生腱蛋白表位和其抗体的制作方法

本公开涉及一种用于生腱蛋白c(tenascin-c)的中和表位和对其有特异性的结合结构域，例如抗体或其结合片段；包括所述抗体或其结合片段的药物组合物；以及所述抗体、所述结合片段或所述组合物用于治疗，特别是治疗炎症性病症的用途。
背景技术：
：一些工作表明，生腱蛋白c的fbg结构域的p-亚结构域的所谓环5、环7和环10是用于结合tlr4受体的关键表位。生腱蛋白c的fbg结构域与tlr4的相互作用被认为是增加体内炎症反应持久性的原因。fbg结构域的这些区域，特别是环5，被认为是用抑制剂，如抗体和结合片段靶向的所关注区域。令人惊讶的是，本发明人已经建立，不包含来自环5的任何残基的构象表位中和生腱蛋白c的fbg结构域的“炎症性活性”。技术实现要素：一方面，提供了一种生腱蛋白c的中和表位，其包括至少5个独立地选自下组的氨基酸：ala2215、tyr2116、asn2118、ser2131、ile2133、tyr2140、arg2147、asn2148、cys2149、his2150、arg2151、his2163、ser2164、phe2170、his2171和his2175，其中所述氨基酸残基位置由uniprotid:p24821(seqidno:1)中公开的蛋白质限定。在一个实施例中，本公开的表位是构象表位。在一个实施例中，表位被限定为定位在结合实体的或内的氨基酸残基，如特别是本文公开的抗体c3的结合结构域的抗体或片段。在一个实施例中，根据本公开的生腱蛋白c的中和表位包括至少一个带电残基arg2147。在一个实施例中，根据本公开的生腱蛋白c的中和表位包括带电残基arg2151。在一个实施例中，根据本公开的生腱蛋白c的中和表位包括至少一个疏水残基ile2133。在一个实施例中，根据本公开的生腱蛋白c的中和表位包括氨基酸arg2147、asn2148、cys2149、his2150和arg2151的线性序列。在一个实施例中，根据本公开的生腱蛋白c的中和表位包括极性残基his2163。在一个实施例中，根据本公开的生腱蛋白c的中和表位包括cys2149。在一个实施例中，根据本公开的生腱蛋白c的中和表位包括疏水残基his2171。在一个实施例中，根据本公开的生腱蛋白c的中和表位包括极性氨基酸tyr2116。在一个实施例中，根据本公开的生腱蛋白c的中和表位包括疏水残基phe2170。在一个实施例中，根据本公开的生腱蛋白c的中和表位包括ile2133、arg2147、asn2148、his2163和phe2170。在一个实施例中，根据本公开的生腱蛋白c的中和表位进一步包括氨基酸残基ser2131。在一个实施例中，根据本公开的生腱蛋白c的中和表位进一步包括氨基酸残基tyr2216。在一个实施例中，根据本公开的生腱蛋白c的中和表位包括所述氨基酸残基中的6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个。在一个实施例中，提供了一种表位的抑制剂，例如小化学实体、抗体或其结合片段。在一个实施例中，提供了一种例如中和抗体或其结合片段中的结合结构域，其结合根据本公开的表位。本发明还提供了与本发明提供的中和表位结合和/或相互作用的抗体及其结合片段。应当理解，抗体可以直接或间接与本发明的表位相互作用，例如通过直接结合或通过变构相互作用。特别地，形成本公开的一方面的抗体和结合片段具有与本文公开的抗体c3的性质类似的所述一种或多种性质，如亲和力。在一个实施例中，根据本公开的结合结构域在细胞表面上表达，例如作为嵌合抗原受体的一部分。在一个实施例中，根据本公开的中和抗体或结合片段具有至少一个选自抗体或结合片段重链的残基100、101、102、104和105的氨基酸，其与表位相互作用，因为所述氨基酸被定位成距离表位4埃以内，例如残基中的两个、三个、四个或五个与表位相互作用。在一个实施例中，抗体或结合片段的重链的氨基酸残基100是极性的，例如为酪氨酸。在一个实施例中，抗体或结合片段的重链的氨基酸101是极性氨基酸，例如gln。在一个实施例中，抗体或结合片段的重链的氨基酸102是极性的，例如为丝氨酸。在一个实施例中，抗体或结合片段的重链的氨基酸104是带电的，例如为glu。在一个实施例中，抗体或结合片段的重链的氨基酸105是带负电的氨基酸，例如asp。在一个实施例中，根据本公开的中和抗体或结合片段具有至少一个选自抗体或结合片段轻链的残基28、30、31、32、50、51、52、53、64、91和92的氨基酸，其与表位相互作用，因为所述氨基酸被定位成距离表位4埃以内，例如残基中的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个与表位相互作用。在一个实施例中，抗体或结合片段的轻链的氨基酸残基28是极性的，例如为酪氨酸。在一个实施例中，抗体或结合片段的轻链的氨基酸30是极性氨基酸，例如谷氨酰胺。在一个实施例中，抗体或结合片段的轻链的氨基酸31是疏水的，例如为甘氨酸。在一个实施例中，抗体或结合片段的轻链的氨基酸32是疏水的，例如为苯丙氨酸。在一个实施例中，抗体或结合片段的轻链的氨基酸50是带电氨基酸，例如天冬氨酸。在一个实施例中，抗体或结合片段的轻链的氨基酸51是疏水的，例如为丙氨酸。在一个实施例中，抗体或结合片段的轻链的氨基酸52是疏水的，例如为甘氨酸。在一个实施例中，抗体或结合片段的轻链的氨基酸53是极性氨基酸，例如天冬酰胺。在一个实施例中，抗体或结合片段的轻链的氨基酸64是疏水的，例如为甘氨酸。在一个实施例中，抗体或结合片段的轻链的氨基酸91是极性的，例如为丝氨酸。在一个实施例中，抗体或结合片段的轻链的氨基酸92是极性氨基酸，例如酪氨酸。在一个实施例中，抗体或结合片段是人或人源化的。在一个实施例中，抗体或结合片段的亲和力处于5pm到500nm的范围内，例如10pm、20pm、30pm、40pm、50pm、60pm、70pm、80pm、90pm、100pm、150pm、200pm、250pm、300pm、350pm、400pm、450pm、500pm、550pm、600pm、650pm、700pm、750pm、800pm、900pm、或950pm、1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、100nm、150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、或450nm。在一个实施例中，本公开的抗体或结合片段不包括c3抗体的cdr。在一个实施例中，本公开的抗体或结合片段不包括b12抗体的cdr。在一个实施例中，本公开的抗体或结合片段不包括2a5抗体的cdr。还提供了一种药物组合物，其包括根据本公开的抗体或结合片段和稀释剂、赋形剂和/或载剂。一方面，本公开延伸到中和抗体或结合片段或包括其中任何一种的药物组合物，其用于治疗，特别是用于治疗慢性炎症。具体实施方式除非上下文另有说明，否则抗体及其结合片段包括6个cdr序列。如本文所用，“不包括c3、b12和2a5的cdr”是指其中cdrh1、cdrh2、h3、l1、l2l3中的任何一个中的至少一个氨基酸及其两个或更多个的组合被取代、添加或缺失，则cdr序列与本文公开的序列(包含所述抗体的系列成员)不同。在一个实施例中，本公开的抗体或结合片段包括至少一个与本文公开的cdr序列不同的cdr序列，特别是不同的，例如通过添加、取代或缺失(特别是取代或缺失)至少一个氨基酸，如至少一个cdr序列中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、或更多个氨基酸。在一个实施例中，cdrh1被修饰为与本文公开的序列不同。在一个实施例中，cdrh2被修饰为与本文公开的序列不同。在一个实施例中，cdrh3被修饰为与本文公开的序列不同。在一个实施例中，cdrl1被修饰为与本文公开的序列不同。在一个实施例中，cdrl2被修饰为与本文公开的序列不同。在一个实施例中，cdrl3被修饰为与本文公开的序列不同。在一个实施例中抗体或结合片段的结合结构域中的两个cdr不同，例如cdrh1和h2；cdrh1和h3；cdrh2和h3；cdrl1和l2；cdrl1和l3；cdrl2和l3；cdrh1和cdrl1；cdrh2和l1；cdrh3和l1；cdrh1和l2；cdrh2和l2；cdrh3和l2；cdrh1和l3；cdrh2和l3；cdrh3和l3与本文的序列不同，例如通过添加、取代或缺失(特别是取代或缺失)至少一个氨基酸，如在至少一个cdr序列中不同的1个、2个、3个、4个、5个、6个或氨基酸。在一个实施例中，抗体或其结合片段的结合结构域中的三个cdr不同，例如cdrh1、h2和h3；cdrl1、l2和l3，cdrh1、h2和l1；cdrh1、h2和l2；cdrh1、h2和l3；cdrh1、h3和l1；cdrh1、h3和l2；cdrh1、h3和l3；cdrh2、h3和l1；cdrh2、h3和l2；cdrh2、h3和l3；cdrl1、l2和h1；cdrl1、l2和h2；cdrl1、l2和h3；cdrl1、l3和h1；cdrl1、l3和h2；cdrl1、l3和h3；cdrl2、l3和h1；cdrl2、l3和h2；cdrl2、l3和h3与本文的序列不同，例如通过添加、取代或缺失(特别是取代或缺失)至少一个氨基酸，如在至少一个cdr序列中不同的1个、2个、3个、4个、5个、6个或氨基酸。在一个实施例中，结合结构域中的4个cdr与本文公开的对应抗体cdr不同。在一个实施例中，结合结构域中的5个cdr与本文公开的对应抗体cdr不同。在一个实施例中，结合结构域中的6个cdr与本文公开的对应抗体cdr不同。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:27，cdrh2是seqidno:28，cdrh3是seqidno:29。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:8，cdrl3是seqidno:31。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:34，cdrh2是seqidno:35，cdrh3是seqidno:36。cdrl1是seqidno:38，cdrl2是seqidno:39，cdrl3是seqidno:40。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:4，cdrh2是seqidno:5，cdrh3是seqidno:22。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:8，cdrl3是seqidno:24。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:4，cdrh2是seqidno:5，cdrh3是seqidno:43。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:8，cdrl3是seqidno:9。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:4，cdrh2是seqidno:5，cdrh3是seqidno:46。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:8，cdrl3是seqidno:9。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:4，cdrh2是seqidno:5，cdrh3是seqidno:49。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:8，cdrl3是seqidno:9。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:4，cdrh2是seqidno:5，cdrh3是seqidno:6。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:8，cdrl3是seqidno:9。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:4，cdrh2是seqidno:5，cdrh3是seqidno:53。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:8，cdrl3是seqidno:9。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:4，cdrh2是seqidno:5，cdrh3是seqidno:15。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:8，cdrl3是seqidno:9。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:4，cdrh2是seqidno:5，cdrh3是seqidno:21。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:8，cdrl3是seqidno:9。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:4，cdrh2是seqidno:5，cdrh3是seqidno:45。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:8，cdrl3是seqidno:9。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:4，cdrh2是seqidno:5，cdrh3是seqidno:51。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:8，cdrl3是seqidno:9。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:13。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:56。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:58。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:60。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:62。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:64。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:66。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:68。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:70。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:72。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:74。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:76。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:78。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:13。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:80。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:13。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:83。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:13。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:86。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:13。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:89。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:13。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:92。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:13。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:95。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:13。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:98。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:13。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:101或102。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:13。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:105。在一个实施例中，至少一个，如1个、2个、3个、4个、5个、或6个cdr与cdrh1不同，seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:13。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:108。如本文所用，不同是指在至少一个cdr，如1个、2个、3个、4个、5个或6个cdr序列中添加、取代或缺失(特别是取代或缺失)至少一个氨基酸，如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个氨基酸。如本文所用，“中和表位”是指以下表位，其可以被抑制或阻断，从而中和生腱蛋白(如生腱蛋白c)的fbg结构域，特别是其p-亚结构域对其一种或多种受体(例如tlr4)的生物信号传导活性。如本文所用，术语“中和抗体”描述了能够中和生腱蛋白(如生腱蛋白c)的fbg结构域，特别是其p-亚结构域对其受体中的一种或多种的生物信号传导活性的抗体，例如tlr4。应当理解，如本文所用，术语“中和”是指生物信号传导活性的降低，其可以是部分或完全的。抗体可变结构域中的残基通常根据kabat等人设计的系统编号。此系统在kabat等人,1987,美国美国国立卫生研究院美国卫生和人类服务部免疫学兴趣蛋白质序列中提出(以下简称“kabat等人,(同上)”)。除非另有说明，否则此编号系统用于本说明书中。kabat残基名称并不总是与氨基酸残基的线性编号直接对应。实际线性氨基酸序列可以含有比严格kabat编号中更少或更多的氨基酸，对应于基本可变结构域结构的框架或互补确定区域(cdr)的缩短或插入结构组分。通过将抗体序列中的同源残基与“标准”kabat编号序列比对，可以确定给定抗体的正确kabat残基编号。根据kabat编号系统，重链可变结构域的cdr定位在残基31-35(cdr-h1)、残基50-65(cdr-h2)和残基95-102(cdr-h3)处。然而，根据chothia(chothia，c.和lesk，a.m.《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》,196,901-917(1987))，等同于cdr-h1的环从残基26延伸到残基32。因此，如本文所用，‘cdr-h1’包括残基26到35，如kabat编号系统和chothia拓扑环定义的组合所述。根据kabat编号系统，轻链可变结构域的cdr定位在残基24-34(cdr-l1)、残基50-56(cdr-l2)和残基89-97(cdr-l3)处。用于本发明的抗体包含完整抗体和功能活性片段或其衍生物，并且可以是但不限于单克隆、多价、多特异性、完全人、人源化或嵌合抗体、结构域抗体，例如vh、vl、vhh、单链抗体、fab片段、fab'和f(ab')2片段以及任何上述的表位结合片段。其它抗体片段包含国际专利申请wo2005003169、wo2005003170和wo2005003171中描述的那些。抗体片段和产生它们的方法是本领域熟知的，参见例如verma等人,1998,《免疫法杂志(journalofimmunologicalmethods)》216,165-181；adair和lawson，2005.“治疗性抗体(therapeuticantibodies)”《药物设计评论-在线(drugdesignreviews-online)》2(3):209-217。用于本发明的抗体包含免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以是任何类别(例如igg、ige、igm、igd和iga)或免疫球蛋白分子的亚类。如果存在，本发明的抗体分子的恒定区域结构域可以考虑所提出的抗体分子的功能，并且特别是可能需要的效应子功能来选择。例如，恒定区域结构域可以是人iga、igd、ige、igg或igm结构域。特别地，当抗体分子旨在用于治疗用途并且需要抗体效应子功能时，可以使用人igg恒定区域结构域，尤其是igg1和igg3同种型。替代性地，当抗体分子旨在用于治疗用途并且不需要抗体效应子功能时，例如仅用于阻断活性，可以使用igg2和igg4同种型。应当理解，还可以使用这些恒定区域结构域的序列变体。例如，可以使用igg4分子，其中位置241处的丝氨酸已经如angal等人,《分子免疫学(molecularimmunology)》,1993,30(1),105-108中所描述的变为脯氨酸。特别优选的是包括此变化的igg4恒定结构域。本领域技术人员还将理解，抗体可以经历多种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度通常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。这种修饰可以包含糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺的变化。频繁修饰是由于羧肽酶的作用而丧失羧基末端碱性残基(如赖氨酸或精氨酸)(如harris，rj.《色谱学杂志(journalofchromatography)》705:129-134,1995中所述)。单克隆抗体可以通过本领域已知的任何方法制备，如杂交瘤技术(kohler&milstein,1975,《自然(nature)》,256:495-497)；三体瘤技术、人b细胞杂交瘤技术(kozbor等人,1983,《今日免疫学(immunologytoday)》,4:72)和ebv-杂交瘤技术(cole等人,《单克隆抗体与癌症治疗(monoclonalantibodiesandcancertherapy)》,第77-96页,alanrliss,inc.,1985)。用于本发明的抗体也可以使用单一淋巴细胞抗体方法通过克隆和表达由选择用于产生特异性抗体的单个淋巴细胞生成的免疫球蛋白可变区域cdna生成，通过例如babcook,j.等人,1996,《美国国家科学院学报(proc.natl.acad.sci.usa)》93(15):7843-7848l；wo92/02551；wo2004/051268和国际专利申请号wo2004/106377中描述的方法。人源化抗体是来自非人物种的抗体，其具有来自非人物种的一个或多个互补确定区域(cdr)和来自人免疫球蛋白分子的框架区域(参见例如us5,585,089；wo91/09967)。嵌合抗体是由免疫球蛋白基因编码的那些抗体，其已经经过基因工程改造，使得轻链和重链基因由属于不同物种的免疫球蛋白基因区段组成。这些嵌合抗体可能具有较低的抗原性。可以通过本领域已知的方法制备二价抗体(milstein等人,1983,《自然(nature)》305:537-539；wo93/08829，traunecker等人,1991,《欧洲分子生物学杂志(emboj.)》10:3655-3659)。多价抗体可以包括多种特异性或者可以是单特异性的(参见例如wo92/22853和wo05/113605)。用于本发明的抗体也可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法生成，并且包含brinkman等人,(《免疫法杂志(j.immunol.methods)》1995,182:41-50中)，ames等人,(《免疫法杂志(j.immunol.methods)》,1995,184:177-186)，kettleborough等人,(《欧洲免疫学杂志(eur.j.immunol.)》1994,24:952-958)，persic等人,(《基因(gene)》,19971879-18)，burton等人,(《免疫学进展(advancesinimmunology)》,1994,57:191-280)和wo90/02809；wo91/10737；wo92/01047；wo92/18619；wo93/11236；wo95/15982；wo95/20401和us5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5750753；5821047；5,571,698；5,427,908；5516637；5780225；5,658,727；5,733,743和5,969,108中公开的那些。用于产生单链抗体的技术，如us4,946,778中描述的那些，也可以适用于产生结合根据本公开的表位的单链抗体。而且，转基因小鼠或其它生物，包含其它哺乳动物可以用于表达人源化抗体。可以将本文公开的抗体和结合片段突变并工程化和/或亲和力成熟和/或交换轻链以提供新的抗体和结合片段。替代性地，可以生成对本文公开的抗体的结合位点特异的特发性抗体。以这种方式生成的这些特发性抗体可能具有与本公开的原始抗体结合相同表位的倾向增加。完全人抗体是那些抗体，其中重链和轻链两者的可变区域和恒定区域(如果存在的话)都是人源的，或者基本上与人源序列相同，不一定来自相同的抗体。完全人抗体的实例可以包含例如通过上述噬菌体展示方法产生的抗体和由小鼠产生的抗体，其中鼠免疫球蛋白可变区域和恒定区域基因已经被其人对应物替代，例如如ep0546073b1、us5,545,806、us5,569,825、us5,625,126、us5,633,425、us5,661,016、us5,770,429、ep0438474b1和ep0463151b1中的一般术语所述。可以使用本领域已知的任何合适的方法确定由本发明提供的抗体结合的残基，例如氢-氘交换、定点诱变、质谱、nmr和x射线晶体学。参见例如wo2007/149032中描述的方法。如果需要，可以将用于本发明的抗体与一种或多种效应分子缀合。应当理解，效应分子可以包括单个效应分子或两个或更多个这种分子，例如连接形成可以连接到本发明的抗体的单个部分。当需要获得连接到效应分子的抗体片段时，这可以通过标准化学或重组dna程序制备，其中抗体片段直接或通过偶联剂连接到效应分子。用于将这种效应分子与抗体缀合的技术是本领域熟知的(参见，hellstrom等人,《受控的药物递送(controlleddrugdelivery)》,第2版,robinson等人编辑,1987,第623-53页；thorpe等人,1982,《免疫学评论(immunol.rev.)》,62:119-58和dubowchik等人,1999,《药理学与治疗法(pharmacologyandtherapeutics)》,83,67-123)。具体的化学方法包含，例如，wo93/06231、wo92/22583、wo89/00195、wo89/01476和wo03031581中描述的那些。替代性地，在效应分子是蛋白质或多肽的情况下，可以使用重组dna程序实现连接，例如如wo86/01533和ep0392745中所述。如本文所用，术语效应分子包含例如抗肿瘤药、药物、毒素、生物活性蛋白质，例如酶、其它抗体或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸和其片段，例如dna、rna和其片段、放射性核素，特别是放射性碘标志物、放射性同位素、螯合金属、纳米颗粒和报告基团，如荧光化合物或可以通过nmr或esr光谱法检测到的化合物。效应分子的实例可以包含细胞毒素或细胞毒性剂，包含对细胞有害(例如杀死)的任何试剂。实例包含康柏斯塔汀(combrestatins)、海兔毒素、埃博霉素、星形孢菌素、美登木素生物碱、斯邦斯塔汀(spongistatins)、根霉素、哈立长德斯(halichondrins)、罗瑞汀斯(roridins)、海木阿斯特啉(hemiasterlins)、紫杉酚、细胞松弛素b、短杆菌肽d、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素d、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。效应分子还包含但不限于抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶十嗪)、烷化剂(例如，二氯甲基二乙胺、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(bsnu)和洛莫司汀(ccnu)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素c和顺-二氯二胺铂(ii)(ddp)顺铂)、蒽环霉素(例如柔红霉素(原柔红霉素)和多柔比星)、抗生素(例如放线菌素(原放线菌素)、博来霉素、光霉素、安定霉素(amc)、卡奇霉素或卡霉素)和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。其它效应分子可以包含螯合放射性核素，如111in和90y、lu177、bismuth213、californium252、iridium192和tungsten188/rhenium188；或药物，如但不限于烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶i抑制剂、紫杉烷和苏拉明。其它效应分子包含蛋白质、肽和酶。所关注的酶包含但不限于蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、异构酶、转移酶。所关注的蛋白质、多肽和肽包含但不限于免疫球蛋白、毒素，如相思豆毒素、蓖麻毒素a链、假单胞菌外毒素或白喉毒素、蛋白质，如胰岛素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生的生长因子或组织纤溶酶原激活物、血栓形成剂或抗血管生成剂，例如血管抑制素或内皮抑素或生物应答调节剂，如淋巴因子、白细胞介素-1(il-1)、白细胞介素-2(il-2)、白细胞介素-6(il-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、神经生长因子(ngf)或其它生长因子)和免疫球蛋白。其它效应分子可以包含可用于例如诊断的可检测物质。可检测物质的实例包含各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性核素、正电子发射金属(用于正电子发射断层扫描)和非放射性顺磁金属离子。一般参见美国专利号4,741,900的金属离子，其可以与抗体缀合以用作诊断剂。合适的酶包含辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基包含链霉亲和素、抗生物素蛋白和生物素；合适的荧光材料包含伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白；合适的发光材料包含鲁米诺；合适的生物发光材料包含荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白；以及合适的放射性核素包含125i、131i、111in和99tc。在另一个实例中，效应分子可以增加体内抗体的半衰期和/或降低抗体的免疫原性和/或增强抗体跨上皮屏障到免疫系统的递送。这类合适的效应分子的实例包含聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物，如wo05/117984中所描述的那些。在效应分子是聚合物的情况下，其通常可以是合成的或天然存在的聚合物，例如任选地被取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧化烯聚合物或支链或非支链多糖，例如同源多糖或杂源多糖。可以存在于上述合成聚合物上的具体任选取代基包含一个或多个羟基、甲基或甲氧基。合成聚合物的具体实例包含任选地被取代的直链或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其是任选地被取代的聚(乙二醇)，如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。具体的天然存在的聚合物包含乳糖、直链淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。如本文所用，“衍生物”旨在包含反应性衍生物，例如硫醇选择性反应性基团，如马来酰亚胺等。反应性基团可以直接连接或通过接头链段连接到聚合物。应当了解，这种基团的残基在一些情况下会形成产物的一部分作为抗体片段与聚合物之间的连接基团。聚合物的大小可以根据需要变化，但通常处于500da到50000da的平均分子量范围内，优选地5000到40000da，并且更优选地20000到40000da。特别地，聚合物大小可以基于产物的预期用途选择，例如定位于某些组织如肿瘤或延长循环半衰期的能力(参见chapman,2002,《先进药物输送评论(advanceddrugdeliveryreviews)》,54,531-545)。因此，例如，当产物旨在离开循环并穿透组织时，例如用于治疗肿瘤，使用小分子量聚合物，例如分子量是约5000da可能是有利的。对于产物保持在循环中的应用，使用较高分子量的聚合物，例如分子量处于20000da到40000da范围内可能是有利的。特别优选的聚合物包含聚亚烷基聚合物，如聚(乙二醇)或特别是甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，并且特别是分子量处于约15000da到约40000da范围内。在一个实例中，用于本发明的抗体与聚(乙二醇)(peg)部分连接。在一个特定实例中，抗体是抗体片段，并且peg分子可以通过位于抗体片段中的任何可用的氨基酸侧链或末端氨基酸官能团连接，例如任何游离氨基、亚氨基、硫醇基、羟基或羧基。这种氨基酸可以天然存在于抗体片段中，或者可以使用重组dna方法工程化到片段中(参见例如us5,219,996；us5,667,425；wo98/25971)。在一个实例中，本发明的抗体分子是经过修饰的fab片段，其中修饰是在其重链的c末端添加一个或多个氨基酸以允许连接效应分子。优选地，另外的氨基酸形成含有一个或多个可以连接到效应分子的半胱氨酸残基的修饰铰链区域。多个位点可以用于连接两个或更多个peg分子。优选地，peg分子通过定位在抗体片段中的至少一个半胱氨酸残基的硫醇基共价连接。连接到修饰抗体片段的每个聚合物分子可以与定位在片段中的半胱氨酸残基的硫原子共价连接。共价键通常是二硫键或特别是硫-碳键。当硫醇基用作连接点时，可以使用适当活化的效应分子，例如硫醇选择性衍生物如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。活化聚合物可以用作制备如上所述的聚合物修饰的抗体片段中的起始材料。活化聚合物可以是任何含有硫醇反应性基团的聚合物，如α卤代羧酸或酯，例如碘乙酰胺、酰亚胺，例如马来酰亚胺、乙烯基砜或二硫化物。这种起始材料可以从商业上获得(例如来自nektar，前美国亚拉巴马州亨茨维尔的海鸥聚合物有限公司(shearwaterpolymersinc.))，或者可以使用常规的化学程序由市售起始材料制备。特定peg分子包含20k甲氧基-peg-胺(可自nektar，前海鸥；rapppolymere；和sunbio获得)和m-peg-spa(可自nektar，前海鸥获得)。在一个实施例中，抗体是经过peg化的经过修饰的fab片段，即具有与其共价连接的peg(聚(乙二醇))，例如根据ep0948544[也参见“聚(乙二醇)化学、生物技术和生物医学应用(poly(ethyleneglycol)chemistry，biotechnicalandbiomedicalapplications)”，1992，j.miltonharris(ed)，plenumpress，纽约，“聚(乙二醇)化学和生物应用(poly(ethyleneglycol)chemistryandbiologicalapplications)”，1997，j.miltonharris和s.zalipsky(eds)，美国化学学会，华盛顿dc和“生物医学科学的生物共轭蛋白质偶联技术(bioconjugationproteincouplingtechniquesforthebiomedicalsciences)”，1998，m.aslam和a.dent，grove出版社，纽约；chapman,a.2002,《先进药物输送评论(advanceddrugdeliveryreviews)》2002,54:531-545]中公开的方法。在一个实例中，peg连接到铰链区域中的半胱氨酸。在一个实例中，peg修饰的fab片段具有共价连接到修饰铰链区域中的单个硫醇基的马来酰亚胺基团。赖氨酸残基可以共价连接到马来酰亚胺基团，并且赖氨酸残基上的胺基团中的每一个可以连接到分子量是约20,000da的甲氧基聚(乙二醇)聚合物。因此，连接到fab片段的peg的总分子量可以是约40,000da。在一个实施例中，本发明的中和抗体分子是在其重链的c末端处具有修饰的铰链区域的修饰的fab片段，所述铰链区域含有至少一个连接到效应分子的半胱氨酸残基。优选地，效应分子是peg并且使用(wo98/25971和wo2004072116)中描述的方法连接，由此赖氨酰-马来酰亚胺基团连接到重链的c末端处的半胱氨酸残基，并且赖氨酰残基中的每个氨基基团已经与其共价连接到分子量为约20,000da的甲氧基聚(乙二醇)残基。因此，连接到抗体的peg的总分子量是约40,000da。在另一个实例中，可以使用国际专利申请wo2005/003169、wo2005/003170和wo2005/003171中描述的方法将效应分子连接到抗体片段。本发明还提供了编码本发明的抗体分子的重链和/或一个或多个轻链的分离的dna序列。优选地，dna序列编码本发明的抗体分子的重链或轻链。本发明的dna序列可以包括合成dna，例如通过化学处理、cdna、基因组dna或其任何组合产生。编码本发明抗体分子的dna序列可以通过本领域技术人员熟知的方法获得。例如，编码部分或全部抗体重链和轻链的dna序列可以根据需要从确定的dna序列或基于对应的氨基酸序列合成。编码受体框架序列的dna对于本领域技术人员来说是广泛可用的，并且可以基于它们已知的氨基酸序列容易地合成。分子生物学的标准技术可以用于制备编码本发明的抗体分子的dna序列。可以使用寡核苷酸合成技术完全或部分合成所需的dna序列。可以适当地使用定点诱变和聚合酶链反应(pcr)技术。本发明还涉及包括本发明的一种或多种dna序列的克隆或表达载体。因此，提供了包括一种或多种编码本发明抗体的dna序列的克隆或表达载体。优选地，克隆或表达载体包括两个dna序列，分别编码本发明的抗体分子的轻链和重链。可以构建载体的一般方法、转染方法和培养方法是本领域的技术人员公知的。在这方面，参考“《当代分子生物学实验手册(currentprotocolsinmolecularbiology)》”，1999，f.m.ausubel(编辑)，wileyinterscience，newyork和maniatismanual，由coldspringharborpublishing生产。还提供了包括一种或多种克隆或表达载体的宿主细胞，所述载体包括编码本发明的抗体的一种或多种dna序列。任何合适的宿主细胞/载体系统可以用于表达编码本发明的抗体分子的dna序列。可以使用细菌，例如大肠杆菌和其它微生物系统，或也可以使用真核生物例如哺乳动物宿主细胞表达系统。合适的哺乳动物宿主细胞包含cho、骨髓瘤细胞或杂交瘤细胞。本发明还提供了一种用于产生根据本发明的抗体分子的方法，所述方法包括在适于引起表达来自编码本发明的抗体分子并分离抗体分子的dna的蛋白质的条件下培养含有本发明的载体的宿主细胞。抗体分子可以仅包括重链或轻链多肽，在这种情况下，仅需要使用重链或轻链多肽编码的序列以转染宿主细胞。为了产生包括重链和轻链两者的产物，细胞系可以用两种载体转染，第一种载体编码轻链多肽，并且第二种载体编码重链多肽。替代性地，可以使用单一载体，载体包含编码轻链和重链多肽的序列。由于本发明的抗体可用于治疗和/或预防病理状况，本发明还提供了药物或诊断组合物，其包括本发明的抗体分子与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂中的一种或多种的组合。因此，提供了根据本发明的抗体用于制备药物的用途。组合物通常作为无菌药物组合物的一部分供应，所述无菌药物组合物通常包含药学上可接受的载剂。本发明的药物组合物可以额外包括药学上可接受的佐剂。本发明还提供了制备药物或诊断组合物的方法，所述方法包括将本发明的抗体分子与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂中的一种或多种一起加入和混合。抗体分子可以是药物或诊断组合物中的唯一活性成分或可以通过其它活性成分，包含其他抗体成分，例如抗tnf、抗il-1β、抗t细胞、抗ifnγ或抗lps抗体或非抗体成分，如黄嘌呤陪同。药物组合物优选地包括治疗有效量的本发明抗体。如本文所用，术语“治疗有效量”是指治疗、改善或预防靶向疾病或病状，或表现出可检测的治疗或预防效果所需的治疗剂的量。对于任何抗体，最初可以在细胞培养测定中或在动物模型中估计治疗有效量，通常在啮齿动物、兔、狗、猪或灵长类动物中。动物模型也可以用于确定合适的浓度范围和施用途径。然后，这种信息可以用于确定人体施用的有用剂量和途径。对人类受试者的精确治疗有效量将取决于疾病状态的严重程度、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、体重和性别、饮食、施用的时间和频率、一种或多种药物组合、反应敏感性和对治疗的耐受性/反应。此量可以通过常规实验确定，并且在临床医生的判断范围内。通常，治疗有效量为0.01mg/kg到50mg/kg、优选地0.1mg/kg到20mg/kg。药物组合物可以方便地以每剂量含有预定量的本发明活性剂的单位剂型存在。组合物可以单独施用于患者，或者可以与其它药剂、药物或激素组合(例如同时、依次或分开)施用。施用本发明抗体分子的剂量取决于待治疗病状的性质、存在的炎症程度以及抗体分子是否预防性使用或治疗现有病状。剂量的频率取决于抗体分子的半衰期和其作用的持续时间。如果抗体分子具有短的半衰期(例如2小时到10小时)，则可能需要每天给予一次或多次剂量。替代性地，如果抗体分子具有长的半衰期(例如2天到15天)，则可能仅需要每天给药一次、每周一次或甚至每1个或2个月给药一次。药学上可接受的载剂本身不应诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体，并且不应该是有毒的。合适的载剂可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和无活性病毒颗粒。可以使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。治疗组合物中的药学上可接受的载剂可以额外含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，在这种组合物中可以存在辅助物质，如润湿剂或乳化剂或ph缓冲物质。这种载剂使药物组合物能够配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液和悬浮液，供患者摄取。优选的施用形式包含适于胃肠外施用的形式，例如通过注射或输注，例如通过推注或连续输注。当产品用于注射或输注时，其可以在油性或水性媒剂中采取悬浮液、溶液或乳液的形式，并且其可以含有配制剂，如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。替代性地，抗体分子可以呈干燥形式，用于在使用之前用合适的无菌液体复原，例如注射用水、盐水、葡萄糖或类似物。一旦配制，本发明的组合物可以直接施用于受试者。待治疗的受试者可以是动物。然而，优选组合物适于施用于人受试者。因此，在一个实施例中，患者是人。本发明的药物组合物可以通过许多途径施用，包含但不限于口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、经皮(例如，参见wo98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径。皮下注射器也可以用于施用本发明的药物组合物。通常，治疗组合物可以制备成注射剂，作为液体溶液或悬浮液。也可以制备适于在注射之前溶解或悬浮在液体媒剂中的固体形式。组合物的直接递送通常通过注射、皮下、腹膜内、静脉内或肌内或递送到组织的间隙完成。组合物也可以施用于病变中。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。应当理解，组合物中的活性成分是抗体分子。因此，它将易于在胃肠道中降解。因此，如果组合物通过使用胃肠道的途径施用，则组合物将需要含有保护抗体免于降解但在抗体已经从胃肠道吸收后释放抗体的试剂。可在《雷明顿氏药物科学(remington'spharmaceuticalsciences)》(马克出版公司(mackpublishingcompany)，n.j.1991)中得到药学上可接受的载剂的透彻讨论。还设想通过使用基因疗法施用本发明的抗体。为了实现这一点，将编码在适当dna组分控制下的抗体分子的重链和轻链的dna序列引入患者内，使得抗体链从dna序列表达并原位组装。本发明还提供了用于控制炎症性疾病的抗体或其结合片段。优选地，抗体分子可以用于减少炎症过程或预防炎症过程。炎症过程包含慢性炎症性病状，其中病状与任何与不适当的炎症相关联的病状相关联。这种病状包含但不限于类风湿性关节炎(ra)、自身免疫性病状、炎症性肠病(包含克罗恩病和溃疡性结肠炎)、非愈合性伤口、多发性硬化症、癌症、动脉粥样硬化、斯耶格伦氏病、糖尿病、红斑狼疮(包含系统性红斑狼疮)、哮喘、纤维化疾病(包含肝硬化)、肺纤维化、uv损伤、牛皮癣、强直性脊柱炎、心血管疾病、阿尔茨海默病和帕金森病。在本说明书的上下文中，“包括”应解释为“包含”。包括某些特征/元件的本发明的实施例还旨在扩展到“由相关元件/特征组成”或“基本上由相关元件/特征组成”的替代性实施例。在技术上适当时，可以组合本发明的实施例。如专利和申请等技术参考文献通过引用并入本文。本文具体和明确地叙述的任何实施例可以单独或与一个或多个另外的实施例组合形成免责声明的基础。仅通过以下实例中的说明进一步描述本发明。附图说明图1是示出以1:1的优化摩尔比形成fab'-生腱蛋白复合物的色谱图。图2a是示出fab'-生腱蛋白复合物成功形成的色谱图。图2b和c是蛋白质印迹的照片，示出证实fab'-生腱蛋白复合物具有正确大小的sds-page分析结果。图3示出fab'-生腱蛋白复合物a)在白光下b)在uv光下拍摄的晶体的图像。图4是使用最终优化的方法条件产生的fab'-生腱蛋白复合物的单孔衍射晶体的图像。图5是fab'-生腱蛋白复合物的计算机模型的图像。图6是示出fab'-生腱蛋白复合物和生腱蛋白c复合物上的所关注残基的图像。a)示出所有所关注残基的概述。b)残基2096到2102c)残基2130到2135d)残基2170到2193图7示出了fab'-生腱蛋白复合物的计算机模型。a)复合物的表面表示b)生腱蛋白上的所关注残基c)和d)对fab’与生腱蛋白c之间的相互作用点的特写。图8示出了fab'-生腱蛋白复合物的计算机模型。示出了fab'上的所关注残基(生腱蛋白构建体的内)。序列seqidno:1生腱蛋白c氨基酸序列uniprotidno:p24821seqidno:2c3抗体的fab'重链氨基酸序列seqidno:3c3抗体的fab'轻链氨基酸序列seqidno:4seqidno的fab'vh：2cdr1氨基酸序列(此序列也是抗体b12中的cdrh1)seqidno:5seqidno的fab'vh：2cdr2氨基酸序列(此序列也是抗体b12中的cdrh2)seqidno:6seqidno的fab'vh：2cdr3氨基酸序列seqidno:7seqidno的fab'vl：3cdr1氨基酸序列(此序列也是抗体2a5、抗体b12、抗体d8的cdrl1)seqidno:8seqidno的fab'vl：3cdr2氨基酸序列(此序列也是抗体b12和抗体d8的cdrl2)seqidno:9seqidno的fab'vl：3cdr3氨基酸序列seqidno:10生腱蛋白c构建体氨基酸序列(在本文中也称为tnc片段)seqidno:11来自抗体2a5的cdrh1seqidno:12来自抗体2a5的cdrh2seqidno:13来自抗体2a5的cdrh3seqidno:14抗体2a5的vh结构域seqidno:15抗体a4的cdrh3seqidno:16来自抗体2a5的cdrl2seqidno:17来自抗体2a5的cdrl3seqidno:18抗体2a5的vl结构域seqidno:19抗体2a5的替代性vl结构域seqidno:20抗体a4的vh结构域seqidno:21抗体b3的cdrh3seqidno:22抗体b12的cdrl3。seqidno:23抗体b12的vh结构域seqidno:24抗体b3的vh结构域seqidno:25抗体b12的vl结构域seqidno:26抗体b12的替代性vl结构域seqidno:27抗体d8的cdrh1seqidno:28抗体d8的cdrh2seqidno:29抗体d8的cdrh3seqidno:30抗体d8的vh结构域seqidno:31抗体d8的cdrl3seqidno:32抗体d8的vl结构域seqidno:33抗体d8的替代性vl结构域seqidno:34抗体f3的cdrh1seqidno:35抗体f3的cdrh2seqidno:36抗体f3的cdrh3seqidno:37抗体f3的vh结构域seqidno:38抗体f3的cdrl1seqidno:39抗体f3的cdrl2seqidno:40抗体f3的cdrl3seqidno:41抗体f3的vl结构域seqidno:42抗体f3的替代性vl结构域seqidno:43抗体b1的cdrh3seqidno:44抗体b1的vh结构域seqidno:45抗体e1的cdrh3seqidno:46抗体b6的cdrh3seqidno:47抗体b6的vh结构域seqidno:48抗体e1的vh结构域seqidno:49抗体d1的cdrh3seqidno:50抗体d1的vh结构域seqidno:51抗体f5的cdrh3seqidno:52抗体c3的vh结构域seqidno:53抗体d4的cdrh3seqidno:54抗体d4的vh结构域seqidno:55抗体f5的vh结构域seqidno:56抗体e3的cdrh3seqidno:57抗体e3的vh结构域seqidno:58抗体d6的cdrh3seqidno:59抗体d6的vh结构域seqidno:60抗体h4的cdrh3seqidno:61抗体h4的vh结构域seqidno:62抗体a4的cdrh3seqidno:63抗体a4的vh结构域seqidno:64抗体f1的cdrh3seqidno:65抗体f1的vh结构域seqidno:66抗体g2的cdrh3seqidno:67抗体g2的vh结构域seqidno:68抗体f6的cdrh3seqidno:69f6的vh结构域seqidno:70抗体a12的cdrh3seqidno:71抗体a12的vh结构域seqidno:72抗体c09的cdrh3seqidno:73抗体c09的vh结构域seqidno:74抗体h10的cdrh3seqidno:75抗体h10的vh结构域seqidno:76抗体c11的cdrh3seqidno:77抗体c11的vh结构域seqidno:78抗体d3的cdrh3seqidno:79抗体d3的vh结构域seqidno:80抗体c6的cdrl3seqidno:81抗体c6的vl结构域seqidno:82抗体c6的替代性vl结构域seqidno:83抗体h5的cdrl3seqidno:84抗体h5的vl结构域seqidno:85抗体h5的替代性vl结构域seqidno:86抗体f3的cdrl3seqidno:87抗体f3的vl结构域seqidno:88抗体f3的替代性vl结构域seqidno:89抗体c1的cdrl3seqidno:90抗体c1的vl结构域seqidno:91抗体c1的替代性vl结构域seqidno:92抗体c2的cdrl3seqidno:93抗体c2的vl结构域seqidno:94抗体c2的替代性vl结构域seqidno:95抗体f4的cdrl3seqidno:96抗体f4的vl结构域seqidno:97抗体f4的替代性vl结构域seqidno:98抗体c3的cdrl3seqidno:99抗体c3的vl结构域seqidno:100抗体c3的替代性vl结构域seqidno:101抗体e11的cdrl3seqidno:102抗体e11的替代性cdrl3seqidno:103抗体e11的vl结构域seqidno:104抗体e11的替代性vl结构域seqidno:105抗体a12的替代性cdrl3seqidno:106抗体a12的vl结构域seqidno:107抗体a12的替代性vl结构域seqidno:108抗体d11的替代性cdrl3seqidno:109抗体d11的vl结构域seqidno:110抗体d11的替代性vl结构域seqidno:111抗体c3与铰链变形例的igg4形式，如angal1993中所述seqidno:112人生腱蛋白cfbg结构域seqidno:113鼠生腱蛋白cfbg结构域seqidno:114大鼠生腱蛋白cfbg结构域seqidno:115犬生腱蛋白cfbg结构域seqidno:116人生腱蛋白rfbg结构域seqidno:117种系化vh框架的氨基酸序列(抗体2a5)seqidno:118种系化vl框架的氨基酸序列(抗体2a5)seqidno:119种系化vl框架的氨基酸序列(抗体2a5)seqidno:120对于2a5和2a5抗体系列的替代性cdrl2seqidno:121种系化vh框架的序列(抗体b12)seqidno:122对于b12和b12抗体系列的替代性cdrh2seqidno:123种系化vl框架的氨基酸序列(抗体b12)seqidno:124种系化vl框架的氨基酸序列(抗体b12)seqidno:125对于b12、d8和b12抗体系列的替代性cdrl2seqidno:126种系化vh框架的氨基酸序列(抗体d8)seqidno:127种系化vl框架的氨基酸序列(抗体d8)seqidno:128种系化vl框架的氨基酸序列(抗体d8)seqidno:129种系化vh框架的氨基酸序列(抗体f3)seqidno:130种系化vl框架的氨基酸序列(抗体f3)seqidno:131种系化vl框架的氨基酸序列(抗体f3)seqidno:132-134生腱蛋白c的片段seqidno:135-148引物序列使用imgt/domaingapalign确定最接近的种系匹配：ehrenmannf.，kaasq.和lefrancm.p.《核酸研究(nucleicacidsres)》,38,d301-307(2010)抗体d8：cdrh1是seqidno:27，cdrh2是seqidno:28，cdrh3是seqidno:29。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:8，cdrl3是seqidno:31。vh是seqidno:30并且vl是seqidno:32或33。抗体f3'：cdrh1是seqidno:34，cdrh2是seqidno:35，cdrh3是seqidno:36。cdrl1是seqidno:38，cdrl2是seqidno:39，cdrl3是seqidno:40。vh是seqidno:37并且vl是seqidno:41或42。b12抗体系列抗体b12cdrh1是seqidno:4，cdrh2是seqidno:5，cdrh3是seqidno:22。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:8，cdrl3是seqidno:24。vh是seqidno:23并且vl是seqidno:25或26。抗体b1cdrh1是seqidno:4，cdrh2是seqidno:5，cdrh3是seqidno:43。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:8，cdrl3是seqidno:9。vh是seqidno:44并且vl是seqidno:25或26。抗体b6cdrh1是seqidno:4，cdrh2是seqidno:5，cdrh3是seqidno:46。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:8，cdrl3是seqidno:9。vh是seqidno:47并且vl是seqidno:25或26。抗体d1cdrh1是seqidno:4，cdrh2是seqidno:5，cdrh3是seqidno:49。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:8，cdrl3是seqidno:9。vh是seqidno:50并且vl是seqidno:25或26。抗体c3cdrh1是seqidno:4，cdrh2是seqidno:5，cdrh3是seqidno:6。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:8，cdrl3是seqidno:9。vh是seqidno:52并且vl是seqidno:25或26。抗体d4cdrh1是seqidno:4，cdrh2是seqidno:5，cdrh3是seqidno:53。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:8，cdrl3是seqidno:9。vh是seqidno:54并且vl是seqidno:25或26。抗体a4cdrh1是seqidno:4，cdrh2是seqidno:5，cdrh3是seqidno:15。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:8，cdrl3是seqidno:9。vh是seqidno:20并且vl是seqidno:25或26。抗体b3cdrh1是seqidno:4，cdrh2是seqidno:5，cdrh3是seqidno:21。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:8，cdrl3是seqidno:9。vh是seqidno:24并且vl是seqidno:25或26。抗体e1cdrh1是seqidno:4，cdrh2是seqidno:5，cdrh3是seqidno:45。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:8，cdrl3是seqidno:9。vh是seqidno:24并且vl是seqidno:25或26。抗体f5cdrh1是seqidno:4，cdrh2是seqidno:5，cdrh3是seqidno:51。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:8，cdrl3是seqidno:9。vh是seqidno:55并且vl是seqidno:25或26。2a5抗体系列抗体2a5cdrh1是seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:13。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。vh是seqidno:14并且vl是seqidno:18或19。抗体e3cdrh1是seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:56。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。vh是seqidno:57并且vl是seqidno:18或19。抗体d6cdrh1是seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:58。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。vh是seqidno:59并且vl是seqidno:18或19。抗体h4cdrh1是seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:60。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。vh是seqidno:61并且vl是seqidno:18或19。抗体a4cdrh1是seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:62。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。vh是seqidno:63并且vl是seqidno:18或19。抗体f1cdrh1是seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:64。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。vh是seqidno:65并且vl是seqidno:18或19。抗体g2cdrh1是seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:66。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。vh是seqidno:67并且vl是seqidno:18或19。抗体f6cdrh1是seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:68。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。vh是seqidno:69并且vl是seqidno:18或19。抗体a12cdrh1是seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:70。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。vh是seqidno:71并且vl是seqidno:18或19。抗体c09cdrh1是seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:72。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。vh是seqidno:73并且vl是seqidno:18或19。抗体h10cdrh1是seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:74。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。vh是seqidno:75并且vl是seqidno:18或19。抗体c11cdrh1是seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:76。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。vh是seqidno:77并且vl是seqidno:18或19。抗体d3cdrh1是seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:78。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:17。vh是seqidno:79并且vl是seqidno:18或19。抗体c6cdrh1是seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:13。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:80。vh是seqidno:14并且vl是seqidno:81或82。抗体h5cdrh1是seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:13。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:83。vh是seqidno:14并且vl是seqidno:84或85。抗体f3cdrh1是seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:13。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:86。vh是seqidno:14并且vl是seqidno:87或88。抗体c1cdrh1是seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:13。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:89。vh是seqidno:14并且vl是seqidno:90或91。抗体c2cdrh1是seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:13。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:92。vh是seqidno:14并且vl是seqidno:93或94。抗体f4cdrh1是seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:13。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:95。vh是seqidno:14并且vl是seqidno:96或97。抗体c3cdrh1是seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:13。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:98。vh是seqidno:14并且vl是seqidno:99或100。抗体e11cdrh1是seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:13。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:101或102。vh是seqidno:14并且vl是seqidno:103或104。抗体a12cdrh1是seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:13。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:105。vh是seqidno:14并且vl是seqidno:106或107。抗体d11cdrh1是seqidno:11，cdrh2是seqidno:12，cdrh3是seqidno:13。cdrl1是seqidno:7，cdrl2是seqidno:16，cdrl3是seqidno:108。vh是seqidno:14并且vl是seqidno:109或110。实例实例1-纯化生腱蛋白cfbg作为抗原和测定试剂的生成生成含有生腱蛋白c的fbg结构域(tncfbg)的纯化可溶性蛋白质以用作抗体选择中的抗原并且用作随后筛选和表征测定中的试剂。为了使分离结合多种哺乳动物物种的生腱蛋白c的抗体的选择策略成为可能，合成了一系列dna表达构建体，其掺入了人、小鼠、大鼠或狗的tncfbg结构域。还制备了人生腱蛋白rfbg构建体以用于识别显示出不希望结合到此同源物的抗体。如下所述，构建体产生为6his标记的蛋白质，并且大鼠cd4或人igg1fc标记偶联到c末端或n-末端fbg结构域。蛋白质表达构建体合成用于抗原表达的所有合成dna构建体并且通过斯瑞(genscript)(美国皮斯卡塔韦(piscataway,usa))确认序列。将fbg结构域克隆到哺乳动物表达载体pbiocam4或biocam5中，其将表达的结构域分别与大鼠cd4(结构域3和4)标记(chapple等人,2006)或人igg1fc标记(falk等人,2012)融合。载体由含有衍生自小鼠vh链的内质网(er)信号序列的pcmv/myc/er质粒(invitrogen)(falk等人,2012)经过修饰得到以用于分泌表达的蛋白质。对于产生n-末端fbg(例如fbg-fc-his或fbg-rcd4-his)的所有构建体，将消化的pcr产物与ncoi/noti酶切的pbiocam4或pbiocam5载体连接。对于产生c末端fbg(例如fc-his-fbg或rcd4-his-fbg)的所有构建体，将消化的pcr产物与bamhi/hindiii酶切的pbiocam4或pbiocam5载体连接。用于扩增fbg结构域的引物列于图10中。所有构建体均经过序列确认。为了促进elisa筛选，将编码his标记的插入物(引物2574和2575)克隆到bamhi与hindiii位点之间(替换his-flag标记)以用于具有fbg-x(n末端fbg)融合体的表达质粒。通过用bstxi和bamhi消化直接由genscriptpuc57质粒克隆全长生腱蛋白c，并克隆到bstxi/bamhi酶切表达载体pfbg-fc-his6中。为了产生his-fbg构建体，由rcd4-his-fbg表达质粒将引物设计成pcr，并将编码his-fbg的pcr产物用xhoi和hindiii消化并克隆到xhoi/hindiii消化的pbiocam5中。蛋白质表达和细胞培养使用macherynagelnucleobondxtramidi试剂盒(740410.50，英国飞世尔科技(fisherscientific))制备转染质量质粒dna。用于抗原和抗体表达的hek293f悬浮细胞和freestyle培养基以及rpmi培养基来自生命科技(lifetechnologies)(英国佩斯利)。如前所述(chapple等人,2006)进行hek293f细胞的转染。蛋白质纯化和qc蛋白质亲和纯化采用ni-nta琼脂糖或固定化重组蛋白a树脂。为了纯化his-标记的蛋白质，将培养物上清液与ni-nta琼脂糖(1018240，英国克劳利的凯杰(qiagen))混合1小时，并将树脂转移到proteus1步midi旋转柱(英国健能隆(generon,uk))以进行离心(200xg，2分钟)。用补充有20mm咪唑(ph8)的磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗去未结合的蛋白质。通过添加pbs(ph8)中的300mm咪唑和柱离心(200xg，2分钟)将结合的蛋白质分级洗脱。将含有洗脱蛋白质的合并级分置于gebaflexmidi透析管(健能隆d010；分子量截取值3.5kda)中并对pbs透析。使用蛋白质a琼脂糖(pc-a25，英国梅登黑德的健能隆)纯化fc标记的蛋白质和表达为人igg4的抗体。通过离心(2500xg，15分钟)澄清培养物上清液，并在4℃下与蛋白质a琼脂糖混合过夜，随后将树脂转移到proteus1步midi旋转柱(英国的健能隆)上。将柱离心(200xg，2分钟)并用pbs洗涤以去除未结合的蛋白质。通过离心(200xg，2分钟)将fc-标记的或igg4蛋白质从具有0.2m甘氨酸(ph2.8)的蛋白质a分级洗脱成tris-hcl(ph8)。合并洗脱的级分并在gebaflexmaxi透析管(健能隆d045；分子量截取值8kda)中对pbs透析。通过sds-page(4％到12％凝胶)和分光光度法(使用理论消光系数的od280)分析蛋白质的纯度和浓度。当纯化蛋白质用于基于细胞的测定时，首先通过鲎变形细胞裂解物显色内毒素测定法(pierce)确定内毒素含量。如果内毒素水平超过每毫克1内毒素单位(即1eu/mg)，则不使用蛋白质。实例2-一级抗fbg抗体的分离抗体噬菌体展示使用iontasltd专有的人抗体噬菌体展示文库分离抗生腱蛋白cffg结构域的抗体，所述文库使用从43种人淋巴细胞供体分离的dna构建。如前所述(schofield等人,2007)使用本领域中众所周知的技术进行选择、噬菌体提取和亚克隆到psang10(martin等人,2006)中。在融合配偶体的n末端(例如fbg-fc、fbg-rcd4)或c末端(fc-fbg、rcd4-fbg)处与人igg1fc或rcd4融合的固定化tncfbg上进行两轮淘选选择。分别淘选含有kappa(κ)或lambda(λ)可变轻链(vl)的噬菌体抗体文库以便于后续亚克隆到含有恒定轻链(cl)kappa(κ)或lambda(λ)的fab表达载体。由所选群体制备多克隆噬菌体群体，并使用涂布有tncfbg抗原或适当的融合配偶体(fc或rcd4)的elisa板在elisa(多克隆噬菌体elisa)中测试。与噬菌体一起温育之后，洗涤板，并使用过氧化物酶缀合的抗m13抗体检测结合的噬菌体。富集选择的第1轮与第2轮之间的抗原特异性结合物和与第2轮输出群体中的抗fc或抗rcd4噬菌体相比的更大比例的fbg结合物，这表明选择是成功的。通过elisa确认scfv结合到抗原和交叉反应性测定第2轮选择输出表达为单独的scfv克隆以确认elisa结合测定中的抗原识别。如前所述(schofield等人,2007)，将输出群体亚克隆到细菌表达载体psang10(martin等人,2006)中，转化成大肠杆菌bl21(de3)，并在96孔板中诱导单个转化体。收集大肠杆菌上清液，并使用铕标记的抗flag检测抗体、使用基于delfia的elisa测定scfv与tncfbg的结合。使用λ文库的最成功的选择是基于针对抗原rcd4-fbg和fc-fbg的淘选(选择147和148)。对于κ文库，用抗原fbg-rcd4(150)、rcd4-fbg(152)和fc-fbg(153)获得最成功的选择。选择来自此elisa筛选的79个阳性克隆以用于进一步分析。交叉反应性elisa示出67/79(85％)的抗人fbgscfv与小鼠tncfbg交叉反应。抗fbgscfv的dna序列分析表明了优异的序列多样性。例如，相应地，来自vlλ文库的选择147和148含有92％独特可变重(vh)互补确定区域3(cdr3)的序列，并且来自vlκ文库的选择150、152和153含有67％、91％和100％独特可变vhcdr3序列。通过elisa筛选从最有效选择分离的另外1425个克隆，并且这引起具有fbg结合特异性的额外401scfv的识别。选择这些克隆以及在初始elisa中识别的79scfv以用于进一步评估。在特异性elisa中进一步测试1425个克隆，其中测试每种scfv以用于结合到人生腱蛋白rfbg并且还结合到人、小鼠、大鼠和狗tncfbg。根据所获得以用于结合到生腱蛋白c的elisa信号除以生腱蛋白rfbg结合的信号，对克隆进行分级。将比率高于50的前250个克隆用于亚克隆和进一步分析。实例3-在功能测定中筛选一级抗fbg抗体将抗fbgscfv重新格式化为二价scfv-fc或重新格式化为单体fab以用于评估其作为全细胞测定系统中的fbg诱发的信号传导的抑制剂的活性。对于选择147、148、150、152和153中的每一个，通过一级elisa信号分级的前50个抗fbgscfv亚克隆到哺乳动物表达质粒pbiocam5(falk等人,2012)中作为个体选择群体并且通过hek293f细胞中的瞬时转染表达(chapple等人,2006)。对于fab表达，使用专有的iontasltd方案将合并的λ或κscfv可变重(vh)和可变轻(vl)插入物克隆到双启动子fab表达载体(pfab-dual-κ或pfab-dual-λ，根据轻链种系而定)中。在thp-1细胞测定中筛选培养物上清液的活性，并将所选择的scfv-fc和fab命中物进行亲和纯化以重新测定和确认抑制活性。thp1-bluetm报告细胞测定已经示出生腱蛋白c通过fbg结构域与细胞tlr4的相互作用引起炎症性细胞和成纤维细胞中的细胞因子的生成(midwood等人,2009)。引起炎症性细胞因子如tnfα、il-8和il-6生成的受体信号传导级联涉及转录因子nf-κb的激活。可以在经过修饰以响应nf-κb激活并生成易于测量的蛋白质信号的“报告”细胞系中研究此过程。thp1-bluetm报告细胞系(法国图卢兹的invivogen)衍生自人thp-1单核细胞系并稳定地表达nf-κb诱导的分泌型碱性磷酸酶(seap)报告构建体。这些细胞还组成型地表达细胞表面tlr4，这使得使用中等到高通量测定方法，使用培养物上清液中的比色或荧光定量seap能够容易地测量tncfbg融合蛋白的信号传导活性。低fbg浓度下的活性对任何筛选测定的成功至关重要；如果产生大量增加的报告蛋白而所需的fbg浓度太高，然后完全抑制任何这种信号所需的scfv、fc-scfv或fab构建体的表达水平和浓度对于筛选是不可接受的。在此细胞测定中，fc-fbg产生低nm水平下的稳健seap信号(cd4-fbg在此浓度范围内不产生应答)。根据供应商的方案(http://www.invivogen.com/pdf/thp1_blue_nf_kb_tds.pdf)培养thp1-bluetm细胞并在补充的rpmi培养基中传代，除了细胞在超低附着t75烧瓶中生长之外。对于测定，将thp1-bluetm细胞添加到总体积是170μl含有rpmi培养基中的fc-fbg(3nm或10nm)的96孔组织培养板(100,000个细胞/孔)。将含有表达的scfv-fc或fab的培养物上清液或pbs中的亲和纯化抗体以30μl的体积添加，并将细胞在37℃下温育18小时。采集上清液，并根据供应商的说明书，使用attophosap荧光定量系统(s1000；普洛麦格(promega))测定seap或使用duosetelisa开发系统(dy208；英国的r&dsystems)测定il-8含量。绘制数据并使用prism软件(graphpad)拟合曲线。筛选抗fbg抗体作为thp1-bluetm细胞中的fc-his-fbg诱发的信号传导的hek293f培养物上清液突出显示的假定抑制剂，其中当作为纯化scfv-fc或fab重新测定时确认9种。fc-his-fbg是进行潜能测定工作的关键。单体fbg在thp-1blue和人细胞中不引起任何细胞因子应答。实例4-一级抗fbg抗体的功能表征elisa交叉反应性测定通过elisa评估在thp1-bluetm功能测定中识别的9种人fbg信号传导抑制剂组与大鼠、小鼠和狗fbg的交叉反应性。还确定了结合到人生腱蛋白rfbg同源物。使测定孔涂布有人、大鼠、小鼠和狗tncfbg-rcd4或人tnrfbg-rcd4融合蛋白，并使用抗κ或抗λmab然后使用铕缀合的抗小鼠mab检测fab的结合。elisa结果揭露，c3抗体示出对人tncfbg的其它哺乳动物同源物的良好交叉反应性和较低的人tnrfbg的表观结合。这些是：通过表面等离子体共振确定结合亲和力通过表面等离子体共振(spr)在25℃下测量所选择的fab与人、大鼠和小鼠tncfbg以及人tnrfbg结合的亲和力和缔合和解离动力学。根据提供有人fab捕获试剂盒(通用电气(ge)，28-9583-25)的方案，使用具有cm5传感器芯片的biacoret100仪器进行实验。将不同浓度的rcd4-fbg注入具有固定化fab和参考流动池的流动池中。在参考信号减法之后，使用t100biaevaluation软件将数据拟合到球形1:1拟合。计算出的动力学常数示出在表3中。fabs对人tncfbg的亲和力等级顺序是b12(110pm)>。所有fab对啮齿动物tncfbg显示出低纳摩尔亲和力，并且对人tnrfbg的亲和力通常比人tnrfbg低60倍。抑制潜能测定使用tlr4介导的分泌的碱性磷酸酶和il-8细胞因子产生的测量结果，在thp1-bluetm测定中确定纯化fab对于中和hufc-his-fbg活性的潜能。如实例2中所述进行测定，不同之处在于将纯化fab以一定浓度范围(0.3nm到100nm)添加到测定孔以能够使用prism软件(graphpad)计算ic50值。本公开的c3抗体衍生自称为b12的抗体。通过表面等离子体共振(spr)光谱法确定的抗fbgfab结合动力学数据。kd，平衡解离常数；ka，缔合常数；kd，解离常数实例5-生成并分离针对hutncfbg结构域的优化抗体通过靶向cdr诱变进行亲和力成熟选择抗fbg抗体b12以用于亲和力成熟。通过使用kunkel诱变(fellouse和sidhu，2007；kunkel等人,1987；sidhu和weiss，2004)在具有6个氨基酸的区段中随机化vh和vlcdr3残基来进行靶向cdr诱变。由于给定克隆的vhcdr3(10个到16个残基)较长，随机化在三个重叠区段中进行，并且vlcdr3(9个残基)在两个重叠区段中进行随机化。使用nns(n＝a/g/c/t和s＝g/c)简并引物进行随机化，所述简并引物可以编码来自32个密码子组合的给定位置处的20个氨基酸中的任一个(并且仅单个琥珀终止密码子)。创建了以下文库。cdr3随机化文库的估计大小高严格性噬菌体展示选择如前所述(dyson等人,2011)进行链霉亲和素免疫磁珠上的噬菌体-抗体选择。在生物素化rcd4-his-fbg上进行多轮溶液相选择以富集亲和力改善的克隆。通过针对一系列抗原浓度进行选择并将输出数与无抗原对照物进行比较，凭经验确定每轮的最佳抗原浓度。通过减少每轮中使用的抗原量来增加选择的严格性。在选择窗口(来自选择输出的噬菌体效价与没有抗原对照物之间的倍数差异)降到10以下之后，没有进行下一轮的选择。因此，对于除由于在第3轮观察到大选择窗口而经受第四轮选择的b12之外的所有文库，对生物素化人rcd4-his-fbg进行三轮选择。在每轮选择中对所有文库进行针对链霉亲和素珠和生腱蛋白r(第1轮到第3轮100nm和第4轮1nm)的取消选择以避免与链霉亲和素或生腱蛋白r的不希望的交叉反应性。另外，仅对b12随机化文库进行混合选择策略，在所述混合选择策略中人和小鼠抗原在轮次选择之间交替。在b12文库上进行这种额外选择的原因是观察到的结合到人和小鼠rcd4-his-fbg的b12亲本抗体的亲和力的差异很大。更进一步，进行另外一轮选择以选择具有优异解离速率的抗体克隆。在解离速率选择中，允许噬菌体结合到生物素化抗原(在这种情况下为1nm)，并且随后将大量过量的非生物素化抗原(500nm)添加到反应中并温育20小时或40小时。非生物素化抗原充当竞争者并捕获与生物素化抗原分离的噬菌体抗体，即在选择结束时仅回收具有较长解离速率的抗体(hawkins等人,1992；zahnd等人,2010)。每轮选择的输出噬菌体效价与计算出的选择窗口一起示出于下表中。选择输出效价。第1轮选择。如前所述(schofield等人,2007)确定噬菌体输出效价选择输出效价。第2轮选择。如前所述(schofield等人,2007)确定噬菌体输出效价选择输出效价。第3轮选择。如前所述(schofield等人,2007)确定噬菌体输出效价elisa筛选进行抗flag捕获elisa以筛选与亲本抗体相比具有对于小鼠fbg结合的改善亲和力的克隆。如前所述(schofield等人,2007)，在具有自诱导培养基的96孔板中诱导携有scfvpsang10表达质粒的大肠杆菌克隆。采集大肠杆菌上清液以用于elisa测定。elisa使用具有铕标记的抗flag抗体(英国奥德里奇的西格玛(sigma,aldrich,uk))的delfia(解离增强的镧系元素荧光免疫测定)系统。在通过添加2％奶粉pbs(pbs-m，每孔300μl)封闭的孔中，使黑色免疫吸附板(nunc)涂布有抗flagm2抗体(西格玛，f3165，pbs中5μg/ml，每孔50μl)过夜。用pbs-t(pbs，0.1％tween-20)将板洗涤三次并用pbs洗涤三次，然后添加1:2稀释的含有在pbs-m中表达的scfv的96孔自诱导培养物上清液(每孔50μl)。将板温育1小时，如上进行洗涤，并将生物素化小鼠或人rcd4-his-fbg(在pbs-m中5μg/ml，50μl)添加到每个孔。将板再温育1小时，洗涤并添加链霉亲和素-eu(珀金埃尔默(perkinelmer)，1μg/ml，pbs-m，50μl)，温育30分钟，洗涤并添加delfia增强溶液(50μl)并在珀金埃尔默融合板读数器(激发＝320nm，发射620nm)上读取板。测定的形式如下所示。在此测定中，scfv表达水平的差异被标准化，因为自诱导培养物中scfv的表达水平使抗flag涂布的孔饱和。因此，在测定中获得的信号反映了洗涤之后结合的生物素化rcd4-his-fbg的量，这将是小鼠或人fbg的所述克隆的解离速率的函数。来自b12亚文库的选择输出的elisa筛选揭露了具有显著改善的结合到小鼠tncfbg的克隆。htrf筛选开发基于htrf的竞争测定以筛选具有改善的结合到人tncfbg的抗体变体。在4倍于所述浓度的浓度的测定缓冲液(50mmnapo4，0.1％bsa，0.4mkf，ph7.0)中制备所有的样品和试剂。随后将5μl每种试剂添加到低体积的384孔测定板(葛莱娜(greiner)，784075)，以得到20μl的最终反应体积。按照制造商的指示，使用d2标记试剂盒(cisbio，62d2dpea)标记igg抗体。如制造商所推荐，以每20μl反应1.8ng活性部分(sa)的最终浓度使用链霉亲和素铕穴合物(cisbio，610sakla，批号25c)。使用ez-linksulfo-nhs-lc-biotin试剂(赛默科技(thermoscientific)，21327)制备生物素化rcd4-his-fbg，使用生物素化荧光定量试剂盒(赛默科技，46610)定量生物素化程度。适当时，将含有scfv的上清液(如上所述制备用于elisa测定)以1/20的最终稀释度加入到384孔测定板(即在测定缓冲液中1/5稀释，然后将5μl稀释的样品加入到20μlfret测定中)。用于筛选的d2标记的b12igg的浓度是1.25nm。除非另有说明，否则生物素化rcd4-his-fbg(生物素:蛋白质比率＝1.8:1)以2.2nm(于使用2a5igg抗体的测定中)或1nm(于使用b12igg的实验中)存在。将样品在室温下温育约1小时，并使用bmgpherastar仪器确定fret信号：激发＝320nm；发射＝620nm和665nm；集成开始时间＝60μs；集成时间＝500μs；每孔100次闪烁。对于含有培养物上清液的竞争测定，在将试剂添加到测定板之前，将生物素化rcd4-his-fbg抗原与链霉亲和素铕穴合物一起预温育45分钟。所有fret信号均表示为δr，其中r＝(e665/e620×104)并且δr＝(r样品-r背景荧光)。测试含有来自亲和力选择的突变体文库的未标记scfv克隆的培养物上清液对fbg与荧光团标记的亲本igg抗体之间的相互作用的抑制。两种测定中在有用范围内显示fret信号的克隆的相对等级大致未改变，这表明其在竞争类似的表位。因此，筛选来自亲和力成熟选择的所有b12scfv变体抑制b12igg分子结合到人tncfbg的能力。将表达为与亲和力成熟的克隆平行的scfv的亲本克隆用作基准。对scfv进行测序，并分别基于在elisa和htrf测定中其结合到小鼠和人tncfbg，选择具有独特vh或vlcdr3序列的一组克隆以用于人igg4格式的进一步研究。针对具有对于人rcd4-fbg的改善亲和力的克隆的htrf筛选。抗体b12的变体示出小鼠fbg结合的≥4倍改善和htrf信号的≥91％抑制。总之，下面识别了具有独特cdr3序列的符合这些标准的31个克隆。识别与小鼠和人tncfbg的结合改善并选择为用于转化成人igg格式以用于进一步研究的克隆的重链或轻链cdr3序列。这些是结合到人和小鼠tncfbg的抗体克隆的重链或轻链序列，并且因此在本发明的方法、用途、组合物和化合物中具有潜在的用途。例如，结合具有这些cdr3序列的tnffbg的抗体可以用于识别、抑制检测和纯化tnc或tncfbg的功能。转化为igg4格式并确定结合动力学将所关注的31scfv亚克隆到人igg4表达载体中以用于生成作为具有铰链稳定突变的人igg4的抗体(s241p；angal等人,1993)。在hek-293f细胞中瞬时地表达igg4抗体，并使用表面等离子体共振光谱法筛选培养物上清液以对其结合到人和小鼠tncfbg和人tnrfbg的解离速率进行分级。简单来说，使用biacoret100仪器，并遵循根据人抗体捕获试剂盒方案(通用电气，br-1008-39)的方案进行表面等离子体共振(spr)实验。对于解离速率筛选，根据胺偶联试剂盒方案(通用电气，br-1000-50)使用edc/nhs交联化学将10,000个应答单位(ru)的抗人fcigg(通用电气，br-1008-39)固定在具有5系列cm5葡聚糖传感器芯片(br-1005-30)的流动池(fc1和fc2)上。将含有表达的igg4的培养物上清液用2×pbs-t稀释1:2并注入fc2(流速5μl/分钟，60s接触时间)中以使得能够在25℃下进行抗体捕获。抗体捕获水平的范围是308ru到1975ru，这取决于上清液中的抗体的表达水平。用流动通路通过fc1(参考流动池)和fc2(抗体捕获流动池)注射固定浓度的抗原(15nm人和小鼠tncrcd4-his-fbg和100nm人tnrrcd4-his-fbg)，并且流速是30μl/分钟，并且分别在1分钟和5分钟时间段内测量缔合相和解离相。结合表面的再生采用3mmgcl2并且接触时间是30秒。通过参考细胞减法并使用biaevaluation软件(通用电气，br-1005-97)拟合假设1:1相互作用的传感图实验数据来确定解离速率。解离速率筛选的结果总结在下表中。用于对人igg4抗fbg解离速率分级的表面等离子体共振筛选根据人和小鼠tncrcd4-his-fbg的低解离速率和人tnrrcd4-his-fbg的高解离速率对克隆进行分级。对来自每个文库的3个最高等级的抗体进行优先化以作为纯化igg4进行更详细的动力学分析。这些克隆示出于下表中。克隆vhcdr3b12亲本disavpdtfdi165_13_b1vmssmedafdi165_13_d1gtrgegdtfdi165_13_c3syqsdedafdi具有改善的fbg结合解离速率特征的b12突变体的重链cdr3氨基酸序列评估9种优先化igg4抗体的详细动力学参数。确定与人、大鼠和狗tncrcd4-his-fbg和人tnrrcd4-his-fbg的相互作用的结合特征。动力学测定基本上遵循与上述解离速率确定相同的方案，并且如下进行一些修改。为了提高动力学参数确定的准确性，将抗人fcigg以较低水平(2229ru)固定化，引起所捕获的抗fbgigg4的量对应减少。将纯化抗fbgigg4稀释到浓度为在pbs，ph7.4，0.05％tween-20中3.5nm，并以10μl/分钟的流速注入fc2中，接触时间是60秒。这通常导致平均的80ru所捕获的抗体(范围：55ru到90ru)。通过在pbs，ph7.4，0.05％tween-20(最高浓度100nm，7nm的小鼠rcd4-his-fbg除外)中倍增稀释来制备抗原。测定在37℃(30μl/分钟，120秒接触时间；小鼠rcd4-his-fbgfbg10μl/分钟，60秒接触时间)下进行，并且将流动池和注射室两者均平衡到此温度。如前所述，通过参考细胞减法并使用biaevaluation软件(通用电气，br-1005-97)拟合假设1:1相互作用的传感图实验数据来确定动力学参数。与非亲和力成熟的亲本克隆相比，所有九种抗体均显示出与小鼠tncfbg结构域的改善结合，并且抗体165_13_b1、165_13_c3和160_01_a4表现出与人tncfbg结合的亚纳摩尔kd值，并且对人tnrfbg类似物的亲和力低于>70倍：在37℃下通过表面等离子体共振确定的抗fbgigg4结合动力学数据。实例6-确定c3抗体结合的fbg-c表位生产his-tnc-fbg克隆his-tnc-fbg并在cho细胞中表达。在生产阶段结束时，将培养物离心(1000g，30分钟，15℃)。用pbsph7.4平衡5mlhistrapff(gehealthcare)。在用上清液加载柱之后，用ph7.4的pbs洗涤柱，随后在含0.5m咪唑的pbs中进行洗脱。将洗脱的蛋白质加载到hiload16/600superdex200pg上，并用20mm磷酸钠，130mmnacl运行。合并单体峰，并且将最终产物浓缩到1mg/ml，并以小等分试样形式冷冻储存。生产nsct-141克隆nsct-141产物，在cho细胞中表达。采集生产培养物，并且通过切向流过滤来浓缩澄清的上清液，随后在mabselectsure柱(gehealthcare)上进行纯化。通过加入2xpbs来中和产物，并用稀氢氧化钠溶液调节到约ph7.2，并以等分试样形式在+5℃下储存。形成c3fab'-生腱蛋白c复合物对c165_13_c3*igg4抗体进行胃蛋白酶切割以产生c3fab'抗体。在胃蛋白酶切割后，使fab'经受2-巯基乙胺-hcl(2-mea)，其为一种选择性地还原fab'中铰链区域二硫键的温和还原剂。随后进行n-乙基马来酰亚胺(nem)处理，然后与还原的半胱氨酸残基形成稳定的共价硫醚键，使它们能够被永久封闭，以防止形成进一步的二硫键。进行实验以确定生产c3fab'-生腱蛋白c复合物的最佳摩尔比。图1示出了sec分析的色谱图，其证实了复合物以1:1的优化摩尔比形成。基于试验结果，将10mghi-htnc-fbg肽(seqidno:10)与20mgc3fab'一起温育，用于大规模生产fab'-生腱蛋白复合物。使用superdex200(gehealthcarelifesciences)柱通过尺寸排阻色谱(sec)纯化复合物。使用包括25mmtrisph7.5，150mnnacl和1mmedta的缓冲液洗脱纯化的复合物。图2a示出了fab'-生腱蛋白c复合物的色谱图，表明洗脱的样品基本上是纯的。然后对样品进行sds-page(参见图2b和2c)。条带具有预期的大小。最后，将fab'-生腱蛋白c复合物浓缩到38.5mg/ml，随后将其用于结晶。fab'-生腱蛋白复合物的结晶通过x射线晶体学研究c3fab’与生腱蛋白c之间的相互作用。纤维蛋白原c末端结构域与c3fab'复合的人生腱蛋白c的结晶、结构确定和晶体结构的精修。结晶在低剖面swiss-sci3孔板中，在22℃下将人生腱蛋白c(残基1974到2201)/c3fab'复合物在座滴法液滴中通过气相针对30μl的储库溶液进行结晶，所述储库溶液含有100mmbis-trisph6.5，200mm氯化镁，20％peg6000。液滴含有100nl的蛋白质于25mmtrisph7.5，150mm氯化钠，1mmedta加80nl储库溶液和20nl晶种溶液中的11.8mg/ml(基于消光系数估计值122,000m-1cm-1和mw77.4kda)溶液，所述晶种溶液是改善晶体形态所需的。晶体属于空间群p1211，细胞尺寸并且α＝γ＝90°；β＝90.4°。两个生腱蛋白c/c3fab'复合物分子处于不对称单元中。x射线衍射收集在液氮中快速冷却之前，将晶体在20％(v/v)甘油(在储库溶液中稀释)中冷冻保护。在位于法国格勒诺布尔的欧洲同步辐射装置同步加速器的id30b光束线站的pilatus6m-f上从单晶收集x射线衍射数据。x射线束的波长为用xds处理数据并且无目的(kabsch,w.《晶体学报(actacryst.)》d66,125–132(2010)；evans,p.r.和murshudov,g.n.《晶体学报(actacryst.)》d69,1204-1214(2013))。结构确定通过分子置换使用程序phaser确定人生腱蛋白c、纤维蛋白原c末端结构域/c3fab'复合物的晶体结构(mccoy,a.j.等人,《应用结晶学杂志(j.appl.cryst.)》40,658-674(2007))。pdb条目4r9j和5i15的修饰版本用作分子置换的起始模型。使用coot、buccanner和refmac分别进行改造、重建和精修(emsley,p.等人,《晶体学报(actacryst)》d66,486-501(2010)；cowtan,k.《晶体学报(actacryst)d62,1002-1011(2006)；murshudov,g.n.等人,《晶体学报(actacryst)》d53,240-255(1997))。最终分辨率确定为生腱蛋白c/c3fab'复合物的模型涵盖生腱蛋白c的残基1975到2193(参见seqidno.，uniprot：p24821)，c3fab的轻链残基1到213(seqidno:3)和c3fab的重链残基1到219(seqidno2)。模型的r因子为0.151，并且无r为0.197。对于键长，标准几何的均方根偏差为键角为2.13°。表位生腱蛋白c(残基1974到2201)/c3fab'的结构揭示了c3fab与生腱蛋白c之间的主要接触位点，并且被识别为主要聚集在抗体的cdr环处和生腱蛋白的一个面上。根据seqidno.1中所示的编号序列，对于生腱蛋白c蛋白来说，与内c3fab’的cdr区域相互作用最密切的残基是ala2115、asn2118、ser2131、arg2147、asn2148、cys2149、his2150、arg2151、ser2164、his2171和his2175。在内与c3fab'接触的生腱蛋白c的主要残基是ala2115、tyr2116、asn2118、ser2131、tyr2140、arg2147、asn2148、cys2149、his2150、arg2151、his2163、ser2164、phe2170、his2171、his2175。在内与c3fab'接触的残基是ala2115、tyr2116、asn2118、ser2131、ile2133、tyr2140、arg2147、asn2148、cys2149、his2150、arg2151、his2163、ser2164、phe2170、his2171、his2175。这些残基的位置及其与fab'的相互作用如图7所示。这些残基限定c3抗体的表位。建模结构然后将fab'-生腱蛋白c复合物的晶体用于结构建模。结构本身通过分子置换确定。图5示出了fab'-生腱蛋白复合物的模型结构。可以看出，在不对称单元中观察到2种复合物。图6示出了所关注的生腱蛋白c的各种残基。图6a是图6b到6d的概述。残基2096到2102和2130到2135通过棒状表示以黑色突出显示。残基2071到2148和2170到2193以卡通表示的深灰色突出显示。残基2194到2201在结构内不可见，并以浅灰色示出。fab'通过表面表示示出。使用uniprotidp24821中给出的序列限定残基。这些残基也示出在seqidno:1的下面的氨基酸序列中，其中残基2096到2102和2130到2135以粗体显示，并且残基2194到2201以斜体显示。·elrvdlrdhgetafavydkfsvgdaktryklkvegysgtagdsmayhngrsfst(残基2071到2124)·rsfstfdkdtdsaitncalsykgafwyrn(残基2120到2148)·fhwkghehsiqfaemklrpsnfrnlegrrkra(残基2170-2201)类似地，识别了定位在生腱蛋白c构建体的内的fab'内的许多残基：轻链重链tyr28tyr100gln30gln101gly31glu104phe32asp105asp50ala51ser52asn53gly64ser91tyr92这些残基在fab'-生腱蛋白复合物结构上的位置如图8所示。序列表<110>纳塞恩特公司<120>生腱蛋白c表位和其抗体<130>p000198_wo<160>148<170>patentin版本3.5<210>1<211>2201<212>prt<213>人工序列<220><223>生腱蛋白c氨基酸序列<400>1metglyalametthrglnleuleualaglyvalpheleualapheleu151015alaleualathrgluglyglyvalleulyslysvalilearghislys202530argglnserglyvalasnalathrleuproglugluasnglnproval354045valpheasnhisvaltyrasnilelysleuprovalglyserglncys505560servalaspleugluseralaserglyglulysaspleualapropro65707580sergluprosergluserpheglngluhisthrvalaspglygluasn859095glnilevalphethrhisargileasnileproargargalacysgly100105110cysalaalaalaproaspvallysgluleuleuserargleugluglu115120125leugluasnleuvalserserleuarggluglncysthralaglyala130135140glycyscysleuglnproalathrglyargleuaspthrargprophe145150155160cysserglyargglyasnpheserthrgluglycysglycysvalcys165170175gluproglytrplysglyproasncyssergluproglucysprogly180185190asncyshisleuargglyargcysileaspglyglncysilecysasp195200205aspglyphethrglygluaspcysserglnleualacysproserasp210215220cysasnaspglnglylyscysvalasnglyvalcysilecyspheglu225230235240glytyralaglyalaaspcysserarggluilecysprovalprocys245250255serglugluhisglythrcysvalaspglyleucysvalcyshisasp260265270glyphealaglyaspaspcysasnlysproleucysleuasnasncys275280285tyrasnargglyargcysvalgluasnglucysvalcysaspglugly290295300phethrglygluaspcyssergluleuilecysproasnaspcysphe305310315320aspargglyargcysileasnglythrcystyrcysglugluglyphe325330335thrglygluaspcysglylysprothrcysprohisalacyshisthr340345350glnglyargcysglugluglyglncysvalcysaspgluglypheala355360365glyvalaspcysserglulysargcysproalaaspcyshisasnarg370375380glyargcysvalaspglyargcysglucysaspaspglyphethrgly385390395400alaaspcysglygluleulyscysproasnglycysserglyhisgly405410415argcysvalasnglyglncysvalcysaspgluglytyrthrglyglu420425430aspcysserglnleuargcysproasnaspcyshisserargglyarg435440445cysvalgluglylyscysvalcysgluglnglyphelysglytyrasp450455460cysseraspmetsercysproasnaspcyshisglnhisglyargcys465470475480valasnglymetcysvalcysaspaspglytyrthrglygluaspcys485490495argaspargglncysproargaspcysserasnargglyleucysval500505510aspglyglncysvalcysgluaspglyphethrglyproaspcysala515520525gluleusercysproasnaspcyshisglyglnglyargcysvalasn530535540glyglncysvalcyshisgluglyphemetglylysaspcyslysglu545550555560glnargcysproseraspcyshisglyglnglyargcysvalaspgly565570575glncysilecyshisgluglyphethrglyleuaspcysglyglnhis580585590sercysproseraspcysasnasnleuglyglncysvalserglyarg595600605cysilecysasngluglytyrserglygluaspcyssergluvalser610615620proprolysaspleuvalvalthrgluvalthrglugluthrvalasn625630635640leualatrpaspasnglumetargvalthrglutyrleuvalvaltyr645650655thrprothrhisgluglyglyleuglumetglnpheargvalprogly660665670aspglnthrserthrileileglngluleugluproglyvalglutyr675680685pheileargvalphealaileleugluasnlyslysserileproval690695700seralaargvalalathrtyrleuproalaprogluglyleulysphe705710715720lysserilelysgluthrservalgluvalglutrpaspproleuasp725730735ilealaphegluthrtrpgluileilepheargasnmetasnlysglu740745750aspgluglygluilethrlysserleuargargprogluthrsertyr755760765argglnthrglyleualaproglyglnglutyrgluileserleuhis770775780ilevallysasnasnthrargglyproglyleulysargvalthrthr785790795800thrargleuaspalaproserglnilegluvallysaspvalthrasp805810815thrthralaleuilethrtrpphelysproleualagluileaspgly820825830ilegluleuthrtyrglyilelysaspvalproglyaspargthrthr835840845ileaspleuthrgluaspgluasnglntyrserileglyasnleulys850855860proaspthrglutyrgluvalserleuileserargargglyaspmet865870875880serserasnproalalysgluthrphethrthrglyleuaspalapro885890895argasnleuargargvalserglnthraspasnserilethrleuglu900905910trpargasnglylysalaalaileaspsertyrargilelystyrala915920925proileserglyglyasphisalagluvalaspvalprolyssergln930935940glnalathrthrlysthrthrleuthrglyleuargproglythrglu945950955960tyrglyileglyvalseralavallysgluasplysgluserasnpro965970975alathrileasnalaalathrgluleuaspthrprolysaspleugln980985990valsergluthralagluthrserleuthrleuleutrplysthrpro99510001005leualalyspheaspargtyrargleuasntyrserleuprothr101010151020glyglntrpvalglyvalglnleuproargasnthrthrsertyr102510301035valleuargglyleugluproglyglnglutyrasnvalleuleu104010451050thralaglulysglyarghislysserlysproalaargvallys105510601065alaserthrgluglnalaprogluleugluasnleuthrvalthr107010751080gluvalglytrpaspglyleuargleuasntrpthralaalaasp108510901095glnalatyrgluhispheileileglnvalglnglualaasnlys110011051110valglualaalaargasnleuthrvalproglyserleuargala111511201125valaspileproglyleulysalaalathrprotyrthrvalser113011351140iletyrglyvalileglnglytyrargthrprovalleuserala114511501155glualaserthrglygluthrproasnleuglygluvalvalval116011651170alagluvalglytrpaspalaleulysleuasntrpthralapro117511801185gluglyalatyrglutyrphepheileglnvalglnglualaasp119011951200thrvalglualaalaglnasnleuthrvalproglyglyleuarg120512101215serthraspleuproglyleulysalaalathrhistyrthrile122012251230thrileargglyvalthrglnasppheserthrthrproleuser123512401245valgluvalleuthrglugluvalproaspmetglyasnleuthr125012551260valthrgluvalsertrpaspalaleuargleuasntrpthrthr126512701275proaspglythrtyraspglnphethrileglnvalglngluala128012851290aspglnvalgluglualahisasnleuthrvalproglyserleu129513001305argsermetgluileproglyleuargalaglythrprotyrthr131013151320valthrleuhisglygluvalargglyhisserthrargproleu132513301335alavalgluvalvalthrgluaspleuproglnleuglyaspleu134013451350alavalsergluvalglytrpaspglyleuargleuasntrpthr135513601365alaalaaspasnalatyrgluhisphevalileglnvalglnglu137013751380valasnlysvalglualaalaglnasnleuthrleuproglyser138513901395leuargalavalaspileproglyleuglualaalathrprotyr140014051410argvalseriletyrglyvalileargglytyrargthrproval141514201425leuseralaglualaserthralalysgluprogluileglyasn143014351440leuasnvalseraspilethrprogluserpheasnleusertrp144514501455metalathraspglyilephegluthrphethrilegluileile146014651470aspserasnargleuleugluthrvalglutyrasnilesergly147514801485alagluargthralahisileserglyleuproproserthrasp149014951500pheilevaltyrleuserglyleualaproserileargthrlys150515101515thrileseralathralathrthrglualaleuproleuleuglu152015251530asnleuthrileseraspileasnprotyrglyphethrvalser153515401545trpmetalasergluasnalapheaspserpheleuvalthrval155015551560valaspserglylysleuleuaspproglngluphethrleuser156515701575glythrglnarglysleugluleuargglyleuilethrglyile158015851590glytyrgluvalmetvalserglyphethrglnglyhisglnthr159516001605lysproleuargalagluilevalthrglualagluprogluval161016151620aspasnleuleuvalseraspalathrproaspglypheargleu162516301635sertrpthralaaspgluglyvalpheaspasnphevalleulys164016451650ileargaspthrlyslysglnsergluproleugluilethrleu165516601665leualaprogluargthrargaspilethrglyleuarggluala167016751680thrglutyrgluilegluleutyrglyileserlysglyargarg168516901695serglnthrvalseralailealathrthralametglyserpro170017051710lysgluvalilepheseraspilethrgluasnseralathrval171517201725sertrpargalaprothralaglnvalgluserpheargilethr173017351740tyrvalproilethrglyglythrprosermetvalthrvalasp174517501755glythrlysthrglnthrargleuvallysleuileproglyval176017651770glutyrleuvalserileilealametlysglypheglugluser177517801785gluprovalserglyserphethrthralaleuaspglyproser179017951800glyleuvalthralaasnilethraspserglualaleualaarg180518101815trpglnproalailealathrvalaspsertyrvalilesertyr182018251830thrglyglulysvalprogluilethrargthrvalserglyasn183518401845thrvalglutyralaleuthraspleugluproalathrglutyr185018551860thrleuargilephealaglulysglyproglnlysserserthr186518701875ilethralalysphethrthraspleuaspserproargaspleu188018851890thralathrgluvalglnsergluthralaleuleuthrtrparg189519001905proproargalaservalthrglytyrleuleuvaltyrgluser191019151920valaspglythrvallysgluvalilevalglypr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