62℃30s，72℃1min-1min15s，35个循环；72℃延伸7-8min；

△4反应程序：94℃预变性4min；94℃30s，66℃30s，72℃1min30s-1min45s，35个循环；72℃延伸7-8min。

上述所得4个pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，并用takaraminibestdna胶回收试剂盒(大连宝生物工程有限公司)，参照该试剂盒说明书操作步骤对pcr产物进行回收，接着将回收产物与pmd19-t(大连宝生物工程有限公司)载体连接，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，筛选蓝白斑，并进行菌落pcr鉴定并测序，pcr产物大小分别615bp、938bp、1178bp、1527bp，符合预期片段大小。然后按照takaraminibestplasmidpurificationkitver.4.0试剂盒(大连宝生物工程有限公司)提取质粒dna，然后将提取的hgnhx启动子质粒分别用限制性内切酶scai和bamhi在37℃条件下双酶切4-6h，电泳检测后回收目的片段，酶切体系如下：质粒dna6μl，scai1.2μl，bamhi1.2μl，10×hbuffer2μl，ddh2o加至总体积20μl，同样提取pbi121质粒dna，同时也用scai和bamhi在37℃水浴处理下双酶切4-6h并回收酶切大片段，酶切体系为质粒dna6μl，scai1μl，bamhi1μl，10×hbuffer2μl，ddh2o加至总体积20μl，双酶切完成后，将hgnhx启动子质粒酶切回收的目的片段与pbi121酶切大片段利用t4dnaligase连接，反应体系为10×t4dnaligasebuffer1μl，目的基因片段7μl，载体dna1μl，t4dnaligase1μl，总体积为10μl，16℃连接12-16h。得到重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，筛选蓝白斑并测序，确认得到含有带有目的基因重组质粒；同时对重组质粒在37℃酶切4-6h，其双酶切体系为质粒dna6μl，scai1μl，bamhi1μl，10×hbuffer2μl，ddh2o至20μl，并对双酶切产物进行电泳检测，见图2。

实施例3：农杆菌拟南芥转化与培养

首先制备lba4404农杆菌并活化，将重组质粒转入感受态农杆菌中，获得农杆菌浸染液，运用蘸花法侵染拟南芥花序，待拟南芥成熟后分单株收获转基因种子。收获的拟南芥种子低温处理、灭菌后撒播在含抗生素kan(50ug/ml)的1/2ms固体培养基中筛选抗性苗，并移栽培养，提取植株dna，并用hgnhx基因启动子序列克隆中的引物分别对△1、△2、△3、△4启动子片段进行pcr检测，获得转基因阳性苗(图3)。

实施例4：转hgnhx基因上游启动子不同片段基因拟南芥gus组织染色

将抗性筛选和pcr检测过的阳性转基因拟南芥植株不同生长时期幼苗及花序转入gus染液中，并以野生型拟南芥为对照，37℃暖育12-24h后，用70％的乙醇中充分脱去叶绿素后观察gus染色效果。结果表明转基因拟南芥幼苗根、茎和叶与四叶期根、茎、叶及花序均可染上蓝色，而wt均染不上色(图4、图5)，即该启动子可驱动gus基因在不同生长阶段和不同器官中表达，表明hgnhx基因缺失不同长度片段启动子具有一定的组成型启动子活性。

实施例5：所述盐生草hgnhx基因启动子序列的应用，盐生草hgnhx基因启动子序列生物信息学分析中：通过软件place、plantcare对所得到的序列进行功能元件预测和分析，发现该启动子中除具有核心启动子元件tata-box、caat-box、gata-box等外，还含有多个与抗冻、抗寒、抗旱、光响应、脱水等逆境胁迫诱导有关的作用元件；同时具有多个植物激素诱导响应的功能元件，如：乙烯、脱落酸、赤霉素等。功能元件在序列中的具体位置及元件功能分析如表1所示。

表1hgnhx1基因启动子所含元件的具体功能汇总

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>甘肃农业大学

<120>盐生草hgnhx基因启动子序列及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>615

<212>dna

<213>盐生草液泡膜na⁺/h⁺反转运体hgnhx基因缺失的第一片段启动子

<400>1

ttaagtatatgaggaagatcagctcatattattattcatgcatctgggttttggatatac60

aactatataagcattacagcattaaataaaattcatgatatgatatacaactatatcata120

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<210>2

<211>938

<212>dna

<213>盐生草液泡膜na⁺/h⁺反转运体hgnhx基因缺失的第二片段启动子

<400>2

attaactggttgatcagcaaaagtttcattggcatcttcattgtttacacttgtgcatgc60

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tatttgattgggccggagcttttgggtgtgagtataca938

<210>3

<211>1178

<212>dna

<213>生草液泡膜na⁺/h⁺反转运体hgnhx基因缺失的第三片段启动子

<400>3

tttttgtctctcctttcttctagatatttctcaacatcatcatagaatatttcacctttt60

tatctcacctcaaattacgtaatttattccctttttttcattttttgctcacaacccatt120

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<210>4

<211>1527

<212>dna

<213>盐生草液泡膜na⁺/h⁺反转运体hgnhx基因全长启动子

<400>4

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