本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种基于cd19的嵌合抗原受体及其应用，具体为以肿瘤特异靶点cd19为基础的嵌合抗原受体t(car-t)细胞技术的构建方法及其在抗肿瘤治疗中的应用。
背景技术：
b淋巴细胞恶性肿瘤，包括急性淋巴细胞性白血病(bcellacutelymphocyticleukemia,b-all)、b细胞淋巴瘤(bcelllymphoma)和和慢性淋巴细胞性白血病(chroniclymphocyticleukemia,cll))，不论对成人或儿童而言，都是血液疾病的大宗。传统治疗这些患者的一种方法有化疗、放疗、干细胞移植、小分子药物及抗体药物的利用。这些疗法固然可以治愈一部分的患者，但仍有许多人因对化疗放疗的恶性反应、对药物的耐受性、移植无效、反复复发及基因突变造成的难治性而死亡。
随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体t细胞疗法(chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy，car-t)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。一般，嵌合抗原受体car由一个肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区域以及胞内信号转导区组成。通常，car包含抗体的单链片段可变(singlechainfragmentvariable，scfv)区或对肿瘤相关表面抗原(tumorassociatedsurfaceantigen,taa)具有特异性的结合结构域，其通过铰链和跨膜区与t细胞信号传导分子的胞质结构域偶联。最常见的淋巴细胞活化部分包括与t细胞效应物功能触发(例如cd3ζ)部分串联的t细胞共刺激结构域。car介导的过继性免疫疗法允许car-移植的t细胞以非hla限制性方式直接识别靶肿瘤细胞上的taa。通过car的表达，对t细胞进行遗传修饰以靶向在肿瘤细胞上表达的抗原，且尝试使用表达car的遗传修饰细胞来治疗这些类型的患者已经取得了有前景的成功。
cd19分子是治疗b淋巴细胞系血液恶性疾病的潜在靶点，也是car研究中的热点，cd19的表达局限于正常和恶性b细胞，是广泛接受的用来安全测试的car靶标。靶向cd19分子的嵌合抗原受体基因修饰的t细胞(cd19car-t)在治疗多发性、难治性的急性b淋巴细胞白血病上取得巨大成功。
cn104788573a公开了一种嵌合抗原受体hcd19scfv-cd8α-cd28-cd3ζ及其用途，该嵌合抗原受体由抗人cd19单克隆抗体hi19a轻链和重链可变区(hcd19scfv)、人cd8α铰链区、人cd28跨膜区和胞内区、以及人cd3ζ胞内区结构串联构成。但现有技术中的基于cd19的嵌合抗原受体免疫因子风暴毒性比较大，副作用大。
因此，找到一种副作用低，杀伤效果好，不易引起免疫因子风暴的嵌合抗原受体就显得尤为重要。
技术实现要素：
本发明提供一种基于cd19的嵌合抗原受体及其应用，本发明制备的嵌合抗原受体通过将t细胞信号进行基因改造，从而提高了car刺激信号的t细胞免疫效果，增强了car-t细胞的治疗效果。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种基于cd19的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、cd3ζ信号传导结构域和可诱导自杀融合结构域串联而成；
其中，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述抗原结合结构域为针对肿瘤表面抗原cd19的单链抗体，所述共刺激信号传导区包括cd27信号传导结构域，所述诱导自杀融合结构域为icasp9。
本发明中，通过将抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原cd19，再通过对t细胞受体细胞内信号，即cd27信号传导结构域，进行特定的基因改造，从而使得肿瘤表面抗原能够特异的结合在本申请的嵌合抗原受体上，传送更有效的t细胞刺激信号，且相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果，靶点的表达量高，也会使得car-t细胞的免疫效果增强。
不仅如此，发明人发现，本发明嵌合抗原受体，经过t细胞信号cd27信号传导结构域与诱导自杀融合结构域结合，优化改造，使其杀伤效果更好且不易引起免疫因子风暴，並配有安全撤除机制，这些改造使此嵌合抗原受体cd19细胞的应用更为有效及广泛，且安全性更高。
根据本发明，所述基因修饰改造的t细胞嵌合受体(car)以及针对cd19抗原结合结构域的单链抗体(scfv)为例叙述如下。
本发明中，所述针对t细胞受体信号基因进行了特异性改造，使得改造后的序列表达出来的t细胞受体的信号更能够持续作用并且缓慢释放免疫因子，提高体内反应安全性。
根据本发明，所述针对肿瘤表面抗原cd19的单链抗体的氨基酸序列如seqidno.1所示或与其具有90％以上同源性的氨基酸序列，所述seqidno.1所示的氨基酸序列如下：
diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitgstsgsgkpgsgegstkgevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvss.
根据本发明，所述其具有90％以上同源性的氨基酸序列可以由其它单链抗体或人源化cd19单链抗体替代，其具有90％以上同源性的氨基酸突变体，仍然具有cd19单链抗体的的功能。
根据本发明，所述cd27信号传导结构域的氨基酸序列如seqidno.2所示如下：qrrkyrsnkgespvepaepchyscpreeegstipiqedyrkpepacsp.
根据本发明，所述诱导自杀融合结构域icasp9的氨基酸序列如seqidno.3所示，所述seqidno.3所示的氨基酸序列如下：
gsgatnfsllkqagdveenpgpmgvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkvdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellkleggggsggggsgamvgaleslrgnadlayilsmepcghcliinnvnfcresglrtrtgsnidceklrrrfsslhfmvevkgdltakkmvlallelarqdhgaldccvvvilshgcqashlqfpgavygtdgcpvsvekivnifngtscpslggkpklffiqacggeqkdhgfevastspedespgsnpepdatpfqeglrtfdqldaisslptpsdifvsystfpgfvswrdpksgswyvetlddifeqwahsedlqslllrvanavsvkgiykqmpgcfnflrkklffktsas.
根据本发明，所述可诱导自杀融合结构域通过2a序列与cd3ζ信号传导结构域相串联，所述2a序列会使所述可诱导自杀融合结构域表达的蛋白与所述嵌合抗原受体蛋白断裂开，从而使得所述嵌合抗原受体能够发挥作用，而通过注入激活剂，从而使得可诱导自杀融合结构域激活，从而导致表达嵌合抗原受体的t细胞死亡而失去作用。
根据本发明，所述跨膜结构域为cd28跨膜结构域和/或cd8α跨膜结构域，在一些具体实施方案中，可以通过氨基酸替换来选择或修饰跨膜结构域。
根据本发明，所述共刺激信号传导区还包括cd28信号传导结构域，所述cd28信号传导结构域和cd27信号传导结构域的排列，本领域技术人员可以根据需要进行调整，cd28信号传导结构域和cd27信号传导结构域不同的排列不会对所述嵌合抗原受体产生影响，本申请采用cd28-cd27的基因改良后的顺序组合。
所述cd28细胞外信号传导结构域的氨基酸序列如seqidno.6所示如下：ievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskp；
所述cd28跨膜区域传导结构域的氨基酸序列如seqidno.7所示如下：fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv；
所述cd28细胞内信号传导结构域的氨基酸序列如seqidno.8所示如下：rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsas.
根据本发明，所述嵌合抗原受体还包括信号肽，所述信号肽为能够指导嵌合抗原受体跨膜转移的信号肽，本领域技术人员可以根据需要选择本领域常规的信号肽，所述信号肽为secretory信号肽，所述secretory信号肽的氨基酸序列如seqidno.9所示如下：mlllvtslllcelphpafllip.
优选的，所述secretory信号肽为cd8a基因的信号肽，所述secretory信号肽的氨基酸序列如seqidno.10所示如下：malpvtalllplalllhaarp.
优选的，所述secretory信号肽为gmcsfr基因的信号肽，所述secretory信号肽的氨基酸序列如seqidno.11所示如下：mlllvtslllcelphpafllip.
本发明的嵌合抗原受体还可以包括铰链区，所述铰链区本领域技术人员可以根据实际情况进行选择，在此不做特殊限定，铰链区的存在不会对本发明的嵌合抗原受体的性能产生影响。
根据本发明，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、cd3ζ信号传导结构域、2a序列和可诱导自杀融合结构域串联而成。
作为优选技术方案，所述嵌合抗原受体为secretory信号肽、cd19抗原结合结构域，cd8α和/或cd28跨膜结构域，cd28细胞外信号传导结构域、cd28细胞内信号传导结构域、cd27细胞内信号传导结构域，cd3ζ细胞内信号传导结构域、2a序列和icasp9结构域串联而成，具体排列如下：
secretory-cd19-cd28-cd27-cd3ζ-2a-icasp9。
根据本发明，所述嵌合抗原受体secretory-cd19-cd28-cd27-cd3ζ-2a-icasp9(4s-car19)的氨基酸序列如seqidno.4所示或与其具有80％以上同源性的氨基酸序列，所述seqidno.4所示的氨基酸序列如下：
mlllvtslllcelphpafllipdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitgstsgsgkpgsgegstkgevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvssaaaievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsasggggsggggsqrrkyrsnkgespvepaepchyscpreeegstipiqedyrkpepacspggggsggggsrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalpprtsgsgatnfsllkqagdveenpgpmgvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkvdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellkleggggsggggsgamvgaleslrgnadlayilsmepcghcliinnvnfcresglrtrtgsnidceklrrrfsslhfmvevkgdltakkmvlallelarqdhgaldccvvvilshgcqashlqfpgavygtdgcpvsvekivnifngtscpslggkpklffiqacggeqkdhgfevastspedespgsnpepdatpfqeglrtfdqldaisslptpsdifvsystfpgfvswrdpksgswyvetlddifeqwahsedlqslllrvanavsvkgiykqmpgcfnflrkklffktsas；
根据本发明，所述嵌合抗原受体secretory-cd19-cd28-cd27-cd3ζ-2a-icasp9(4s-car19)的核苷酸序列如seqidno.5所示或与其具有80％以上同源性的氨基酸序列，所述seqidno.5所示的核酸序列如下：
atgctgctgctggtcacaagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatccccgacatccagatgacccagaccaccagcagcctgagcgccagcctgggcgacagagtgaccatcagctgccgggccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaaacccgacggcaccgtgaagctgctgatctaccacaccagccggctgcacagcggcgtgcccagcagattttctggcagcggatctggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgctacctacttctgtcagcagggcaacaccctgccctacaccttcggcggaggcaccaagctggaaatcaccggcagcaccagcggctccggcaagcctggatctggcgagggcagcaccaagggcgaagtgaagctgcaggaaagcggccctggcctggtcgcccctagccagagcctgtccgtgacctgtaccgtgtccggcgtgtccctgcccgactacggcgtgtcctggatcagacagccccccagaaagggcctggaatggctgggcgtgatctggggcagcgagacaacctactacaacagcgccctgaagtcccggctgaccatcatcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcaccagcgtgacagtctcttctgcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccctgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccgctagcggaggtggaggttctggaggtggtggaagtcaaagaaggaagtaccgcagcaacaaaggagaatctcccgtcgagccagccgagccctgtcattattcatgcccaagggaggaggagggaagtacaatcccaattcaagaagactacaggaagcccgaacctgcatgcagtccaggtggaggcggttctggaggcggtggctcccgggtgaaattctcacggtctgcagacgcacccgcttaccagcaaggccagaaccaactctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcactagtggctccggagccacgaacttctctctgttaaagcaagcaggagacgtggaagaaaaccccggtcccatgggagtgcaggtggaaaccatctccccaggagacgggcgcaccttccccaagcgcggccagacctgcgtggtgcactacaccgggatgcttgaagatggaaagaaagtggactcctcccgggacagaaacaagccctttaagtttatgctaggcaagcaggaggtgatccgaggctgggaagaaggggttgcccagatgagtgtgggtcagagagccaaactgactatatctccagattatgcctatggtgccactgggcacccaggcatcatcccaccacatgccactctcgtcttcgatgtggagcttctaaaactggaaggtggaggcggttcaggcggcggcggcagcggcgccatggtcggtgctcttgagagtttgaggggaaatgcagatttggcttacatcctgagcatggagccctgtggccactgcctcattatcaacaatgtgaacttctgccgtgagtccgggctccgcacccgcactggctccaacatcgactgtgagaagttgcggcgtcgcttctcctcgctgcatttcatggtggaggtgaagggcgacctgactgccaagaaaatggtgctggctttgctggagctggcgcggcaggaccacggtgctctggactgctgcgtggtggtcattctctctcacggctgtcaggccagccacctgcagttcccaggggctgtctacggcacagatggatgccctgtgtcggtcgagaagattgtgaacatcttcaatgggaccagctgccccagcctgggagggaagcccaagctctttttcatccaggcctgtggtggggagcagaaagaccatgggtttgaggtggcctccacttcccctgaagacgagtcccctggcagtaaccccgagccagatgccaccccgttccaggaaggtttgaggaccttcgaccagctggacgccatatctagtttgcccacacccagtgacatctttgtgtcctactctactttcccaggttttgtttcctggagggaccccaagagtggctcctggtacgttgagaccctggacgacatctttgagcagtgggctcactctgaagacctgcagtccctcctgcttagggtcgctaatgctgtttcggtgaaagggatttataaacagatgcctggttgctttaatttcctccggaaaaaacttttctttaaaacatcagctagt.
本发明中，所述嵌合抗原受体还包括启动子，所述启动子为ef1a，或cmv或其中的任意一种或至少两种的组合。
根据本发明，所述的嵌合抗原受体通过其编码的核酸序列转染到t细胞中表达。
根据本发明，所述转染的方式为通过病毒载体、真核表达质粒或mrna序列中的任意一种或至少两种的组合转染到t细胞，优选为通过病毒载体转染到t细胞。
优选地，所述病毒载体为慢病毒载体或逆转录病毒载体中的任意一种或至少两种的组合，优选为慢病毒载体。
第二方面，本发明提供一种重组慢病毒，将包含如第一方面所述的嵌合抗原受体的病毒载体与包装辅助质粒pnhp和phef-vsvg共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。
本发明中，所述重组慢病毒可有效免疫细胞，包括t细胞，能够制备靶向t细胞。
根据本发明，所述哺乳细胞为293细胞，293t细胞或te671细胞中的任意一种或至少两种的组合。
第三方面，本发明提供一种t细胞，包含如第一方面所述的嵌合抗原受体和/或如第二方面所述的重组慢病毒。
本发明中，所述t细胞具有良好靶向作用，同时能够释放低剂量免疫因子，具备低毒性反应性质。
第四方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包括如第一方面所述的嵌合抗原受体、如第二方面所述的重组慢病毒或如第三方面所述的t细胞中的任意一种或至少两种的组合。
第五方面，本发明提供如第一方面所述的嵌合抗原受体、如第二方面所述的重组慢病毒或如第三方面所述的组合物在制备嵌合抗原受体t细胞及其在肿瘤治疗药物中的应用；
优选地，所述肿瘤为血液相关的肿瘤疾病和/或实体瘤，所述肿瘤疾病选自但不限于白血病。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的嵌合抗原受体通过对t细胞嵌合受体基因进行特定的改造，经过t细胞信号传递区优化改造，使其杀伤效果更好且不易引起免疫因子风暴，並配有安全撤除机制，这些改造使此嵌合抗原受体cd19细胞的应用更为有效及广泛，且安全性更高；
(2)本发明的嵌合抗原受体能特异性的识别肿瘤表面抗原，如cd19，在白血病及淋巴瘤中表达量高，且嵌合抗原受体上的针对肿瘤表面抗原cd19的反应温和有效，相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更安全的效果，使得car-t细胞的免疫效果增强，并且增加了car-t细胞的安全性。
附图说明
图1为本发明的嵌合抗原受体的合成基因序列图谱；
图2(a)为原发性b-all细胞中cd19抗体流式细胞分析结果直方图，样本来自三个b-all患者的骨髓，其中，灰色区域为同型阴性对照；图2(b)为原发性b-all细胞的cd19抗体染色流式细胞分析结果点图，样本来自三个b-all患者的骨髓；
图3为car-t细胞的体外白血病细胞株cd19特异性杀伤试验结果。
图4(a)为不同信号传导域的cd19car-t细胞，体外杀伤能力的动态比较；图4(b)为不同信号传导域的cd19car-t细胞，体外杀伤时，释放免疫因子的能力比较；
图5为cd19car-t细胞的临床试验流程图；
图6为本申请嵌合抗原受体与其他嵌合抗原受体的效果对比图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1嵌合抗原受体的构建
(1)通过全基因合成secretory信号肽、cd19抗原结合结构域，cd8α和/或cd28跨膜结构域，cd28信号传导结构域、cd27信号传导结构域，cd3ζ信号传导结构域、2a序列和胱天蛋白酶9结构域，如图1所示，即secretory-cd19-cd28-cd27-cd3ζ-2a-icasp9；
实施例2慢病毒包装
(1)使用293t细胞，培养17-18小时；
(2)加入新鲜的dmem，内含10％的fbs；
(3)在无菌离心管中加入以下试剂：每孔取dmem加入helperdnamix(pnhp，phef-vsv-g)以及ptyfdna载体，漩涡振荡；
(4)用superfect或是任何转基因材料加至离心管，室温静置7-10分钟；
(5)将离心管中的dna-superfect混合液逐滴加入至每个培养细胞中，漩涡打匀；
(6)37℃3％co2培养箱里培养4-5小时；
(7)吸走培养基的培养液，用293细胞培养液冲洗培养基，并加入培养液继续培养；
(8)将培养基放回3％co2培养箱中培养过夜，第二天早上用荧光显微镜观察转染效率。
实施例3慢病毒的纯化和浓缩
1)病毒纯化
通过离心1000g，5分钟除去细胞碎片，得到病毒上清液，用一个0.45微米的低蛋白结合过滤器将病毒上清液过滤，病毒被分装成小份，储存在-80℃；
通常情况下，在每毫升的培养基中，转染细胞可以产生106到107转导单位滴定的慢病毒载体。
2)用centricon过滤器浓缩慢病毒载体
(1)centricon过滤管中加入病毒上清液，然后在2500g离心30分钟；
(2)震荡过滤管，然后400g离心2分钟，收集浓缩的病毒到收集杯中。最后将所有管中的病毒集中到一个离心管中。
实施例4car-t细胞的转染
将活化后的t细胞接种到培养皿中，加入浓缩目标基因的慢病毒，以100g离心力的速度，离心100分钟，置于37℃培养24h，加入有细胞培养因子的aim-v培养基，培养2-3天后，将细胞收获并计数，即成为可用之cd19car-t细胞。
实施例5car-t细胞的体外白血病细胞株杀伤
(1)从图2(a)及图2(b)可以看出，原发性骨髓b-all细胞表面cd19的表达量高，且广泛表达与b-all患者中，表示本发明选用的cd19嵌合抗原受体能够用于治疗b-all。
(2)体外评估car-t细胞对靶细胞的识别杀伤功能：将非专一性的t细胞、gd2car-t细胞和本申请制备的专一性的4s-cd19cart(4s-car19)细胞与表达cd19但不表达gd2之靶细胞，也就是表达gfp之rs4-11(人急性淋巴白血病细胞株)(t细胞：rs4-11＝3:1)，置于37度5％co2培养箱共培养24h；
(3)共培养之后，以annexinv及pi进行细胞染色，并以流式细胞仪分析。其中，annexinv阳性者为因为特异性杀伤而濒临凋亡的细胞，annexinv及pi双阳性者为因为特异性杀伤而已凋亡的细胞，pi阳性者为一般死亡细胞。
结果如图3所示，gfp荧光强度流式图可以看出，荧光强度为103以上的细胞为rs4-11肿瘤靶细胞，因此挑选荧光强度为103以上的细胞做进一步分析。可以看出，当rs4-11细胞未与任何t细胞共培养时，背景值有9％的靶细胞濒临凋亡，6％的靶细胞凋亡。当rs4-11细胞与未经基因修饰的一般t细胞共培养时，18.0％的靶细胞濒临凋亡，26.4％的靶细胞凋亡，此为非特异性杀伤背景值。当rs4-11细胞与gd2car-t细胞共培养时，17.3％的靶细胞濒临凋亡，29.9％的靶细胞凋亡，也是非特异性杀伤背景值。当rs4-11细胞与特异性cd19car-t细胞共培养时，22.3％的靶细胞濒临凋亡，52.8％的靶细胞凋亡，此为特异性杀伤造成的效果。可见，cd19嵌合抗原受体t细胞的靶细胞濒临凋亡以及靶细胞凋亡数明显高于其他对照组，因此cd19嵌合抗原受体对rs4-11靶细胞有较好的毒杀作用。
实施例6cd19car-t细胞体外杀伤动态比较及安全性测试
(1)将非专一性的t细胞或不同信号传导域的cd19car-t细胞，包含41bbcar19、28-27car19、及本发明之28-27caspase9car19(4s-car19)与rs4-11置于37度5％co2培养箱共培养24h。于培养后2小时、6小时、及24小时记录存活之rs4-11细胞比例，结果如图4(a)所示。相较于对照组t细胞，41bbcar19、28-27car19、及本发明之28-27caspase9car19都对rs4-11细胞造成明显的杀伤效。从2小时及6小时的数据可以看出，本发明之28-27caspase9car19杀伤动态较为缓慢，但24小时后，仍可以和41bbcar19及28-27car19达到同样的杀伤效果。显示本发明之28-27caspase9car19所造成的白血病细胞消融现象不会过度剧烈而产生临床应用上的毒性。
(2)将非专一性的t细胞或不同信号传导域的cd19car-t细胞，包含41bbcar19、28-27car19、及本发明之28-27caspase9car19,与rs4-11置于37度5％co2培养箱共培养6h后，以细胞内因子染色法检测不同cd19car-t细胞所产生的免疫因子量及脱颗粒效应，结果如图4(b)所示。相较于对照组t细胞，41bbcar19、28-27car19、及本发明之28-27caspase9car19都表现出较强的脱颗粒能力及生产较多的干扰素及白介素2。生产干扰素之细胞百分比，对照组t细胞为0.6％，41bbcar19为6.9％，28-27caspase9car19为4.3％，28-27car19为6.3％。生产白介素2之细胞百分比，对照组t细胞为2.5％，41bbcar19为8.9％，28-27caspase9car19为8.8％，28-27car19为10.2％。由此可见，于6小时共培养后，本发明之28-27caspase9car19释放的免疫因子量，较其他种的信号传导域的cd19car-t细胞少，可推论其于临床应用时，较不易引起免疫因子风暴，增加治疗的安全性。
实施例7car-t细胞的临床应用
自2013年7月至2016年7月，本实验室与22所临床医学中心及医院合作，治疗了102位符合入组条件的cd19阳性且化疗耐受性之b-all患者。总计有55名儿童及47名成人，其中27位患者接受过异体造血干细胞移植。患者于接受car-t治疗时，骨髓中幼稚白血病细胞百分比中位数为14.5％(范围从0％到98％)。其中69名患者骨髓幼稚白血病细胞小于50％，另外33名患者骨髓幼稚白血病细胞大于50％。从初次诊断到接受car-t细胞治疗的时间长中位数为17个月(范围从2到164个月)。
图5为临床试验流程图。患者首先经过医院及实验室的评估，符合入组条件后采集自体或供者白细胞。接下来依循标准操作流程，由pbmc中筛选出cd3阳性t细胞，进行活化及转染4scar19，制成cd19car-t细胞。患者于输注前，经环磷酰胺及氟达拉滨预处理。平均输注细胞数为每公斤体重1.05x106细胞。白细胞及car-t细胞的品质、基因转染率、car-t细胞扩增情况及有效car-t细胞输注数都经过评估及记录。患者回输car-t细胞后，在一个月内会密切监测其免疫因子风暴及car拷贝数。长期的临床及实验室评估可以得到治疗毒性及最终治疗效果的结论。毒性评估依据nationalcancerinstitute’scommonterminologycriteriaforadverseevents(ctcaev4.03)。cox比例风险模型用以分析类别变数及连续变数，kaplan-meier曲线则用于生存分析，结果如表1-3所示。
表1为患者缓解率及生存天数
四年间接受cd19car-t细胞治疗并完整收集数据的患者共计110例，有96人达到完全缓解，其中有51名儿童及45名成人。平均无复发天数超过100天，总体生存天数超过200天。结果显示了本发明之cd19car-t细胞良好的治疗效果。
表2为输注car-t细胞后，患者的免疫因子风暴状态
骨髓恶性细胞小于50％的患者中，55人仅有0-1级的免疫因子风暴反应，17人有2-4级反应。骨髓恶性细胞大于等于50％的患者中，17人有0-1级的免疫因子风暴反应，21人有2-4级反应。总体来说，65％的患者只有0-1级的免疫因子风暴反应，且反应的强度与回输前的恶性细胞负荷並没有统计上的相关性。这个结果表明了本发明之cd19car-t细胞的安全性。
表3为car-t细胞在体内的扩增情形
患者输注car-t细胞后的三周内，在周边血中可以测到的car拷贝数，在有收集到数据的101名患者中，只有一人完全没有测到拷贝数，另外有60人侦测到1％以下的拷贝数，32人有1％到5％的拷贝数，更有8人测到超过5％的拷贝数。由于周边血细胞基数庞大，能够侦测到1％的car拷贝数即代表car-t细胞有明显的扩增。由此表可以得知，本发明的cd19car-t细胞在体内的扩增情形良好，能够更好的执行杀伤癌细胞的功能。
综上所述，本发明的嵌合抗原受体的针对cd19肿瘤表面抗原的单链抗体不容易发生突变，从图6可以看出，本发明的嵌合抗原受体且相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果，经过t细胞信号传递区优化改造，使其杀伤效果更好且不易引起免疫因子风暴，並配有安全撤除机制，使得car-t细胞的免疫效果增强，增强了car-t细胞的治疗效果。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110>北京美康基免生物科技有限公司
<120>一种基于cd19的嵌合抗原受体及其应用
<130>2018
<141>2018-02-23
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