一种高效刺激活化中心记忆T细胞的试剂盒的制作方法

本实用新型涉及生物技术领域，尤其涉及一种高效刺激活化中心记忆T细胞的试剂盒。

背景技术：

T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体，识别特异性抗原后引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。中心记忆T细胞是T细胞经过抗原激活后，产生的具有长期记忆性的，并能够归巢到淋巴结接受抗原再刺激的T细胞。在功能上，和其他类型的T细胞相比，Tcm细胞回输到体内可被肿瘤抗原再激活起到直接杀伤肿瘤的作用。同时Tcm细胞具有自我更新及复制能力，在体内存活时间长，可起到长期抗肿瘤作用。并且Tcm在体外能够高效率扩增保证T细胞的回输数量，也可被定量化的监测为临床规范化治疗提供参考指标。因此，Tcm细胞在免疫治疗中显示很好的应用前景。目前免疫治疗的手段有很多，最根本最基础的还是T细胞活化技术。

IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。IL-12是最为强的诱导T细胞特别是活化的T细胞和NK细胞产生IFN-γ的细胞因子。IL-15生物学作用与IL-2相似。其细胞来源和靶细胞分布较IL-2广，故能在不表达IL-2的部位发挥类似IL-2的效应，和IL-2合用起协同作用。L-Glu，谷氨酞胺具有重要的免疫调节作用，它是淋巴细胞分泌、增殖及其功能维持所必需的。

现有T细胞活化技术对于初始T细胞的数量要求多，而目前应用细胞治疗的大多数为肿瘤患者，经过放化疗后，一些人身体状况差，外周血像差，能采集到的PBMC少；另外，现有激活方法效率低，细胞扩增倍数小，只有200倍左右，CD3+CD8+双阳性比例低，只有20％左右，为此，我们提出了一种高效刺激活化中心记忆T细胞的试剂盒来解决上述问题。

技术实现要素：

本实用新型的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种高效刺激活化中心记忆T细胞的试剂盒。

为了实现上述目的，本实用新型采用了如下技术方案：

一种高效刺激活化中心记忆T细胞的试剂盒，包括盒体，所述盒体上铰接有盒盖，所述盒体内设有第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽、第六凹槽、第七凹槽，所述第一凹槽和第二凹槽内设有第一细胞培养液试剂瓶，所诉第三凹槽内设有第二细胞培养液试剂瓶，所述第四凹槽内设有细胞培养添加试剂瓶，所述第五凹槽内设有细胞激活添加试剂瓶，所述第六凹槽内设有第一细胞因子添加试剂瓶，所述第七凹槽内设有第二细胞因子添加试剂瓶。

优选地，所述第一细胞培养液试剂瓶的容量为100-500mL，所述第二细胞培养液试剂瓶的容量为10-50mL，所述细胞培养液添加试剂瓶的容量为1-50mL，所述细胞激活添加试剂瓶的容量为2-5mL，所述第一细胞因子添加剂试剂瓶的容量为0.5-2mL，所述第二细胞因子添加剂试剂瓶的容量为0.5-2mL。

优选地，所述第一细胞培养液试剂瓶内设有第一细胞培养液，所述第二细胞培养液试剂瓶内设有第二细胞培养液，所述细胞培养添加试剂瓶内设有细胞培养添加剂，所述细胞激活添加试剂瓶内设有细胞激活添加剂，所述第一细胞因子添加试剂瓶和第二细胞因子添加试剂瓶内设有第一细胞因子添加剂和第二细胞因子添加剂。

优选地，所述盒盖上设有限位槽，所述限位槽内铰接有提手。

优选地，所述盒盖上设有锁扣，所述盒体上设有和锁扣对应的锁孔。

本实用新型中，试剂盒使用时，一、病人签署知情同意书后，采集外周血30mL，利用Ficoll-Hypaque梯度离心法进行PBMC的分离，分出单个核细胞层；二、吸取单个核细胞层中的液体至离心管中，加入第一细胞培养液，然后离心、洗涤，洗涤后去除上清液，加入磁珠混合10min，混合后在分离柱中去除非T细胞，再次离心洗涤；离心和洗涤操作依次交替进行两次，第一次1200rpm离心6min，第二次1500rpm离心10min；也就是说，在步骤二中，要依次进行四次离心和洗涤的操作，以保证实验的顺利进行和最终成品的品质；三、使用含有0.5％细胞因子添加剂E，1％细胞培养添加剂和5wt％人血白蛋白的无血清培养液重悬步骤二得到的细胞，得到细胞悬液，细胞悬液中的细胞浓度为5X10⁵cells/ml；四、在多孔板中，加入D-PBS、细胞激活添加剂B，混合均匀，并在5℃保存20h，得到单抗稀释液；五、将单抗稀释液加入步骤三细胞悬液中，并补加0.5％的细胞因子添加剂F，混合均匀后置于39℃、5％CO2培养箱中培养28h，得到细胞培养液Ⅰ；培养3天后，将细胞转移至T175培养瓶中继续培养，以保证细胞有充足的生长空间；六、向细胞培养液Ⅰ中补加0.5％细胞因子添加剂E，1％细胞培养添加剂和5wt％人血白蛋白的无血清培养液，并补加IL-1α、细胞激活添加剂B；得到细胞培养液Ⅱ；七、从步骤五开始，每隔两天用培养液半量换液；所述半量换液为：取一半含细胞的培养基，离心收集细胞后去除培养基，加入1％细胞因子添加剂E，1％细胞培养添加剂和5wt％人血白蛋白的无血清培养液至细胞浓度为5X10⁵cells/ml；八、从步骤五开始，培养14天后，收集T细胞，将T细胞离心后，生理盐水洗涤三次，即得到活化的中心记忆T细胞。

经流式细胞仪检测结果表明，刺激活化T细胞的方法能够激活扩增T细胞1000倍，CD3+CD8+双阳性的T细胞比例可达60％，明显高于现有技术,本实用新型提供的试剂盒只需要20mL-80mL的外周血，或者2X10⁷-5X10⁷个细胞即可，对人几乎无影响，试剂盒使用方便、可操作性强，组分明确，流程简单，经济实用，利用其刺激活活的中心记忆T细胞，可用于临床前研究或入库保存。

附图说明

图1为本实用新型提出的一种高效刺激活化中心记忆T细胞的试剂盒的外观结构示意图；

图2为本实用新型提出的一种高效刺激活化中心记忆T细胞的试剂盒的内部结构示意图；

图3为本实用新型提出的一种高效刺激活化中心记忆T细胞的试剂盒的第一细胞培养液试剂瓶结构示意图；

图4为本实用新型提出的一种高效刺激活化中心记忆T细胞的试剂盒的第二细胞培养液试剂瓶结构示意图；

图5为本实用新型提出的一种高效刺激活化中心记忆T细胞的试剂盒的细胞培养添加试剂瓶结构示意图；

图6为本实用新型提出的一种高效刺激活化中心记忆T细胞的试剂盒的细胞激活添加试剂瓶结构示意图；

图7为本实用新型提出的一种高效刺激活化中心记忆T细胞的试剂盒的第一细胞因子添加试剂瓶结构示意图；

图8为本实用新型提出的一种高效刺激活化中心记忆T细胞的试剂盒的第二细胞因子添加试剂瓶结构示意图。

图中：1盒盖、2盒体、3第一凹槽、4第二凹槽、5第三凹槽、6第四凹槽、7第五凹槽、8第六凹槽、9第七凹槽、10第一细胞培养液试剂瓶、11第二细胞培养液试剂瓶、12细胞培养添加试剂瓶、13细胞激活添加试剂瓶、14第一细胞因子添加试剂瓶、15第二细胞因子添加试剂瓶。

具体实施方式

下面将结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。

参照图1-8，一种高效刺激活化中心记忆T细胞的试剂盒，其包括盒体2，可开启的盒盖1，位于盒体2内部的凹槽和存放于凹槽内的试剂瓶，如图2所示，第一细胞培养液试剂瓶10存放于盒体2的第一凹槽3和第二凹槽4内，总容量为200mL，用于盛放第一细胞培养液，该培养液为RPMI-1640液体培养基。第二细胞培养液试剂瓶11存放于盒体2的第三凹槽5内，总容量为20ml，用于盛放第二细胞培养液，该培养液为人血白蛋白。

细胞培养液添加试剂瓶12存放于盒体2的第四凹槽6内，总容量为4ml，用于盛放细胞培养添加剂，细胞培养添加剂为含200mM L-谷氨酰胺、200mM丙酮酸钠、200mM非必须氨基酸、100mM Hepes、10KU/mL的青霉素和10mg/mL的链霉素浓度为0.85％的生理盐水，细胞激活添加试剂瓶13存放于盒体2的第五凹槽7内，总容量为4mL，用于盛放细胞激活添加剂，细胞激活添加剂选用包被有单克隆抗体OKT3和单克隆抗体CD28的纳米微粒，浓度为2X10⁸个纳米微粒/mL的DPBS溶液，第一细胞因子添加试剂瓶14存放于盒体2的第六凹槽8内，总容量为0.4mL，用于盛放细胞因子添加剂，细胞因子添加剂为含10μg/mL的白细胞介素2IL-2无菌蒸馏水溶液，第二细胞因子添加试剂瓶15存放于盒体2的第七凹槽9内，总容量为0.4mL，用于盛放细胞因子添加剂，细胞因子添加剂为含25μg/mL的白细胞介素12IL-12和25μg/mL的白细胞介素15IL-15无菌蒸馏水溶液。

本实用新型中，试剂盒使用时，一、病人签署知情同意书后，采集外周血30mL，利用Ficoll-Hypaque梯度离心法进行PBMC的分离，分出单个核细胞层；二、吸取单个核细胞层中的液体至离心管中，加入第一细胞培养液，然后离心、洗涤，洗涤后去除上清液，加入磁珠混合10min，混合后在分离柱中去除非T细胞，再次离心洗涤；离心和洗涤操作依次交替进行两次，第一次1200rpm离心6min，第二次1500rpm离心10min；也就是说，在步骤二中，要依次进行四次离心和洗涤的操作，以保证实验的顺利进行和最终成品的品质；三、使用含有0.5％细胞因子添加剂E，1％细胞培养添加剂和5wt％人血白蛋白的无血清培养液重悬步骤二得到的细胞，得到细胞悬液，细胞悬液中的细胞浓度为5X10⁵cells/ml；四、在多孔板中，加入D-PBS、细胞激活添加剂B，混合均匀，并在5℃保存20h，得到单抗稀释液；五、将单抗稀释液加入步骤三细胞悬液中，并补加0.5％的细胞因子添加剂F，混合均匀后置于39℃、5％CO₂培养箱中培养28h，得到细胞培养液Ⅰ；培养3天后，将细胞转移至T175培养瓶中继续培养，以保证细胞有充足的生长空间；六、向细胞培养液Ⅰ中补加0.5％细胞因子添加剂E，1％细胞培养添加剂和5wt％人血白蛋白的无血清培养液，并补加IL-1α、细胞激活添加剂B；得到细胞培养液Ⅱ；七、从步骤五开始，每隔两天用培养液半量换液；半量换液为：取一半含细胞的培养基，离心收集细胞后去除培养基，加入1％细胞因子添加剂E，1％细胞培养添加剂和5wt％人血白蛋白的无血清培养液至细胞浓度为5X10⁵cells/ml；八、从步骤五开始，培养14天后，收集T细胞，将T细胞离心后，生理盐水洗涤三次，即得到活化的中心记忆T细胞。

经流式细胞仪检测结果表明，刺激活化T细胞的方法能够激活扩增T细胞1000倍，CD3+CD8+双阳性的T细胞比例可达60％，明显高于现有技术。

以上，仅为本实用新型较佳的具体实施方式，但本实用新型的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本实用新型揭露的技术范围内，根据本实用新型的技术方案及其实用新型构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本实用新型的保护范围之内。