褐飞虱激素受体基因NLHR3调控吡虫啉和毒死蜱协同增效的基因片段及其应用的制作方法

本发明涉及一种褐飞虱激素受体基因nlhr3调控吡虫啉和毒死蜱协同增效的基因片段及其应用，属于生物技术领域。

背景技术：

据发明人所知，褐飞虱nilaparvatalugens(stål)属于半翅目，飞虱科，主要分布于亚洲稻区，褐飞虱具有远距离迁飞的习性。褐飞虱是一种仅危害水稻的单食性昆虫。褐飞虱利用本身的刺吸式口器吮吸寄主植物汁液，造成水稻“冒穿”，另外可以传播植物病毒病，如草状丛矮病和齿叶矮缩病等。20世纪80年代以来，褐飞虱在我国的年发生面积为1330-2000万hm²，约占水稻种植面积的50%，年损失稻谷达10-15亿kg。2005年，褐飞虱在我国南方稻区爆发，引起水稻大面积干枯倒伏，造成严重损失。据浙江省农业厅调查统计，2005年浙江省第5代褐飞虱发生量每667m²达30万头以上的有66.7万hm²，占水稻总种植面积的86%；每667m²在100万头以上的有33.3万hm²，占42%；最高田块的发生量达到每667m²1000万头以上；绝收的面积达5333hm²，造成直接水稻产量损失120万吨。2006年台风和降水偏多等气候有利于褐飞虱的迁移和繁殖危害，大部分稻区发生重于2005年同期。近几年，褐飞虱的防治虽然得到重视，但褐飞虱的大发生危害形势依旧严峻。因此，如何通过减少褐飞虱的暴发来增加水稻产量，是目前人类需迫切解决的问题。

目前主要以化学农药来防治褐飞虱，已造成褐飞虱对常用各类杀虫剂产生了不同水平的抗性，而导致其频繁暴发。20世纪70年代有机氯杀虫剂由于环境污染、高毒性和高抗性被禁止用于防治稻飞虱。80至90年代部分有机磷杀虫剂和氨基甲酸酯类杀虫剂被应用于稻田，但效果一般、环境相容性差、选择性差。与此同时，作用机制新颖的噻嗪酮、氟虫腈和吡虫啉被相继引入稻田使用，却造成褐飞虱对噻嗪酮和吡虫啉产生高水平的抗性，氟虫腈因对水生生物高毒性于2009年被禁用。抗性监测表明，褐飞虱对现阶段使用的噻虫嗪、烯啶虫胺、毒死蜱、吡蚜酮和醚菊酯类杀虫剂产生了从低到高水平的抗性。鉴于褐飞虱抗药性发生的日益严重，需要开发出施药技术和策略，实现褐飞虱的可持续防治，杀虫剂混用是解决褐飞虱抗药性增强和稻田常用杀虫剂药效下降的有效途径。

具有增效作用的杀虫剂混用才是合理的配伍，它可以在有效期内控制有害生物的增长和扩散，延缓有害生物抗性发展、减少施药量及次数和降低成本。混用增效的测定采用活体生物测定技术，目前褐飞虱生测常采用稻苗浸渍法、稻茎浸渍法和点滴法，反映药剂对褐飞虱的毒力，但这种活体生物测定技术的灵敏度较低，影响生测的结果因素较多，导致增效作用的判断产生误差，随着对褐飞虱分子毒理学的深入研究，为建立科学和简便易行的分子检测技术提供前提条件，为杀虫剂混用增效提供精准的评价标准。杀虫剂混用增效检测技术应是基于对褐飞虱抗药性分子机制的研究建立起来。

rna干扰（rnainterference,rnai）是广泛存在于动物、植物和微生物中的普遍现象，可以作为防御机制来抵抗体内非正常的核酸。rna干扰主要是由后转录调控和双链rna（dsrna）引起的，压制靶标基因的表达。最近几年，rnai技术已成为研究基因功能和害虫治理的一种有利用价值的工具。在实际的应用中，通过导入需要沉默的基因的双链rna（dsrna）来特异性降解细胞内mrna，压制靶基因的表达，产生功能表型缺失。目前rnai可以沉默抗性相关基因，提高昆虫对杀虫剂的敏感性。因此，rnai为昆虫治理提供了理论依据和技术指导，通过转基因技术可以从实验室向田间实现对害虫的控制，有望从根本上解决这一问题。

之前，发明人通过研究灰飞虱抗药性分子机制，找出灰飞虱的抗药性基因，并在此基础上通过实施喂食rnai技术手段来降低灰飞虱抗药性。发明人已将研究成果提交了三件专利申请：申请号cn201610432190.3，名称《灰飞虱抗药性基因cyp6ay3v2、降低灰飞虱抗药性的基因片段及其应用》的中国发明专利申请；申请号cn201610567595.8，名称《灰飞虱抗药性羧酸酯酶基因lsce12、降低灰飞虱抗药性的基因片段及其应用》的中国发明专利申请；以及，申请号cn201710290800.5，名称《灰飞虱抗药性雌激素相关受体基因lserr、降低灰飞虱抗药性的基因片段及其应用》的中国发明专利申请。

如上述专利申请中所言，现有技术利用rnai技术抗虫的思路主要有两种：第一种是找到害虫的致死基因，然后据此设计合成dsrna，并通过喂食直接导致害虫死亡、或直接导致害虫不能正常发育和繁殖；第二种是找到害虫的致死基因，然后据此设计转基因农作物，使农作物具备能直接导致害虫死亡的能力。然而，在当前的实际情况下，社会公众对转基因技术普遍带有很深的误解，转基因农作物很难被直接接受；同时，能通过喂食直接导致害虫死亡、或直接导致害虫不能正常发育和繁殖的dsrna，容易被社会公众误认为该dsrna本身带有致死毒性、或发育/繁殖毒性，使这种dsrna也不容易被接受。

与之相比，发明人利用rnai技术，通过喂食dsrna降低害虫抗药性，使害虫更容易被杀虫剂杀灭，可有效避免社会公众产生类似的误解，这无疑会使后续的推广工作更加顺利。

目前，发明人已将研究目标转向褐飞虱，以期找到褐飞虱中与抗药性相关的调控基因，并以此来指导褐飞虱抗药性的治理。

技术实现要素：

本发明基于发明人的最新研究成果，提供一种褐飞虱激素受体基因nlhr3，利用该基因可获得调控吡虫啉和毒死蜱协同增效的基因片段（即dsrna），通过喂食rnai实施调控。同时，本发明还提供上述基因片段及其应用。

本发明解决其技术问题的技术方案如下：

褐飞虱激素受体基因nlhr3，其特征是，该基因的序列如seqidno.1所示。

该基因的核苷酸序列长度为1761bp，其中，开放阅读框为从5′端第162位到第1721位碱基，编码区长度为1560bq；5′端utr区从第1位到第161位碱基，3′端utr区从1722位到1761位碱基。该基因的等电点是6.91，分子重量是57.89kda。

本发明还提供：

由前文所述褐飞虱激素受体基因nlhr3编码的多肽，其特征是，该多肽的序列如seqidno.2所示。

该多肽由520个氨基酸残基组成，其中，极性氨基酸312个，强酸氨基酸（asp和glu）57个，强碱氨基酸（arg和lys）56个，疏水性氨基酸208个。该多肽的第77-175位氨基酸和第191-411位氨基酸之间分别有一个nr_lbd_err和nr_dbd_err结构域。采用apssp2法预测该多肽的蛋白二级结构可知，α螺旋占58.65%，β折叠占3.08%，无规则卷曲占38.27%。

本发明还提供：

调控吡虫啉和毒死蜱协同增效的基因片段，其特征是，该基因片段的序列如seqidno.3所示。

本发明还提供：

前文所述调控吡虫啉和毒死蜱协同增效的基因片段的合成方法，其特征是，包括以下步骤：

第一步、从褐飞虱材料中提取总rna；所述褐飞虱材料至少包括褐飞虱卵、褐飞虱若虫、褐飞虱成虫之一；

第二步、先以褐飞虱总rna为模板，反转录合成cdna第一链；再以pcr合成褐飞虱cdna模板；

第三步、采用引物dsnlhr3-f和引物dsnlhr3-r、以及褐飞虱cdna模板进行pcr扩增，获得dsrna模板并进行纯化；其中，所述引物dsnlhr3-f的序列为5′端加有t7启动子序列的seqidno.5所示序列，所述引物dsnlhr3-r的序列为5′端加有t7启动子序列的seqidno.6所示序列，所述t7启动子序列如seqidno.7所示；

第四步、采用纯化后的dsrna模板，体外合成dsrna并保存备用；所得dsrna即为目标基因片段。

该合成方法进一步完善的技术方案如下：

优选地，第一步的具体过程为：

采用总rna提取试剂盒从褐飞虱材料中提取褐飞虱总rna；以琼脂糖凝胶电泳纯化褐飞虱总rna；以核酸蛋白定量仪检测褐飞虱总rna的浓度以及吸光度值；将褐飞虱总rna冻存；

第二步的具体过程为：

以褐飞虱总rna为模板，采用反转录试剂盒合成cdna第一链；然后，采用cdna第一链，于pcr仪中合成褐飞虱cdna模板，具体合成条件为：37℃15min，85℃5s，12℃保持；所得褐飞虱cdna模板冻存；

第三步的具体过程为：

采用引物dsnlhr3-f和引物dsnlhr3-r、以及褐飞虱cdna模板进行pcr扩增，并获得dsrna模板，扩增时的pcr反应条件为：94℃3min，94℃30s，68℃30s以及72℃1min10个循环，94℃30s以及72℃1min28个循环，72℃10min，12℃保持；电泳纯化所得dsrna模板，并以回收试剂盒进行纯化后保存；

第四步的具体过程为：

采用纯化后的dsrna模板，以试剂盒体外合成dsrna，并以2～5倍反应体系的无核酸酶水溶解所得dsrna，然后冻存备用；

第一步中，冻存褐飞虱总rna的温度为-80℃以下；第二步中，冻存褐飞虱cdna模板的温度为-20℃±5℃；第三步中，纯化后保存dsrna模板的温度为0℃-4℃或-20℃±5℃；第四步中，冻存dsrna的温度为-80℃以下。

本发明还提供：

前文所述合成方法中所用引物，其特征是，包括引物dsnlhr3-f和引物dsnlhr3-r，所述引物dsnlhr3-f的序列为5′端加有t7启动子序列的seqidno.5所示序列，所述引物dsnlhr3-r的序列为5′端加有t7启动子序列的seqidno.6所示序列，所述t7启动子序列如seqidno.7所示。

本发明还提供：

前文所述褐飞虱激素受体基因nlhr3的用途，其特征是，该用途为用于合成前文所述调控吡虫啉和毒死蜱协同增效的基因片段，或者用于褐飞虱的抗药性分子检测，或者用于吡虫啉-毒死蜱复配组合物针对褐飞虱协同增效效果检测。

本发明还提供：

前文所述调控吡虫啉和毒死蜱协同增效的基因片段的用途，其特征是，该用途为用于调控吡虫啉-毒死蜱复配组合物针对褐飞虱的协同增效效果。

前文所述调控吡虫啉和毒死蜱协同增效的基因片段的用途，其特征是，该用途为降低褐飞虱针对吡虫啉或毒死蜱的抗药性。

本发明还提供：

含有前文所述调控吡虫啉和毒死蜱协同增效的基因片段的药物组合物。

发明人经反复地深入实践研究发现，褐飞虱激素受体基因nlhr3是导致吡虫啉-毒死蜱复配组合物对褐飞虱产生协同增效效果的关键基因，一方面，通过检测基因nlhr3和/或其编码的多肽，可以预先判断吡虫啉-毒死蜱复配组合物对褐飞虱的协同增效效果，另一方面，通过以基因nlhr3为模板最终体外合成dsrna，并进行喂食rnai，可有效降低褐飞虱针对吡虫啉或毒死蜱的抗药性，实现对褐飞虱的抗药性治理。

附图说明

图1是实施例1褐飞虱nlhr3基因cds全长电泳图，图中，1泳道为褐飞虱pcr电泳结果；m为trans2kplusmarker。

图2是实施例2吡虫啉-毒死蜱复配组合物、吡虫啉、毒死蜱分别处理的褐飞虱中nlhr3基因荧光定量分析。

图3是实施例3褐飞虱的含有t7启动子的抗药性基因nlhr3序列。

图4是实施例3褐飞虱的含有t7启动子的绿色荧光蛋白基因gfp序列。

图5是实施例3褐飞虱激素受体nlhr3体外合成的dsrna（即图中的dsnlhr3，下同）、以及绿色荧光蛋白基因gfp体外合成的dsgfp的电泳图。

图6是实施例4喂食褐飞虱dsrna后其基因表达量变化图。

图7是实施例4褐飞虱激素受体基因nlhr3沉默后褐飞虱抗药性的毒理分析图。

以上各图中出现的“增效吡虫啉和毒死婢混剂”即指吡虫啉-毒死蜱复配组合物。

具体实施方式

一、本发明的主要研究过程：

1、确定抗药性基因

利用褐飞虱基因组测序得到的激素受体46基因数据，通过www.insect-genome.com网站数据库同源性比对，得到激素受体46基因的注释信息。利用rt-pcr技术对激素受体46基因进行分子克隆和鉴定，褐飞虱激素受体46基因转录本与ncbi的蛋白数据库比对具有相似性，并且命名为nlhr3。褐飞虱与温带臭虫cimexlectularius、赤拟谷盗triboliumcastaneum、德国小蠊blattellagermanica、意大利蜜蜂apismellifera和欧洲熊蜂bombusterrestris的hr3氨基酸序列一致性分别为80%、79%、74%、74%和75%。

本发明以吡虫啉-毒死蜱复配组合物、吡虫啉、毒死蜱分别处理的褐飞虱为研究材料，分别提取三者的总rna，利用反转录聚合酶链式反应技术（rt-pcr）克隆得到激素受体基因nlhr3的序列，利用荧光定量pcr技术确定激素受体基因nlhr3在三个处理中的表达情况，设β-actin作为内参基因进行实时定量pcr分析，重复3次试验，反应完成后进行溶解曲线检验，并按照2^-△△ct法计算基因的相对表达量，在荧光定量pcr扩增中，所用引物的核苷酸序列为：

引物nlhr3-f:5′-tcaggcacaggcacaatcc-3′

引物nlhr3-r:5′-acaccactactcttatctccacac-3′

荧光定量pcr的方法结果显示，nlhr3的表达水平在吡虫啉-毒死蜱复配组合物处理的褐飞虱是吡虫啉处理和毒死蜱处理的3.09倍和4.25倍。

通过褐飞虱激素受体基因nlhr3鉴定克隆和基因表达分析可知，过表达的nlhr3基因调控吡虫啉-毒死蜱复配组合物对褐飞虱产生的协同增效效果，使得nlhr3及其编码的多肽在褐飞虱的抗药性分子检测、以及吡虫啉-毒死蜱复配组合物协同增效效果检测方面具有重要的应用价值。

2、研究相关的rnai技术手段

本发明根据褐飞虱激素受体基因nlhr3和绿色荧光蛋白基因gfp分别设计dsrna引物和dsgfp引物（注：本试验所用褐飞虱的体内存在绿色荧光蛋白基因gfp）。之后，提取褐飞虱总rna，反转录，以褐飞虱cdna为模板，用加过t7序列的引物，进行pcr扩增，合成dsrna模板和dsgfp模板。在pcr扩增中，用于合成dsrna模板的引物为引物dsnlhr3-f和引物dsnlhr3-r，用于合成dsgfp模板的引物为引物dsgfp-f和引物dsgfp-r；

其中，引物dsnlhr3-f的核苷酸序列为：

dsnlhr3-f：5′-gtagtggtgttcactatgggg-3′，即seqidno.5，在其5′端加t7启动子序列；

引物dsnlhr3-r的核苷酸序列为：

dsnlhr3-r：5′-tggtcagaagaggtgggtt-3′，即seqidno.6，在其5′端加t7启动子序列；

引物dsgfp-f的核苷酸序列为：

dsgfp-f：5′-aagttcagcgtgtccg-3′，即seqidno.8，在其5′端加t7启动子序列；

引物dsgfp-r的核苷酸序列为：

dsgfp-r：5′-gaacggcatcaaggtg-3′，即seqidno.9，在其5′端加t7启动子序列；

t7启动子序列：5′-taatacgactcactataggg-3′，即seqidno.7。

利用wizardsvgelandpcrclean-upsystem（普洛麦格（北京）生物技术有限公司）回收试剂盒对dsrna模板和dsgfp模板进行纯化。使用t7ribomax™expressrnaisystem（普洛麦格（北京）生物技术有限公司）试剂盒利用纯化产物合成dsrna和dsgfp。

人工液体饲料混合dsrna和dsgfp连续喂食褐飞虱5龄若虫至成虫，其中，处理组喂食含dsrna的饲料，其各基因dsrna的浓度均为0.25µg/µl；对照组喂食不含dsrna的饲料。每组喂食3管，进行3次独立重复实验。

采用点滴法对干扰后褐飞虱成虫进行毒力测定，同时取处理组的褐飞虱成虫，提取总rna，反转录获得cdna第一条链，用实时定量pcr检测nlhr3表达量的变化。

本发明研究中，用褐飞虱激素受体基因nlhr3的dsrna和dsgfp喂食褐飞虱的五龄若虫直至成虫，以喂食无dsrna的营养液为ck，对喂食干扰后的褐飞虱成虫进行毒理分析。在研究过程中，由于绿色荧光蛋白基因gfp在褐飞虱体内稳定表达，可以作为rna干扰脱靶效应的报告基因。

本发明发现沉默褐飞虱激素受体基因nlhr3后，能明显降低褐飞虱对吡虫啉-毒死蜱复配组合物的死亡率，并能显著提高褐飞虱对吡虫啉的死亡率、以及对毒死蜱的死亡率，因此nlhr3是调控吡虫啉-毒死蜱复配组合物协同增效的关键基因，也是褐飞虱对吡虫啉或毒死蜱产生抗药性的关键基因。通过合成nlhr3的dsrna进行喂食rnai可以降低靶基因的表达量，增加褐飞虱对吡虫啉或毒死蜱的敏感性，因此nlhr3基因双链rna的合成在褐飞虱抗性治理方面具有重要的应用价值。

3、研究成果总结

本发明通过对褐飞虱基因组的分析，利用rt-pcr技术克隆鉴定nlhr3基因，获得褐飞虱nlhr3基因序列。通过荧光定量pcr技术对吡虫啉-毒死蜱复配组合物、吡虫啉、毒死蜱处理的褐飞虱进行对比分析，发现nlhr3基因表达上调，利用race技术获得nlhr3全长基因，然后以nlhr3基因片段为模板合成相应dsrna，并利用喂食目的片段dsrna的方法分析nlhr3基因在rnai沉默后褐飞虱中nlhr3mrna的表达水平，并对褐飞虱成虫进行毒力测定。以上研究结果表明，nlhr3基因的分离克隆，对于吡虫啉-毒死蜱复配组合物的协同增效效果检测、褐飞虱抗药性分子检测和褐飞虱的抗性治理具有重要作用。

本发明利用rnai技术，通过喂食dsrna降低褐飞虱对吡虫啉或毒死蜱的抗药性，使褐飞虱更容易被杀虫剂杀灭，可有效避免社会公众误认为该dsrna本身带有致死毒性或发育/繁殖毒性，这无疑会使后续的推广工作更加顺利。

二、本发明的具体实施例：

下面通过实施例对本发明做进一步说明，但是本发明不仅限于这些例子。

本发明所用的褐飞虱室内品系2013年采自江苏南京市江苏省农业科学院试验田，在未接触任何杀虫剂情况下室内连续饲养获得。

本发明所涉及的试剂均为市购。

下述实施例的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1.nlhr3基因的克隆和序列分析

利用褐飞虱基因组数据库结合www.insect-genome.com网站数据，在此基础上获得nlhr3基因片段。

（1）褐飞虱总rna提取。

以褐飞虱室内品系为研究材料，选取褐飞虱卵、1-5龄若虫和雌雄成虫使用trizol总rna提取试剂盒（上海英骏生物技术有限公司）对其进行混合提取，操作方法参照试剂盒说明书。提取的褐飞虱总rna使用浓度为1.0%的琼脂糖凝胶电泳，用nanodrop1000核酸蛋白定量仪对rna的浓度以及吸光度值进行检测，确认rna的质量和完整性，然后放入超低温冰箱中在-80℃条件下冻存。

（2）cdna模板的制备。

以褐飞虱总rna为模板，使用反转录试剂盒primescript^tmrtreagentkit（宝生物工程大连有限公司）合成cdna第一链，反应条件为：500ng总rna，2µl5×primescriptrtmastermix（perfectrealtime），补足到10µlrnasefreeddh2o。pcr仪中完成cdna合成：37℃15min，85℃5s，12℃保持。合成的cdna置于-20℃保存备用。

（3）引物的设计。

本发明以褐飞虱基因组中nlhr3基因片段序列，利用primerpremier5.0软件设计引物，设计的引物为

nlhr3-f：5′-atgacccacgcccatctatc-3′；

nlhr3-r：5′-tgccccagtcttccaatttc-3′。

引物nlhr3-f和nlhr3-r由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

（4）pcr扩增、回收纯化及测序。

以褐飞虱的cdna为模板进行pcr扩增。pcr反应体系总体积为25µl：2.5µl10×pcrbuffer，2.5µlmgcl2，2µldntps，1µlcdna，1µlnlhr3-f（10μmol/l），1µlnlhr3-r（10μmol/l），0.25µltaqdnapolymerase，14.75µlddh2o。pcr反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。将pcr扩增后的产物经1.5％琼脂糖电泳回收，利用axyprepdnagelextractionkit（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）纯化目的dna片段，然后将纯化好的dna片段利用peasy-t3clothingkit（北京全式金生物技术有限公司）连接转化，挑斑后摇菌，将菌液送南京金斯瑞公司进行序列测定。

（5）测序结果分析。

用基因探索者软件分析所测得的序列，并通过ncbi的blast程序进行同源性比对分析，用genedoc进行比较分析。

（6）nlhr3全长基因克隆。

以褐飞虱总rna为模板，使用clontech^tmsmarter反转录试剂盒（宝生物工程大连有限公司），按照操作步骤进行5′（3′）-racecdna第一链的合成，在pcr仪完成rna变性反应，条件为72℃3min，42℃2min。pcr仪中完成cdna合成：42℃90min，70℃10min，用tricine-edtabuffer稀释后总体积约100µl。

（7）全长引物设计。

nlhr3基因的5′和3′端引物使用primerpremier5.0软件设计，设计的5′端和5′端巢式引物分别为

5nlhr3gsp：5'-ggcggcagtattggcacctattcct-3'；

5nlhr3ngsp：5'-cagttcttgttgcggggacactggt-3'。

设计的3′端和3′端引物巢式引物分别为

3nlhr3gsp：5'-cgctgtcaagtttggcaggatgtcg-3'；

3nlhr3ngsp：5'-cggcactcaggtgactccgacaatg-3'。

nlhr3基因cds扩增引物分别为：

nlhr3-cds-f：5'-gaatggactaagagaggtgcg-3'；

nlhr3-cds-r：5'-tagtaccacgacacgttgct-3'。

（8）pcr扩增。

nlhr3基因全长克隆以褐飞虱的5′（3′）cdna为模板进行pcr扩增。pcr反应体系总体积为25µl：2.5µl10×labuffer，2.5µlmgcl2，4µldntps，1µlcdna，2.5µlupm，1µlgsp（10μmol/l），0.25µllataqdnapolymerase，12.25µlddh2o。扩增程序：94℃3min，94℃30s，72℃3min5个循环，94℃30s，70℃30s，72℃3min5个循环，94℃30s，68℃30s，72℃3min25个循环，72℃10min，12℃保持。所得pcr产物，经1.2%琼脂糖电泳检测。

nlhr3基因cds克隆以褐飞虱的cdna为模板进行pcr扩增。pcr反应体系总体积为25µl：2.5µl10×pcrbuffer，2.5µlmgcl2，4µldntps，1µlcdna，1µlnlhr3-cds-f（10μmol/l），1µlnlhr3-cds-r（10μmol/l），0.25µllataqdnapolymerase，12.75µlddh2o。pcr反应程序为：94℃3min；94℃30s，55℃40s，72℃2min，30个循环；72℃10min，12℃保持。

回收纯化、测序及测序结果分析同本实施例中（4）和（5）的相关步骤。

褐飞虱nlhr3基因cds全长电泳图如图1所示。1泳道为褐飞虱pcr电泳结果；m为trans2kplusmarker。

实施例2.吡虫啉-毒死蜱复配组合物、吡虫啉和毒死蜱分别处理的褐飞虱的nlhr3基因荧光定量分析

选取吡虫啉-毒死蜱复配组合物、吡虫啉、毒死蜱分别处理的褐飞虱为材料，其中，吡虫啉-毒死蜱复配组合物由吡虫啉和毒死蜱按体积比1:10复配而成，下文出现的吡虫啉-毒死蜱复配组合物，若无特别说明，均与此相同。利用荧光定量pcr分析这些材料中nlhr3基因的表达水平，以此来获知nlhr3基因表达水平与吡虫啉-毒死蜱复配组合物的关系。

（1）褐飞虱总rna提取。

以吡虫啉-毒死蜱复配组合物、吡虫啉、毒死蜱分别处理的褐飞虱为材料（具体处理方法与实施例4的（1）相同），分别使用svtotalrna提取试剂盒（普洛麦格（北京）生物技术有限公司）依照操作步骤提取总rna，提取的褐飞虱总rna使用浓度为1.0%的琼脂糖凝胶电泳，用nanodrop100核酸蛋白定量仪对rna的浓度以及吸光度值进行检测，确认rna的质量和完整性，然后放入超低温冰箱中在-80℃条件下冻存。

（2）cdna模板的制备。

以褐飞虱总rna为模板，使用反转录试剂盒primescript^tmrtreagentkit（宝生物工程大连有限公司）合成cdna第一链，反应条件为：500ng总rna，2µl5×primescriptrtmastermix（perfectrealtime），补足到10µlrnasefreeddh2o。pcr仪中完成cdna合成：37℃15min，85℃5s，12℃保持。合成的cdna置于-20℃保存备用。

（3）荧光定量pcr。

利用吡虫啉-毒死蜱复配组合物、吡虫啉、毒死蜱分别处理的褐飞虱cdna为模板分别进行荧光定量pcr扩增。nlhr3基因和内参β-actin的引物使用beacondesigner7软件设计，nlhr3基因引物为前文所述的引物nlhr3-f和引物nlhr3-r，内参β-actin的引物序列是：

5′-tcttcccatccatcgtcg-3′

和5′-atgaggtagtcggtcaagtcac-3′。

实时荧光定量pcr试验操作在abi7300实时定量pcr仪上进行，其反应体系及程序参照sybr®premixextaqtm说明书进行。

（2）本实验采用2^-△△ct方法比较nlhr3基因在吡虫啉-毒死蜱复配组合物、吡虫啉、毒死蜱分别处理的褐飞虱中的表达量差异，计算公式为：

δδct=（ct目标基因-ct持家基因）实验组-（ct目标基因-ct持家基因）对照组。

每个品系设置3个生物学重复，每个生物学重复3次。数据使用spss13.0软件完成（spssinc.,chicago,il,usa）。数据以mean±se表示，mrna相对表达量的比较采用单因素方差分析（one-wayanova）和邓肯氏新复极差法测验比较目标基因在各品系中的表达量的差异。

吡虫啉-毒死蜱复配组合物、吡虫啉、毒死蜱分别处理的褐飞虱nlhr3基因荧光定量分析结果如图2所示。结果显示，nlhr3基因的表达水平在吡虫啉-毒死蜱复配组合物处理的褐飞虱中是吡虫啉处理、毒死蜱处理的3.09和4.25倍。

实施例3.体外合成褐飞虱激素受体基因nlhr3的dsrna和绿色荧光蛋白基因gfp的dsgfp

（1）以褐飞虱为研究材料，褐飞虱总rna提取和cdna模板的制备依据实施例1进行操作。

（2）引物设计。

引物使用primerpremier5.0软件设计，激素受体基因nlhr3的dsrna和绿色荧光蛋白gfp的dsgfp的引物的核苷酸序列为：

dsnlhr3-f：5′-gtagtggtgttcactatgggg-3′；

dsnlhr3-r：5′-tggtcagaagaggtgggtt-3′；

dsgfp-f：5′-aagttcagcgtgtccg-3′；

dsgfp-r：5′-gaacggcatcaaggtg-3′。

以上上下游引物序列均在5′端加t7启动子序列，t7启动子序列：5′-taatacgactcactataggg-3′。

（3）合成dsrna模板和dsgfp模板。

以褐飞虱cdna为模板，用加过t7序列的引物，进行pcr扩增。

pcr反应体系总体积为50µl：5µl10×pcrbuffer，4µlmgcl2，4µldntps，2µlcdna，1µlprimerf（10μmol/l），1µlprimerr（10μmol/l），0.25µltaqdnapolymerase，32.75µlddh2o。

为达到dsrna合成需要，上述pcr体系需增加10～20倍。

pcr反应条件:94℃3min，94℃30s，68℃30s，72℃1min10个循环，94℃30s，72℃1min28个循环，72℃10min，12℃保持。

（4）dsrna模板和dsgfp模板的回收纯化。

选择wizardsvgelandpcrclean-upsystem（普洛麦格（北京）生物技术有限公司）回收试剂盒对pcr电泳产物进行纯化，操作步骤依据说明书进行。回收产物-20℃保存备用。

（5）dsrna和dsgfp的体外合成。

使用t7ribomax™expressrnaisystem试剂盒（普洛麦格（北京）生物技术有限公司）合成dsrna和dsgfp，操作方法依据说明书进行。最后加入2～5倍反应体系的无核酸酶水溶解产物，-80℃超低温冰箱中保存备用。

褐飞虱的含有t7启动子的激素受体基因nlhr3序列如图3所示；含有t7启动子的绿色荧光蛋白基因gfp序列如图4所示。激素受体基因nlhr3体外合成的dsrna、以及绿色荧光蛋白基因gfp体外合成的dsgfp的电泳图如图5所示。

实施例4.褐飞虱激素受体基因nlhr3的rnai效应检测

参照褐飞虱液体饲料配方及饲养方法（fu等，2001），稍加改进后进行饲喂。具体步骤如下：

s1.取两端开口的玻璃管（12×3cm），一端用细纱布封好，用吸虫器吸取2龄初若虫小心转入玻璃管，每管20头左右，用细纱布封口；

s2.在超净台中，轻轻拍打玻璃管使虫子集中到玻璃管一端，然后取下另一端的纱布，将准备好的封口膜拉成正方形，贴纸面朝外盖住玻璃管口；

s3.用移液枪吸取50µl饲料及相应浓度的dsrna，滴在膜中央轻微吸打混合，再取一片新的封口膜，贴纸面朝下盖在滴有液体饲料的封口膜上，将饲料封于两层膜间；

s4.添加饲料后将玻璃管平放到养虫架上，玻璃管上盖一层黑布，只露出喂食饲料端，利用趋光性吸引褐飞虱到饲料端取食；

s5.每24h换一次新鲜饲料，并统计褐飞虱的死亡率。实验室温度为27℃±1℃、相对湿度70-80%、24小时连续光照。处理组喂食含dsrna的饲料，其各基因dsrna的浓度均为0.25µg/µl；对照组喂食不含dsrna的饲料。每组喂食3管，进行3次独立重复实验。

饲料配方与申请号cn201610432190.3，名称《灰飞虱抗药性基因cyp6ay3v2、降低灰飞虱抗药性的基因片段及其应用》的中国发明专利申请中实施例6相同。

（1）吡虫啉和毒死蜱协同增效生物测定。

选取5龄的褐飞虱连续喂食含有dsrna的液体人工饲料至成虫，采用点滴法对干扰后褐飞虱成虫进行毒力测定。每个浓度使用30头成虫测试，重复三次。吡虫啉-毒死蜱复配组合物、吡虫啉、毒死蜱分别采用60ng/头、225ng/头和125ng/头的浓度进行毒理分析。处理后24h检查死亡率。本实验统计方法为duncantest（p<0.05），字母不同代表有显著差异。统计软件为spss13.0。

（2）实时定量pcr引物设计。

根据已知褐飞虱激素受体基因nlhr3和绿色荧光蛋白基因gfp的序列，运用beacondesigner7软件设计pcr引物，以β-actin为内参基因。

实时定量pcr上下游引物设计如下：

nlhr3-f：5′-tgccaatactgccgcctac-3′；

nlhr3-r：5′-tcccgagccgtccctaac-3′；

gfp-f：5′-ttatccgctcacaattccacac-3′；

gfp-r：5′-atacgcaaaccgcctctcc-3′；

β-actinq-f：5′-tcttcccatccatcgtcg-3′；

β-actinq-r：5′-atgaggtagtcggtcaagtcac-3′。

（3）实时定量pcr。

褐飞虱总rna提取和cdna模板的制备，依据实施例1的相关步骤进行。荧光定量pcr试验操作、反应体系、程序及数据分析依据实施例2的相关步骤进行。

喂食褐飞虱dsrna后其基因表达量变化结果如图6所示。

褐飞虱激素受体基因nlhr3沉默后吡虫啉和毒死蜱协同增效的毒理分析结果如图7所示。

结果表明，

以60ng/头的吡虫啉-毒死蜱复配组合物处理干扰后褐飞虱的室内品系结果显示，喂食dsgfp和无dsrna的营养液的褐飞虱，毒理死亡率分别为55.35%和57.44%，喂食nlhr3基因的dsrna的褐飞虱死亡率为30.02%。

以225ng/头的吡虫啉处理干扰后褐飞虱的室内品系结果显示，喂食dsgfp和无dsrna的营养液的褐飞虱，毒理死亡率分别为52.34%和53.14%，而喂食lserr基因的dsrna的褐飞虱死亡率为72.12%。

以125ng/头的毒死蜱处理干扰后褐飞虱的室内品系结果显示，喂食dsgfp和无dsrna的营养液的褐飞虱，毒理死亡率分别为43.34%和44.14%，而喂食lserr基因的dsrna的褐飞虱死亡率为63.52%。

以上结果表明，沉默吡虫啉和毒死蜱协同增效的关键基因nlhr3后，一方面降低了吡虫啉-毒死蜱复配组合物对褐飞虱的协同增效效果，另一方面可降低褐飞虱对吡虫啉或毒死蜱的抗药性。

也就是说，采用上述dsrna沉默基因nlhr3后，虽然会让吡虫啉-毒死蜱复配组合物对褐飞虱的药效降低，但是会让吡虫啉对褐飞虱的药效、以及毒死蜱褐飞虱的药效均获得显著提高。

这也表明，褐飞虱的基因nlhr3本身不仅是能提高吡虫啉-毒死蜱复配组合物协同增效效果的基因，同时也是让褐飞虱对吡虫啉产生抗药性、对毒死蜱产生抗药性的关键基因。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

序列表

<110>江苏省农业科学院

<120>褐飞虱激素受体基因nlhr3调控吡虫啉和毒死蜱协同增效的基因片段及其应用

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1761

<212>dna

<213>褐飞虱(nilaparvatalugensstål)

<400>1

ggatcatcccaaaataatcaaaaatttgattattacattttatacaaacagtttcaggtt60

attgtgtgagggctgagcggagagggacggcaaatttgaaaatttgaatggactaagaga120

ggtgcggctgaccatcaattggtgttcagcatgcctataaaatggacgcgctggaagagc180

ttttgggggagaacggtggcatgcctgggggtgcaaggtgggctgccatgagaagtgatg240

ctgtgtcaagcaccacaccacccccgctgtgccccccgccccccgggcacacctcaccca300

atcacctgcaacatcagcatcaggcacaggcacaatccaacaactccatcagagcccaaa360

tagagataatcccttgtaaggtgtgtggagataagagtagtggtgttcactatggggtga420

tcacgtgtgagggctgtaagggattcttcaggcgcagtcaatcggcggtgatcaactacc480

agtgtccccgcaacaagaactgtgtggttgatagggtcaacaggaataggtgccaatact540

gccgcctacaaaaatgtctgcgcttgggaatgtctcgcgacgctgtcaagtttggcagga600

tgtcgaagaagcagagagagaaggtggaggatgaggtacgctatcacagagcccaactga660

gggcccaaactgtccctgtccctgacagttcgggacagttagggacggctcgggaattcc720

cagaacccacctcttctgaccagcttcatcctccatacggcggcaatagtactgggtacc780

cttacggcgatatcggctacactccaggagctggttataccacttacggcactcaggtga840

ctccgacaatgccatatgacataagtgcggattatgtagacagcaccactgcctatgacc900

cacgcccatctatcgatcaacttgcaaccgatagtaacagcataatcactaatgttgtca960

ctacagatccctctcagatatgtgaacttctttgcaagaccatcgcggacgcccacgcaa1020

gaacctgcctctattctctcgagtacatacacagtatgttccgtaaaccacaagatctct1080

caaaacttttatactataaaaatatggcgcatgaagagttatggctggagtgcgctcaaa1140

agctaacgacagtcattcagcaaataattgaatttgctaagatggtacccggatttatga1200

agctttcccaagacgaccaaatagtcttgttgaaagcaggaagtttcgaactagcaatat1260

tacggatgagtagatactacgatttgagcaacaattgtgtgctctactctgacacaatgc1320

tgccacaggactgtttttacacaacggacacaaatgagatgaagctggttacattagcgt1380

ttgaagtggcgagggccgtagctgaactcaaacttacagaaacggaattggctttatatt1440

ctgcagtggttttactctctgcagatcgtcaagggctaaaaggattggcggaaattggaa1500

gactggggcaggcggtgttgagggcgttgcgcttggaactggagaaaaaccataccgtgc1560

ccataaaaggagacgtgacagtgtgcgatgccttgcttgctaagatcccaacgctcaggg1620

agctgagtgtgctacacatggaggctttggctaaattcaagagatcaacacctcatctcg1680

aattccctgctctccacaaggaactgttttcagtggacagctgagcaacgtgtcgtggta1740

ctagaagcagaccagctgagc1761

<210>2

<211>520

<212>prt

<213>褐飞虱(nilaparvatalugensstål)

<400>2

metaspalaleuglugluleuleuglygluasnglyglymetprogly

151015

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354045

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65707580

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100105110

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115120125

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145150155160

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165170175

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195200205

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210215220

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275280285

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290295300

aspleuserlysleuleutyrtyrlysasnmetalahisglugluleu

305310315320

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325330335

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340345350

glnilevalleuleulysalaglyserphegluleualaileleuarg

355360365

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370375380

thrmetleuproglnaspcysphetyrthrthraspthrasnglumet

385390395400

lysleuvalthrleualaphegluvalalaargalavalalagluleu

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465470475480

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485490495

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500505510

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515520

<210>3

<211>346

<212>dna/rna

<213>褐飞虱(nilaparvatalugensstål)

<400>3

gtagtggtgttcactatggggtgatcacgtgtgagggctgtaagggattcttcaggcgca60

gtcaatcggcggtgatcaactaccagtgtccccgcaacaagaactgtgtggttgataggg120

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gcgacgctgtcaagtttggcaggatgtcgaagaagcagagagagaaggtggaggatgagg240

tacgctatcacagagcccaactgagggcccaaactgtccctgtccctgacagttcgggac300

agttagggacggctcgggaattcccagaacccacctcttctgacca346

<210>4

<211>414

<212>dna/rna

<213>褐飞虱(nilaparvatalugensstål)

<400>4

aagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaag60

ttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccacccacgtgaccaccctgacc120

tacggcgtgcagcgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaag180

tccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaac240

tacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctg300

aagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactac360

aacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtg414

<210>5

<211>21

<212>dna/rna

<213>人工序列()

<400>5

gtagtggtgttcactatgggg21

<210>6

<211>19

<212>dna/rna

<213>人工序列()

<400>6

tggtcagaagaggtgggtt19

<210>7

<211>20

<212>dna/rna

<213>人工序列()

<400>7

taatacgactcactataggg20

<210>8

<211>16

<212>dna/rna

<213>人工序列()

<400>8

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<210>9

<211>16

<212>dna/rna

<213>人工序列()

<400>9

gaacggcatcaaggtg16