2-胺甲基-9,10-蒽醌衍生物、其制备方法及应用与流程

本发明涉及一种2-胺甲基-9，10-蒽醌衍生物、其制备方法及应用。

背景技术：

丙型肝炎由丙型肝炎病毒(hcv)感染所致，主要由血液/体液传播。据世界卫生组织估计，全球有1.7亿人感染hcv。在我国健康人群抗hcv阳性率为0.7％～3.1％，约3800万人。由于病毒生物学特点和宿主免疫功能等多方面因素，机体免疫往往难以有效清除病毒，致使约50％～80％hcv感染者发展为慢性肝炎，其中20％～30％将发展成肝硬化。肝硬化患者中每年有1％～4％发展成为肝细胞癌症。由于hcv经血液传播，具有慢性、隐匿性特点，部分hcv感染者将发展为慢性肝炎，严重者甚至会发展为肝硬化、肝衰竭或肝癌(《中国艾滋病性病》，2017(5)：461-462；《吉林医药学院学报》，2017，38(2)：123-126)。

大黄素甲醚(physcion)属蒽醌类化合物，广泛存在于蓼科、豆科、唇形科、菊科、兰科和蔷薇科的许多种植物中。大黄素甲醚对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、链球菌和痢疾杆菌等26种细菌均有抑制作用；大黄素甲醚是高活性植物源杀菌剂，对白粉病、霜霉病、灰霉病、炭疽病等有很好的防治效果。(《中华中医药学刊》，2015(4)：938-940)。专利cn200810203112.1还公开了大黄素甲醚对丙肝病毒有一定的抑制作用，但作用强度一般，需要进一步结构改造以增加活性。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种2-胺甲基-9，10-蒽醌衍生物、其制备方法及应用。该2-胺甲基-9，10-蒽醌衍生物显示了较好的抗hcv活性。

本发明提供了一种如式i所示的2-胺甲基-9，10-蒽醌衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗和/或预防丙型肝炎药物中的应用；

其中，r¹和r²独立地为r⁴取代或未取代的c1～c6烷基(所述的r⁴的个数可为一个或多个，又可为1个、2个或3个；当存在多个r⁴时，任意两个r⁴相同或不同；所述的“c1～c6的烷基”例如c1～c4的烷基，又例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基，还例如甲基)；

或者，r¹、r²及与它们相连的n原子共同形成r⁵取代或未取代的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种(且至少为n，该n与结构式中的亚甲基相连)，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”(所述的r⁵的个数可为一个或多个，又可为1个、2个或3个；当存在多个r⁵时，任意两个r⁵相同或不同；所有的r⁵可独立地位于与其他基团连接位点”的邻位、间位或对位，例如对位；所述的杂原子可为n、或、n和o；所述的杂原子数可为1个或2个；所述的杂环烷基可为5元或6元；所述的杂环烷基可通过n原子与其他基团连接；所述“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”例如“杂原子为n、或、n和o，杂原子数为1个或2个的5～6元杂环烷基”，又例如吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基或吗啉基；所述的吡咯烷基例如吡咯烷-1-基；所述的哌啶基例如哌啶-1-基；所述的哌嗪基例如哌嗪-1-基；所述的吗啉基例如吗啉-4-基)；

所有的r⁵独立地为c1～c4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基，又例如甲基)、c1～c4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基)、r⁶取代或未取代的苯基(所述的r⁶的个数可为一个或多个，又可为1个、2个或3个；当存在多个r⁶时，任意两个r⁶相同或不同；所有的r⁶可独立地位于“苯基与其他基团连接位点”的邻位、间位或对位，例如对位)、或、r⁷取代或未取代的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”(所述的r⁷的个数可为一个或多个，又可为1个、2个或3个；当存在多个r⁷时，任意两个r⁷相同或不同；所有的r⁷可独立地位于所述的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”与其他基团连接位点的邻位、间位或对位，例如对位；所述的杂原子可为n和/或o；所述的杂原子数可为1个或2个；所述的杂环烷基可为5元或6元；所述的杂环烷基可通过n原子与其他基团连接；所述“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”例如“杂原子为n和/或o，杂原子数为1个或2个的5～6元杂环烷基”，又例如吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基或吗啉基；所述的吡咯烷基例如吡咯烷-1-基；所述的哌啶基例如哌啶-1-基；所述的哌嗪基例如哌嗪-1-基；所述的吗啉基例如吗啉-4-基)；

所有的r⁴、r⁶和r⁷独立地为卤素(例如氟、氯、溴或碘，又例如氟)、c1～c4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基，又例如甲基)、或、c1～c4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基)；

r³为h或c1～c4的烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基，又例如甲基)。

当r¹、r²及与它们相连的n原子共同形成未取代的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种(且至少为n，该n与结构式中的亚甲基相连)，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”时，所述“杂原子选自n、o和s中的一种或多种(且至少为n，该n与结构式中的亚甲基相连)，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”可为吡咯烷-1-基、哌啶-1-基或吗啉-4-基。

当r¹、r²及与它们相连的n原子共同形成r⁵取代或未取代的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种(且至少为n，该n与结构式中的亚甲基相连)，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”时；其中，所述的未取代的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种(且至少为n，该n与结构式中的亚甲基相连)，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”可为吡咯烷-1-基、哌啶-1-基或吗啉-4-基；所述的r⁵取代的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种(且至少为n，该n与结构式中的亚甲基相连)，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”可为4-(哌啶基)哌啶-1-基或4-(对氟苯基)哌嗪-1-基。

在某一方案中，所述的化合物i中某些基团的定义可如下所述，未提及的基团的定义如上任一方案所述：

当r³为h时，r¹、r²及与它们相连的n原子共同形成r⁵取代的或未取代的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种(且至少为n，该n与结构式中的亚甲基相连)，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”；

当r³为c1～c4烷基时，r¹和r²各自独立地为c1～c6烷基，或者，r¹、r²及与它们相连的n原子共同形成r⁵取代的或未取代的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种(且至少为n，该n与结构式中的亚甲基相连)，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”。

在某一方案中，所述的化合物i中某些基团的定义可如下所述，未提及的基团的定义如上任一方案所述：

当r³为h时，r¹、r²及与它们相连的n原子共同形成r⁵取代的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种(且至少为n，该n与结构式中的亚甲基相连)，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”；所述的r⁵为r⁷取代或未取代的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”；

当r³为c1～c4烷基时，r¹和r²各自独立地为c1～c4的烷基，或者，r¹、r²及与它们相连的n原子共同形成未取代的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种(且至少为n，该n与结构式中的亚甲基相连)，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”。

在某一技术方案中，所述的化合物i可为如下任一结构：

所述的丙型肝炎可为hcv2a型(例如jfh1病毒株引起的)。

本发明又提供了所述的化合物i在制备hcv抑制剂中的应用；所述hcv例如hcv2a型(例如jfh1病毒株引起的)。

本发明又提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包含有如上所述的大黄素衍生物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。所述的药物组合物可为用于治疗丙型肝炎的药物组合物。

本发明还提供了一种如式ii所示的2-胺甲基-9，10-蒽醌衍生物；

其中，r³为h或c1～c4烷基；

当r³为c1～c4的烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基，又例如甲基)时：r^1’和r^2’独立地为r⁴取代或未取代的c1～c6烷基(所述的r⁴的个数可为一个或多个，又可为1个、2个或3个；当存在多个r⁴时，任意两个r⁴相同或不同；所述的“c1～c6的烷基”例如c1～c4的烷基，又例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基，还例如甲基)；

或者，r^1’、r^2’及与它们相连的n原子共同形成r⁵取代或未取代的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种(且至少为n，该n与结构式中的亚甲基相连)，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”(所述的r^5’的个数可为一个或多个，又可为1个、2个或3个；当存在多个r⁵时，任意两个r⁵相同或不同；所有的r⁵可独立地位于与其他基团连接位点”的邻位、间位或对位，例如对位；所述的杂原子可为n、或、n和o；所述的杂原子数可为1个或2个；所述的杂环烷基可为5元或6元；所述的杂环烷基可通过n原子与其他基团连接；所述“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”例如“杂原子为n、或、n和o，杂原子数为1个或2个的5～6元杂环烷基”，又例如吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基或吗啉基；所述的吡咯烷基例如吡咯烷-1-基；所述的哌啶基例如哌啶-1-基；所述的哌嗪基例如哌嗪-1-基；所述的吗啉基例如吗啉-4-基)；

当r³为h时：r^1’、r^2’及与它们相连的n原子共同形成r^5’取代的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种(且至少为n，该n与结构式中的亚甲基相连)，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”(所述的r⁵的个数可为一个或多个，又可为1个、2个或3个；当存在多个r^5’时，任意两个r^5’相同或不同；所有的r^5’可独立地位于与其他基团连接位点”的邻位、间位或对位，例如对位；所述的杂原子可为n和/或o；所述的杂原子数可为1个或2个；所述的杂环烷基可为5元或6元；所述的杂环烷基可通过n原子与其他基团连接；所述“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”例如“杂原子为n和/或o，杂原子数为1个或2个的5～6元杂环烷基”，又例如吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基或吗啉基；所述的吡咯烷基例如吡咯烷-1-基；所述的哌啶基例如哌啶-1-基；所述的哌嗪基例如哌嗪-1-基；所述的吗啉基例如吗啉-4-基)；

所有的r⁵独立地为c1～c4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基，又例如甲基)、c1～c4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基)、r⁶取代或未取代的苯基(所述的r⁶的个数可为一个或多个，又可为1个、2个或3个；当存在多个r⁶时，任意两个r⁶相同或不同；所有的r⁶可独立地位于“苯基与其他基团连接位点”的邻位、间位或对位，例如对位)、或、r⁷取代或未取代的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”(所述的r⁷的个数可为一个或多个，又可为1个、2个或3个；当存在多个r⁷时，任意两个r⁷相同或不同；所有的r⁷可独立地位于所述的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”与其他基团连接位点的邻位、间位或对位，例如对位；所述的杂原子可为n和/或o；所述的杂原子数可为1个或2个；所述的杂环烷基可为5元或6元；所述的杂环烷基可通过n原子与其他基团连接；所述“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”例如“杂原子为n和/或o，杂原子数为1个或2个的5～6元杂环烷基”，又例如吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基或吗啉基；所述的吡咯烷基例如吡咯烷-1-基；所述的哌啶基例如哌啶-1-基；所述的哌嗪基例如哌嗪-1-基；所述的吗啉基例如吗啉-4-基)；

所有的r^5’独立地为r⁷取代或未取代的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”(所述的r⁷的个数可为一个或多个，又可为1个、2个或3个；当存在多个r⁷时，任意两个r⁷相同或不同；所有的r⁷可独立地位于所述的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”与其他基团连接位点的邻位、间位或对位，例如对位；所述的杂原子可为n和/或o；所述的杂原子数可为1个或2个；所述的杂环烷基可为5元或6元；所述的杂环烷基可通过n原子与其他基团连接；所述“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”例如“杂原子为n和/或o，杂原子数为1个或2个的5～6元杂环烷基”，又例如吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基或吗啉基；所述的吡咯烷基例如吡咯烷-1-基；所述的哌啶基例如哌啶-1-基；所述的哌嗪基例如哌嗪-1-基；所述的吗啉基例如吗啉-4-基)；

所有的r⁴、r⁶和r⁷独立地为卤素(例如氟、氯、溴或碘，又例如氯)、c1～c4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基，又例如甲基)、或、c1～c4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基)。

当r³为c1～c4的烷基，r^1’、r^2’及与它们相连的n原子共同形成r⁵取代或未取代的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种(且至少为n，该n与结构式中的亚甲基相连)，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”时，所述“杂原子选自n、o和s中的一种或多种(且至少为n，该n与结构式中的亚甲基相连)，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”可为吡咯烷-1-基、哌啶-1-基或吗啉-4-基。

当r³为h，r^1’、r^2’及与它们相连的n原子共同形成r^5’取代或未取代的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种(且至少为n)，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”时；其中，所述的未取代的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种(且至少为n，该n与结构式中的亚甲基相连)，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”可为吡咯烷-1-基、哌啶-1-基或吗啉-4-基；所述的r^5’取代的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种(且至少为n，该n与结构式中的亚甲基相连)，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”可为4-(哌啶基)哌啶-1-基。

在某一方案中，所述的化合物i中某些基团的定义可如下所述，未提及的基团的定义如上任一方案所述：

当r³为h时，r^1’、r^2’及与它们相连的n原子共同形成r^5’取代的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”；所述的r^5’为未取代的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”；

当r³为c1～c4烷基时，r^1’和r^2’各自独立地为c1～c6烷基，或者，r^1’、r^2’及与它们相连的n原子共同形成未取代的“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1～3个的4～7元杂环烷基”。

在某一技术方案中，所述的化合物ii可为如下任一结构：

本发明还提供了一种上述式ii化合物的制备方法，在酸作用下，将化合物1与化合物2、甲醛进行加成反应，得到所述的式ii化合物，即可；

其中，r^1’、r^2’和r³如上所述。

所述的酸可为本领域该类反应常规的酸，例如醋酸。

所述的加成反应的反应条件可为本领域该类反应常规的反应条件，例如下述反应条件：

所述的加成反应可在醚类溶剂中进行。所述的醚类溶剂可为本领域该类反应常规的醚类溶剂，例如四氢呋喃和/或二氧六环。所述的醚类溶剂与所述的化合物1的体积摩尔比可为本领域该类反应常规的体积摩尔比，例如3ml/mmol。

在所述的加成反应中，所述的化合物2与所述的化合物1的摩尔比可为本领域该类反应常规的摩尔比，例如2～3。

在所述的加成反应中，所述的甲醛与所述的化合物1的摩尔比可为本领域该类反应常规的摩尔比，例如2～3。

在所述的加成反应中，所述的酸与所述的化合物1的摩尔比可为本领域该类反应常规的摩尔比，例如4～8。

所述的加成反应的温度可为本领域该类反应常规的温度，例如0℃～100℃(例如85℃)。

所述的加成反应的进程可采用本领域中的常规监测方法(例如tlc、hplc或nmr)进行监测，一般以化合物1不再反应时为反应终点，反应时间可为5h～15h(例如12h)。

术语“药学上可接受的盐”表示由适宜的非毒性有机酸、无机酸、有机碱或无机碱与化合物形成的盐，其保留化合物的生物活性。所述的有机酸可为本领域常规的能成盐的各种有机酸，例如甲磺酸、对甲苯磺酸、马来酸、富马酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸、草酸、丁二酸、苯甲酸、羟乙基磺酸、萘磺酸和水杨酸中的一种或多种。所述的无机酸可为本领域常规的能成盐的各种无机酸，例如盐酸、硫酸和磷酸中的一种或多种。所述的有机碱可为本领域常规的能成盐的各种有机碱，例如吡啶类、咪唑类、吡嗪类、吲哚类、嘌啉类、叔胺类和苯胺类中的一种或多种。所述的叔胺类有机碱例如三乙胺和/或n，n-二异丙基乙胺。所述的苯胺类有机碱例如n，n-二甲基苯胺。所述的吡啶类有机碱例如吡啶、甲基吡啶、4-二甲氨基吡啶和2-甲基-5-乙基吡啶中的一种或多种。所述的无机碱可为本领域常规的能成盐的各种无机碱，例如碱金属氢化物、碱金属的氢氧化物、碱金属的烷氧化物、碳酸钾、碳酸钠、碳酸锂、碳酸铯、碳酸氢钾和碳酸氢钠中的一种或多种。所述的碱金属氢化物例如氢化钠和/或氢化钾。所述的碱金属的氢氧化物例如氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化锂中的一种或多种。所述的碱金属的烷氧化物例如甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钾和叔丁醇钠中的一种或多种。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明提供的大黄素衍生物显示了较好的抗hcv活性。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1

取5mmol大黄素甲醚溶于15ml二氧六环，加入10mmol甲醛水溶液、40mmol醋酸和10mmol二甲胺，升温至85℃反应12小时，减压蒸出溶剂，加15ml饱和碳酸氢钠水溶液，再以15ml二氯甲烷萃取三次，有机相合并，15ml水洗一次，乙酸乙酯重结晶得化合物1，收率75％。2-(二甲胺基)甲基-1，8-二羟基-3甲氧基-6-甲基蒽醌-9，10-二酮，2-((dimethylamino)methyl)-1，8-dihydroxy-3-methoxy-6-methylanthracene-9，10-dione；

¹hnmr(500mhz，cdcl3)δ12.28(s，1h)，7.61(s，1h)，7.41(s，1h)，7.08(s，1h)，4.02(s，3h)，3.63(s，2h)，2.45(s，3h)，2.34(s，6h)；¹³cnmr(126mhz，cdcl3)δ190.8，182.3，164.5，163.2，162.5，148.2，134.4，133.0，124.6，121.0，119.7，113.8，110.9，102.8，56.5，50.4，45.4，22.1；esi-ms：m/z342.2[m+h]⁺。

实施例2

反应条件及操作同实施例1，仅将二甲胺替换为吗啉，得化合物2，收率69％。

¹hnmr(500mhz，cdcl3)δ12.74(s，1h)，12.11(s，1h)，7.63(s，1h)，7.24(s，1h)，7.08(s，1h)，3.99(s，2h)，3.83(s，3h)，3.81(brs，4h)，2.69(brs，4h)，2.47(s，3h)；¹³cnmr(126mhz，cdcl3)δ190.9，182.3，166.6，162.5，162.1，148.7，134.9，133.8，124.9，121.8，120.5，114.5，112.9，110.8，108.9，66.6，55.9，54.1，53.4，22.2；esi-ms：m/z384.2[m+h]⁺。

实施例3

取5mmol大黄素溶于15ml二氧六环，加入10mmol甲醛水溶液、40mmol醋酸和10mmol4-哌啶基哌啶，升温至85℃反应12小时，减压蒸出溶剂，加15ml饱和碳酸氢钠水溶液，再以15ml二氯甲烷萃取三次，有机相合并，15ml水洗一次，乙酸乙酯重结晶得化合物3，收率41％。

¹hnmr(500mhz，cdcl3)δ12.71(s，1h)，12.13(s，1h)，7.61(s，1h)，7.14(s，1h)，7.03(s，1h)，3.97(s，2h)，3.57-3.89(m，8h)，2.64-2.91(m，8h)，2.45(s，3h)，1.75-1.85(m，2h)；¹³cnmr(126mhz，cdcl3)δ190.7，181.5，167.6，163.5，162.7，147.9，135.1，133.2，124.1，121.1，120.2，115.1，113.3，111.2，107.9，71.1，66.6，57.9，55.9，54.1，53.4，25.6，23.5，22.2；esi-ms：m/z451.2[m+h]⁺。

效果实施例化合物抑制hcv病毒株的活性测试

目的：检测化合物对hcv2a型jfh1病毒的抗病毒效果。

试验手段：hcv感染稳定细胞株huh7.5.1

试验分组：药物阳性对照(干扰素α：默瑞(上海)生物科技有限公司)，待测药物组化合物(0，0.625μm，1.25μm，2.5μm，5μm，10μm)，阴性对照组。

检测项目及指标：hcvrna含量，非结构蛋白ns3表达。

实验方案：

细胞：hcv易感细胞系huh7.5.1(上海生科院细胞库)，细胞密度为6孔板(美国corning)铺入细胞，1×10⁵/孔；

病毒：jfh1株(基因型2a，中科院武汉病毒研究所)，病毒感染计量为1mol；

实验流程：

1.按照实验方案对细胞huh7.5.1进行计数后铺入6孔板，细胞贴壁过夜；

2.按照感染剂量加入hcv病毒(jfh1)，感染6小时后换液，加入含有不同浓度(0，0.625μm，1.25μm，2.5μm，5μm，10μm)衍生物的新鲜培养基，即以2倍稀释度建立连续药物稀释浓度。并每天按照对应浓度进行含对应浓度新鲜培养基更换，维持药物浓度。其中药物实验阴性对照组为药物溶剂(ddh2o)，阳性对照为干扰素(peg-ifnα，500iu/ml，特拉匹韦(vx950)，10μm)。

3.感染伴随药物处理72小时后，收取样品，其中上清使用tcid50方法检测感染性病毒粒子滴度，细胞组分一半使用real-time检测病毒基因组拷贝数，一半使用westernblot方法检测病毒非结构蛋白ns3表达水平，其中gapdh作为对照。

实验结果形式：hcvrna含量，非结构蛋白ns3表达，病毒tcid50水平。

表1