本发明涉及吡唑[3,4-b]并吡啶类衍生物，本发明还涉及它们的制备方法以及医药用途。
背景技术：
：近年来，针对肿瘤细胞能量代谢异常的深入研究，为肿瘤靶向药物的研发提供了新的思路和理论基础。细胞的能量代谢方式包括两种：线粒体依赖性氧化磷酸化和非依赖性糖酵解。正常细胞在有氧条件下主要依赖线粒体的氧化磷酸化获取能量，而在缺氧时主要进行糖酵解产生少量的三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate，atp)。肿瘤细胞的生长、无限增殖、转移等过程都需要大量的能量供应。与正常细胞能量代谢方式不同，肿瘤细胞即使在氧气充足的情况下也主要以糖酵解方式获取能量，这种独特的有氧糖酵解的现象被称为warburg效应。其特点是：相比于正常细胞，肿瘤细胞摄取葡萄糖的能力更强，但尽管糖酵解方式产生atp的速度比氧化磷酸化快，但肿瘤细胞对葡萄糖的利用率低，主要表现在消耗单位葡萄糖生成atp的量远比氧化磷酸化低，于是癌细胞需在单位时间内代谢更多的葡萄糖以满足快速分裂、生物合成、氧化还原等过程的能量需求。研究发现，肿瘤细胞之所以具有warburg效应的原因在于有氧糖酵解为新肿瘤细胞的构筑提供物质基础，有利于增殖；同时代谢过程中产生大量的乳酸可使癌细胞局部保持酸性环境，有利于癌细胞对周围组织的侵袭。此外，糖酵解速率的增加也会导致肿瘤细胞对氧化损伤和化疗药物的抵抗。因此，有氧糖酵解是肿瘤细胞增殖、生存的基础。近年来，癌细胞能量代谢异常及其与微环境和基因异常表达的关系受到广泛关注。研究表明，葡萄糖转运体的活性提高、糖酵解关键酶的活性增强以及原癌基因的异常活化或抑癌基因的失活等都可促使癌细胞从氧化磷酸化向糖酵解能量方式的转变。其中，腺苷酸活化蛋白激酶(amp-activatedproteinkinase，ampk)在细胞能量代谢调控过程中起着关键作用，其在能量缺乏时被激活，能量充足时被抑制。meera等研究表明，肿瘤细胞异常的能量代谢导致amp/atp的比值降低，引起ampk的mrna水平、蛋白表达及酶活性显著降低。肿瘤细胞的能量代谢异常旺盛，而ampk下调可以引起肿瘤细胞的发生、生长、转移等多个环节。与正常细胞相比，癌细胞中mtor过度表达，而ampk的失活失去了其对mtor的负向调节作用。另外，faubert等发现ampk失活时，warburg现象的标志物乳酸盐的胞内含量明显增加，促进癌细胞能量代谢。ampk的激活可以拮抗akt(又称蛋白激酶b，proteinkinaseb，pkb)促糖酵解的作用，有效地抑制mtor的表达，通过负向调控warburg效应抑制癌细胞的生长。基于肿瘤细胞的能量代谢特点以及肿瘤细胞中ampk的失活促糖酵解特性，ampk激活剂为抗肿瘤药物研究提供了新思路。ampk的激活可抑制消耗atp的合成代谢过程，启动生成atp的分解代谢过程，维持机体能量代谢平衡。因此，从能量代谢角度出发，寻找ampk激活剂有望成为肿瘤治疗的新策略。技术实现要素：本发明的目的是提供了一种吡唑[3,4-b]并吡啶类衍生物，还提供了它们的制备方法以及医药用途。为实现上述目的，本发明的技术方案是：技术方案之一：提供一种吡唑[3,4-b]并吡啶类衍生物，结构通式如式(i)所示：其中，r1选自c1-c6脂肪链、c3-c6脂肪环、取代或未取代的芳烃或芳杂环；r2、r3分别独立地选自甲基、三氟甲基、取代或未取代的芳基，其中取代芳基结构中的取代基选自羟基、氨基、卤素，位置处于邻、间、对位；r4选自-cn、-ch2nh2，-cooh、coor5、-ch2-nr6r7及其药学上可用的盐，其中，r4优选-ch2nh2；r5选自c1-c6脂肪链、c3-c6脂肪环、取代或未取代的芳环、取代或未取代的芳杂环；r6、r7分别独立地选自-ch3,-c2h5；或-nr6r7为脂肪杂环，优选取代或未取代的吗啉、哌啶、吡咯、哌嗪，取代基选自c1-c6脂肪链、c3-c6脂肪环。c1-c6脂肪链是指1-6个碳原子组成的直链或支链烷烃和不饱和脂肪烃；c3-c6脂肪环是指3-6个碳原子组成的脂肪环，包括饱和、不饱和脂肪烃；取代或未取代的芳烃是指苯基或取代芳烃，其中取代芳烃结构中的取代基选自羟基、氨基、卤素，位置处于邻、间、对位；取代或未取代的芳杂环是含有氧、氮、硫等杂原子取代单芳香环或骈合环；未取代的芳烃优选为苯环。所述药学上可用的盐是盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、高氯酸盐、甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、马来酸盐、丁二酸盐、三氟乙酸盐、琥珀酸盐、水杨酸盐、dl-天冬氨酸盐、d-天冬氨酸盐、l-天冬氨酸盐、dl-谷氨酸盐、d-谷氨酸盐、l-谷氨酸盐、甘油酸盐、硬脂酸盐、dl-酒石酸盐、d-酒石酸盐、l-酒石酸盐、(±)扁桃酸盐、(r)-(-)扁桃酸盐、(s)-(+)扁桃酸盐、柠檬酸盐、粘酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、dl-苹果酸盐、(±)乳酸盐、l-(+)-乳酸盐、d-(+)-乳酸盐、扑酸盐、d-α-半乳糖醛酸盐、甘油酸盐、dl-半胱氨酸盐、d-半胱氨酸盐、l-半胱氨酸盐、(4s)-羟基-l-脯氨酸盐、环丙烷-1,1-二羧酸盐、2,2-甲基丙二酸盐、酪氨酸盐、脯氨酸盐、富马酸盐、1-羟基-2-萘甲酸盐、膦酰基乙酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、3-膦酰基丙酸盐、dl-焦谷氨酸盐、d-焦谷氨酸盐、l-焦谷氨酸盐、对甲苯磺酸盐、苯磺酸盐、乙磺酸盐、(±)樟脑磺酸盐、萘磺酸盐、1r-(-)-樟脑磺酸盐、1s-(+)-樟脑磺酸盐、1,5-萘二磺酸盐、1,2-乙烷二磺酸盐、1,3-丙烷二磺酸盐、3-(n-吗啉代)丙烷磺酸盐、联苯基磺酸盐，羟乙基磺酸盐、1-羟基-2-萘磺酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢钾盐、磷酸二钾盐、磷酸钾盐、磷酸氢钠盐、磷酸二钠盐、磷酸钠盐、磷酸二氢钠盐、磷酸钙盐、三代磷酸钙盐、六氟代磷酸盐、乙烯基磷酸盐、2-羟基乙基磷酸盐和苯基磷酸盐。所述吡唑[3,4-b]并吡啶类衍生物，具体化合物为以下化合物：6-(5-氯噻唑-2-基)甲氧基-3-甲基-1-苯基-1h-吡唑[3,4-b]吡啶-5-甲腈(化合物1)；6-((2-氟苄氧基)-1-(4-氟苯基)-3-甲基-1-苯基-1h-吡唑[3,4-b]吡啶-5-甲腈(化合物2)；1-(4-氯苯基)-6-((5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-3-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-甲腈(化合物3)；6-((5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-甲腈(化合物4)；1-(4-氟苯基)-6-(吡啶-2-基甲氧基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-甲腈(化合物5)；6-(2-氟苄氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-甲腈(化合物6)；6-(2-氟苄氧基)-3-甲基-1-对甲苯基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-甲腈(化合物7)；(6-((5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-3-甲基-1-对甲苯基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲胺(化合物8)；(6-((5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲胺(化合物9)；(6-(苄氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲胺(化合物10)；(6-(2-氟苄氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲胺(化合物11)；(6-(3-氟苄氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲胺(化合物12)；(6-(4-氟苄氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲胺(化合物13)；(6-(4-氯苄氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基]甲胺(化合物14)；(1-(4-氟苯基)-6-(4-甲基)氧基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲胺(化合物15)；(1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-6(2-(三氟甲基)苄氧基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲胺(化合物16)；(1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-6(3-(三氟甲基)苄氧基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲胺(化合物17)；(1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-6(4-(三氟甲基)苄氧基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲胺(化合物18)；(6-(2-氯-4-氟苄氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲胺(化合物19)；n-((6-(5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)-2-吗啉烷-1-胺(化合物20)；n-((6-(5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙烷-1-胺(化合物21)；n-((6-((5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)-2-(哌啶-1-基)乙烷-1-胺(化合物22)；n-((6-((5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基哌啶-1-基)乙烷-1-胺(化合物23)；(1-(2-(((6-((5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-1-(4-氟苯基)-4-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)氨基)乙基)哌啶-2-基)甲醇(化合物24)；1-(2-(((6-((5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-1-(4-氟苯基)-4-三氟甲基-1h吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)氨基)乙基)哌啶-4-醇(化合物25)。技术方案之二：本发明还提供了上述吡唑[3,4-b]并吡啶类衍生物化合物的制备方法，路线如下：合成起始物β-酮酸酯和苯肼衍生物为商品化原料，化合物i-iv可参照文献方法(j.med.chem.2014,57,4761)制备。化合物v在四氢铝锂、硼氢化钠、硼烷等还原剂作用下，结构中的氰基被还原为氨基。优选地，还原剂选择六水合氯化钴和硼氢化钠，同时加入叔丁氧羰基酸酐将还原产物氨基保护，得到化合物vii。化合物v或化合物vii在n，n-二甲基甲酰胺、乙腈等溶剂中，在缚酸剂作用下与卤代烃反应制得化合物vi或化合物viii，其中溶剂优选乙腈，缚酸剂优选碳酸钾，卤代烃优选溴代烃和氯代烃；化合物viii在室温条件下经三氟乙酸脱保护，得到化合物ix；化合物ix在无水二氯甲烷、乙腈等溶剂中，低温条件下与氯甲酸氯乙醇酯反应，再回流反应环合制得化合物xi；其中，溶剂优选乙腈；化合物xi在dmso溶剂中，微波条件下，与不同有机胺反应，制得化合物xii。技术方案之三：所述吡唑[3,4-b]并吡啶类衍生物作为ampk激活剂的应用。所述吡唑[3,4-b]并吡啶类衍生物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用，优选作为抗肺癌药物应用。本发明提供了一类结构新颖的吡唑[3,4-b]并吡啶类衍生物，并提供了该类化合物的制备方法，该类化合物具有抗肿瘤活性，可应用在抗肿瘤药物的制备中。附图说明图1a、1b表示实施例27中化合物对ampk及acc磷酸化水平的影响。图2a、2b、2c表示实施例27中化合物对70s6k和4ebp1磷酸化水平的影响。图3表示本发明化合物的结合通式。具体实施方式实施例16-(5-氯噻唑-2-基)甲氧基-3-甲基-1-苯基-1h-吡唑[3,4-b]吡啶-5-甲腈(化合物1)3-甲基-6-氧-1-苯基-6,7-二氢-1h-吡唑[3,4-b]吡啶-5-甲腈(0.5g，2.0mmol)放入50ml茄型瓶中，然后依次加入30ml乙腈、无水碳酸钾(0.33g，2.4mmol)和2-氯-5-氯甲基噻唑(0.35g，2.1mmol)，回流反应4h后，tlc监测原料原料反应完全，停止反应。冷却至室温，将反应液减压浓缩，加入100ml二氯甲烷和100ml水，用二氯甲烷萃取2次，有机层用饱和nacl溶液洗涤2～3次，然后用无水na2so4干燥4h。将有机层旋干后用柱层析纯化，洗脱体系用石油醚:乙酸乙酯＝5:1，分纯后得到白色固体。收率：86％，熔点：196.5～197.2℃，hplc：98.08％。1hnmr(500mhz,dmso-d6):δ8.98(s,1h),8.26～8.17(m,2h,ar-h),7.83(s,1h),7.61～7.52(m,2h,ar-h),7.35～7.30(m,1h,ar-h),5.67(s,2h,-ch2-),2.54(s,3h).13cnmr(125mhz,dmso-d6):δ174.31,145.35,139.58,134.96,129.80,129.00(2c),128.00,127.66,125.22,125.09,124.20,122.79,120.54(2c),109.17,35.89,21.33.hrms(esi)m/zcalcdfor[c18h12cln5os+h]+:382.0451；found:383.0919[m+h]+.实施例26-((2-氟苄氧基)-1-(4-氟苯基)-3-甲基-1-苯基-1h-吡唑[3,4-b]吡啶-5-甲腈(化合物2)按照化合物1的合成方法，以1-(4-氟苯基)-3-甲基-6-氧-6,7-二氢-1h-吡唑[3,4-b]吡啶-5-甲腈和2-氟溴苄为原料，得到白色固体。收率：82％，熔点：202.2～203.8℃，hplc：97.30％。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ8.30(s,1h),8.13–8.01(m,2h,ar-h),7.59～7.55(m,1h,ar-h),7.35(m,1h,ar-h),7.26～7.09(m,4h,ar-h),5.68(s,2h,-ch2-),2.61(s,3h,-ch3).13cnmr(100mhz,cdcl3):δ162.43,161.77,159.51,148.76,144.14,137.89,134.15,130.13,130.05,129.70,124.38,123.12,122.98,122.52,122.44,115.99,115.77,115.54,115.33,111.84,91.85,63.17,12.46.hrms(esi)m/zcalcdfor[c21h14f2n4o+h]+:377.1169；found:377.1219[m+h]+.实施例31-(4-氯苯基)-6-((5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-3-甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-甲腈(化合物3)按照化合物1的合成方法，以1-(4-氯苯基)-3-甲基-6-氧-6,7-二氢-1h-吡唑[3,4-b]吡啶-5-甲腈和2-氯-5-氯甲基溴苄为原料，得到白色固体。收率：94％，熔点：235.2～235.5℃，hplc：98.12％。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ8.32(s,1h),8.14～8.05(m,2h,ar-h),7.67(s,1h),7.57～7.50(m,2h,ar-h),5.71(s,2h,-ch2-),2.63(s,4h,-ch3).13cnmr(100mhz,cdcl3):δ161.78,153.58,148.62,144.84,141.98,138.24,136.63,134.14,131.97,129.41(2c),122.22(2c),115.03,112.46,91.76,61.05,12.41.hrms(esi)m/zcalcdfor[c18h11cl2n5os+h]+:417.0032；found:417.0074[m+h]+.实施例46-((5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-甲腈(化合物4)按照化合物1的合成方法，以1-(4-氟苯基)-6-氧-3-(三氟甲基)-6,7-二氢-1h-吡唑[3,4-b]吡啶-5-甲腈和2-氯-5氯甲基溴苄为原料，得到白色固体。收率：86％，熔点：182.5～184.6℃，hplc：98.98％。1hnmr(500mhz,cdcl3):δ8.52(s,1h),8.06～8.03(m,j＝13.8hz,2h,ar-h),7.65(s,1h),7.35～7.30(d,j＝17.1hz,2h,ar-h),5.72(s,2h,-ch2-).13cnmr(125mhz,cdcl3):δ163.06,162.18,161.05,153.87,148.33,142.34,138.45,136.18,133.58,124.42,124.35,121.62,119.48,116.56,116.38,114.13,108.36,95.75,61.72.hrms(esi)m/zcalcdfor[c18h8clf4n5os+h]+:454.0074；found:454.0173[m+h]+.实施例51-(4-氟苯基)-6-(吡啶-2-基甲氧基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-甲腈(化合物5)按照化合物1的合成方法，以1-(4-氟苯基)-6-氧-3-(三氟甲基)-6,7-二氢-1h-吡唑[3,4-b]吡啶-5-甲腈和2-氯甲基吡啶盐酸为原料，得到白色固体。收率：93％，熔点：193.8～195.1℃，hplc：98.11％。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ8.66(m,1h,ar-h),8.53(s,1h),8.09～8.05(m,j＝4.5hz,2h,ar-h),7.84～7.80(s,1h,ar-h),7.65～7.63(s,1h,ar-h),7.34～7.31(s,1h,ar-h),7.28～7.23(m,j＝8.3hz,2h,ar-h),5.74(s,2h,-ch2-).13cnmr(100mhz,cdcl3):δ162.96,162.65,160.47,155.19,149.26,148.52,137.99,135.73,133,56,123.49,123.40,123.11,121.06,116.38,116.16,114.55,108.17,95.63,70.30.hrms(esi)m/zcalcdfor[c20h11f4n5o+h]+:414.0933；found:414.0982[m+h]+.实施例66-(2-氟苄氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-甲腈(化合物6)按照化合物1的合成方法，以1-(4-氟苯基)-6-氧-3-(三氟甲基)-6,7-二氢-1h-吡唑[3,4-b]吡啶-5-甲腈和2-氟溴苄为原料，得到白色固体。收率：72％，熔点：201.8～202.4℃，hplc：99.33％。1hnmr(500mhz,cdcl3):δ8.49(s,1h),8.10～8.06(m,2h,ar-h),7.57～7.53(m,1h,ar-h),7.43～7.32(m,1h,ar-h),7.31～7.23(m,2h,ar-h),7.21～7.18(m,1h,ar-h),7.17～7.11(m,1h,ar-h),5.70(s,2h,-ch2-).13cnmr(125mhz,cdcl3):δ162.75,162.72,161.58,160.78,159.61,148.58,138.02,135.85,133.80,130.41,129.79,124.48,123.74,122.48,121.71,119.56,116.33,116.14,115.62,114.51,108.08,95.70,63.67.hrms(esi)m/zcalcdfor[c21h11f5n4o+h]+:431.0887；found:431.0930[m+h]+.实施例76-(2-氟苄氧基)-3-甲基-1-对甲苯基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-甲腈(化合物7)按照化合物1的合成方法，以3-甲基-6-氧-1-(4-甲基苯基)-6,7-二氢-1h-吡唑[3,4-b]吡啶-5-甲腈和2-氯-5-氯甲基噻唑为原料，得到白色固体。收率：90％，熔点：231.5～234.2℃，hplc：99.38％。1hnmr(500mhz,cdcl3):δ8.30(s,1h),7.95～7.94(d,j＝8.4hz,2h,ar-h),7.66(s,1h),7.37～7.36(d,j＝8.2hz,2h,ar-h),5.69(s,2h,-ch2-),2.62(s,3h,-ch3),2.46(s,3h,-ch3).13cnmr(125mhz,cdcl3):δ161.63,153.54,148.46,144.03,141.83,138.06,135.87,134.43,129.81,121.39,115.18,112.05,91.61,60.89,21.03,12.34.hrms(esi)m/zcalcdfor[c19h14cln5os+h]+:396.0608；found:396.0685[m+h]+.实施例8(6-((5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-3-甲基-1-对甲苯基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲胺(化合物8)叔丁基((3-甲基-6-氧代-1-对甲苯基-6,7-二氢-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯的制备3-甲基-6-氧-1-(4-甲基苯基)-6,7-二氢-1h-吡唑[3,4-b]吡啶-5-甲腈(10.0g，0.038mol)放入250ml茄型瓶中，加入100ml甲醇，室温搅拌下依次加入六水合氯化钴(27.0g，0.114mol)、二碳酸二叔丁酯(32.9g，0.151mol)，此时溶液呈深蓝色，加料完后继续搅拌2h。然后将反应液转移至0℃搅拌冷却，称取硼氢化钠(5.75g，0.151mol)，分批缓慢加入反应瓶中，30min内加料完毕。再将反应液转移至室温搅拌反应12h，tlc监测原料反应完全即停止反应。反应液用硅藻土抽滤，滤液用饱和氯化铵溶液淬灭，然后用乙酸乙酯萃取2～3次，萃取完乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥4h，然后减压浓缩得粗品。粗品用80～100目的硅胶拌样，然后用200～300目硅胶柱层析纯化(洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯＝2:1)。白色固体，收率：58％，熔点：182.4～183.1℃,hplc:97.25％。1hnmr(500mhz,cdcl3):δ7.74(s,1h),7.50～7.44(m,2h,ar-h),7.37～7.34(m,j＝8.1hz,2h,ar-h),5.13(s,1h,-nh-),4.13～3.89(d,2h,-ch2-),2.47(s,3h,-ch3),2.45(s,3h,-ch3),1.46(s,9h),1.31～1.24(s,1h,-nh-).13cnmr(125mhz,cdcl3):δ164.23,155.89,144.60,140.54,138.24,134.57,132.50,129.99(2c),123.92,121.67,105.88,79.16,41.21,28.48(3c),21.02,12.04.hrms(esi)m/zcalcdfor[c20h24n4o3+h]+:369.1882；found:369.1848[m+h]+.(6-((5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-3-甲基-1-对甲苯基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲胺的制备于50ml茄型瓶中，加入叔丁基((3-甲基-6-氧代-1-对甲苯基-6,7-二氢-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(0.5g，1.4mmol)，然后依次加入30ml乙腈、无水碳酸钾(0.28g，2.0mmol)、2-氯-5-氯甲基噻唑(0.25，1.5mmol)，搅拌回流反应3h，tlc监测原料反应完全后停止反应，将反应液浓缩，然后加入100ml水，再用200ml的乙酸乙酯萃取，有机层用饱和氯化钠溶液洗2次，然后用无水硫酸钠干燥4h，浓缩后用80～100目硅胶拌样，200～300目硅胶柱层析纯化(洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯＝5:1)得白色固体。将固体加入30ml二氯甲烷，超声使其完全溶解，然后加入3ml三氟乙酸，室温搅拌反应3h，tlc监测(展开剂为石油醚:乙酸乙酯＝2:1)原料全部反应完全后停止反应，将反应液缓慢倒入200ml的饱和碳酸氢钠溶液中，然后再加入100ml二氯甲烷萃取2次，有机相用无水硫酸钠干燥4h，减压浓缩后用80～100目的硅胶拌样，200～300目硅胶柱层析纯化(洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝30:1)。白色固体，收率：86％，熔点：135.1～136.4℃，hplc：98.59％。1hnmr(500mhz,cdcl3):δ8.07～8.05(d,j＝8.5hz,1h,ar-h),7.92(s,1h),7.64(s,1h),7.34～7.32(d,j＝8.2hz,1h,ar-h),5.67(s,1h,-ch2-),3.92(s,1h,-ch2-),2.60(s,3h,-ch3),2.43(s,3h,-ch3),1.79(s,2h,-nh2).13cnmr(125mhz,cdcl3):δ160.01,153.11,147.38,142.64,141.17,136.92,135.95,135.26,129.99(2c),129.52,120.66(2c),120.38,112.37,59.96,41.84,20.93,12.34.hrms(esi)m/zcalcdfor[c19h18cln5os+h]+:400.0921；found:400.1054[m+h]+.实施例9(6-((5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲胺(化合物9)按照化合物8的合成方法，先后以叔丁基((1-(4-氟苯基)-6-氧代-3-三氟甲基-6,7-二氢-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯和2-氯-5-氯甲基噻唑为原料，得到白色固体。收率：92％，熔点：142.3～143.6℃，hplc：98.62％。1hnmr(500mhz,dmso-d6):δ8.32(s,1h),8.23(d,j＝4.3hz,2h,ar-h),7.87(s,1h),7.49(d,j＝13.2hz,2h,ar-h),5.76(s,2h,-ch2-),3.77(s,2h,-ch2-),2.13(s,2h,-nh2).13cnmr(125mhz,cdcl3):δ162.46,161.03,160.46,153.41,147.16,141.35,135.21,134.54,129.29,124.54,123.75,123.68,122.39,120.25,116.17,115.99,109.14,60.54,41.57.hrms(esi)m/zcalcdfor[c18h12clf4n5os+h]+:458.0387；found:458.0442[m+h]+.实施例10(6-(苄氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲胺(化合物10)按照化合物8的合成方法，先后以叔丁基((1-(4-氟苯基)-6-氧代-3-三氟甲基-6,7-二氢-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯和溴苄为原料，得到白色固体。收率：87％，熔点：108.1～109.8℃，hplc：98.51％。1hnmr(500mhz,dmso-d6):δ8.28(s,1h),8.16～8.13(m,j＝13.9hz,2h,ar-h),7.52～7.50(m,j＝7.4hz,2h,ar-h),7.47～7.40(m,4h,ar-h),7.35～7.32(m,j＝14.7hz,1h,ar-h),5.55(s,2h,-ch2-),3.84(s,2h,-ch2-),2.21(s,2h,-nh2).13cnmr(125mhz,dmso-d6):δ162.02,160.08,147.36,137.11,134.95,133.81,128.85(2c),128.38,128.13,128.05(2c),126.58,123.72,123.65,122.95,120.80,116.72,116.54,108.32,68.58,40.70.hrms(esi)m/zcalcdfor[c21h16f4n4o+h]+:417.1294；found:417.1317[m+h]+.实施例11(6-(2-氟苄氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲胺(化合物11)按照化合物8的合成方法，先后以叔丁基((1-(4-氟苯基)-6-氧代-3-三氟甲基-6,7-二氢-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯和2-氟溴苄为原料，得到白色固体。收率：82％，熔点：122.6～123.8℃，hplc：99.55％。1hnmr(500mhz,dmso-d6):δ8.23～8.10(m,1h,ar-h),8.07(s,1h),7.50–7.46(m,1h,ar-h),7.39–7.34(m,1h,ar-h),7.27～7.22(m,j＝15.9hz,2h,ar-h),7.20～7.09(m,j＝7.8hz,2h,ar-h),5.63(s,2h,-ch2-),3.99(s,2h,-ch2-),1.28(s,2h,-nh2).13cnmr(125mhz,dmso-d6):δ161.77,160.09,159.88,147.25,134.84,130.77,128.23,126.53,124.94,123.99,123.88,123.66,123.59,122.91,120.77,116.62,116.43,115.95,115.78,108.56,62.97,40.69.hrms(esi)m/zcalcdfor[c21h16f4n4o+h]+:435.1200；found:435.1217[m+h]+.实施例12(6-(3-氟苄氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲胺(化合物12)按照化合物8的合成方法，先后以叔丁基((1-(4-氟苯基)-6-氧代-3-三氟甲基-6,7-二氢-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯和3-氟溴苄为原料，得到白色固体。收率：82％，熔点：118.7～119.4℃，hplc：99.51％。1hnmr(500mhz,dmso-d6):δ8.24(s,1h),8.17～8.02(m,2h,ar-h),7.45(m,j＝8.0,6.1hz,1h,ar-h),7.41～7.37(m,j＝14.9,6.1hz,2h,ar-h),7.34～7.31(m,j＝10.6,4.5hz,2h),7.16～7.13(m,j＝8.5,2.1hz,1h,ar-h),5.51(s,2h,-ch2-),3.81(s,2h,-ch2-),1.96(s,2h,-nh2).13cnmr(125mhz,dmso-d6):δ163.46,161.75,160.25,147.35,140.22,134.85,133.57,130.98,130.91,128.01,126.70,123.88,123.74,123.68,122.91,120.79,116.70,116.52,114.74,108.44,67.78,40.66.hrms(esi)m/zcalcdfor[c21h16f4n4o+h]+:435.1200；found:435.1217[m+h]+.实施例13(6-(4-氟苄氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲胺(化合物13)按照化合物8的合成方法，先后以叔丁基((1-(4-氟苯基)-6-氧代-3-三氟甲基-6,7-二氢-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯和4-氟溴苄为原料，得到白色固体。收率：91％，熔点：157.7～159.0℃，hplc：98.89％。1hnmr(500mhz,dmso-d6):δ8.28(s,1h),8.18～8.15(m,j＝13.6hz,2h),7.59～7.56(m,j＝13.7hz,2h,ar-h),7.49～7.46(m,j＝17.5hz,2h,ar-h),7.27～7.23(m,j＝17.6hz,2h,ar-h),5.53(s,2h,-ch2-),3.83(s,2h,-ch2-),2.37(s,2h,-nh2).13cnmr(125mhz,dmso-d6):δ163.24,162.06,161.97,161.30,160.12,147.37,134.88,133.32,130.42,130.35,128.24,126.38,123.78,123.71,122.98,120.82,116.76,116.57,115.84,115.67,108.46,68.03,40.63.hrms(esi)m/zcalcdfor[c21h16f4n4o+h]+:435.1200；found:435.1217[m+h]+.实施例14(6-(4-氯苄氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基]甲胺(化合物14)按照化合物8的合成方法，先后以叔丁基((1-(4-氟苯基)-6-氧代-3-三氟甲基-6,7-二氢-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯和4-氯溴苄为原料，得到白色固体。收率：93％，熔点：144.7～146.4℃，hplc：98.98％。1hnmr(500mhz,dmso-d6):δ8.29(s,1h),8.16～8.13(m,j＝13.9hz,2h,ar-h),7.56～7.54(m,j＝8.4hz,2h,ar-h),7.49～7.45(m,j＝19.6hz,4h),5.54(s,2h,-ch2-),3.85(s,2h,-ch2-),1.27(s,2h,,-nh2).13cnmr(125mhz,dmso-d6):δ162.06,161.87,160.11,147.34,136.20,134.86,132.97,129.90(2c),128.92(2c),128.37,126.21,123.74,123.67,122.92,120.78,116.75,116.57,108.50,67.92,40.57.hrms(esi)m/zcalcdfor[c21h15clf4n4o+h]+:451.0841；found:451.0947[m+h]+.实施例15(1-(4-氟苯基)-6-(4-甲基)氧基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲胺(化合物15)按照化合物8的合成方法，先后以叔丁基((1-(4-氟苯基)-6-氧代-3-三氟甲基-6,7-二氢-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯和4-甲基溴苄为原料，得到白色固体。收率：88％，熔点：150.8～152.0℃，hplc：97.79％。1hnmr(500mhz,dmso-d6):δ8.26(s,1h),8.18～8.15(m,j＝7.8,4.6hz,2h,ar-h),7.48～7.44(m,j＝8.5hz,2h,ar-h),7.40～7.38(m,j＝7.5hz,2h,ar-h),7.22～7.20(m,j＝7.4hz,2h,ar-h),5.48(s,2h,-ch2-),3.82(s,2h,-ch2-),2.29(s,3h,-ch3),1.21(s,2h,-nh2).13cnmr(125mhz,dmso-d6):δ162.11,160.11,147.41,137.68,134.90,134.01,129.46(2c),128.30(2c),126.96,126.28,123.81,123.74,122.95,120.81,116.76,116.57,108.38,68.69,40.59,21.22.hrms(esi)m/zcalcdfor[c22h18f4n4o+h]+:431.1450；found:431.1492[m+h]+.实施例16(1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-6(2-(三氟甲基)苄氧基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲胺(化合物16)按照化合物8的合成方法，先后以叔丁基((1-(4-氟苯基)-6-氧代-3-三氟甲基-6,7-二氢-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯和2-三氟甲基溴苄为原料，得到白色固体。收率：95％，熔点：136.7～137.9℃，hplc：98.37％。1hnmr(500mhz,dmso-d6):δ8.31(s,1h),8.06(m,j＝13.9hz,2h,ar-h),7.85(d,1h,ar-h),7.75(d,1h,ar-h),7.72～7.69(t,1h,ar-h),7.58(s,1h),7.60～7.57(t,j＝17.6hz,2h,ar-h),5.72(s,2h,-ch2-),3.84(s,2h,-ch2-),2.01(s,2h,-nh2).13cnmr(125mhz,dmso-d6):δ161.92,161.45,159.97,147.07,134.99,134.79,133.83,133.22,129.82,128.98,128.30,126.51,125.88,123.70,123.37,123.30,122.87,120.73,116.43,116.24,108.69,65.22,40.53.hrms(esi)m/zcalcdfor[c22h15f7n4o+h]+:485.1168；found:485.1188[m+h]+.实施例17(1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-6(3-(三氟甲基)苄氧基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲胺(化合物17)按照化合物8的合成方法，先后以叔丁基((1-(4-氟苯基)-6-氧代-3-三氟甲基-6,7-二氢-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯和3-三氟甲基溴苄为原料，得到白色固体。收率：93％，熔点：140.4～141.5℃，hplc：99.59％。1hnmr(500mhz,dmso-d6):δ8.30(s,1h),8.18～8.15(m,j＝14.0hz,2h,ar-h),7.90(s,1h,ar-h),7.84～7.83(d,1h,ar-h),7.70～7.69(d,1h,ar-h),7.66～7.63(s,1h,ar-h),7.46～7.42(m,j＝17.6hz,2h),5.66(s,2h,-ch2-),3.87(s,2h,-ch2-),1.27(s,2h,-nh2).13cnmr(125mhz,dmso-d6):δ162.06,161.83,160.11,147.30,138.63,134.80,133.83,132.09,130.05,128.43,126.30,125.67,125.08,124.70,123.79,123.72,122.92,120.78,116.70,116.52,108.56,67.91,40.57.hrms(esi)m/zcalcdfor[c22h15f7n4o+h]+:485.1168；found:485.1188[m+h]+.实施例18(1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-6(4-(三氟甲基)苄氧基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲胺(化合物18)按照化合物8的合成方法，先后以叔丁基((1-(4-氟苯基)-6-氧代-3-三氟甲基-6,7-二氢-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯和4-三氟甲基溴苄为原料，得到白色固体。收率：90％，熔点：176.4～178.1℃，hplc：97.94％。1hnmr(500mhz,dmso-d6):δ8.29(s,1h),8.10～8.07(m,j＝13.6hz,2h,ar-h),7.79～7.78(d,j＝8.1hz,2h,ar-h),7.73～7.72(d,j＝8.0hz,2h,ar-h),7.44～7.41(m,j＝17.3hz,2h,ar-h),5.63(s,2h,-ch2-),3.87(s,2h,-ch2-),2.22(s,2h,-nh2).13cnmr(125mhz,dmso-d6):δ162.05,161.76,160.10,147.21,142.18,134.83,133.84,133.50,128.98,128.37(2c),126.51,125.83,125.80,123.70,123.63,122.92,120.78,116.73,116.55,108.61,67.86,40.64.hrms(esi)m/zcalcdfor[c22h15f7n4o+h]+:485.1168；found:485.1188[m+h]+.实施例19(6-(2-氯-4-氟苄氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲胺(化合物19)按照化合物8的合成方法，先后以叔丁基((1-(4-氟苯基)-6-氧代-3-三氟甲基-6,7-二氢-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯和2-氯-4-氟溴苄为原料，得到白色固体。收率：83％，熔点：153.8～154.6℃，hplc：98.72％。1hnmr(500mhz,dmso-d6):δ8.33(s,1h),8.14～8.12(m,j＝14.0hz,2h,ar-h),7.69～7.66(m,1h,ar-h),7.60～7.57(m,1h,ar-h),7.46～7.43(m,j＝17.6hz,2h,ar-h),7.28～7.24(m,1h,ar-h),5.59(s,2h,-ch2-),3.90(s,2h,-ch2-),3.65(s,2h,-nh2).13cnmr(125mhz,dmso-d6):163.07,162.02,161.52,161.15,160.12,147.33,134.77,133.88,132.02,130.76,129.13,124.37,122.84,120.70,117.37,117.17,116.68,116.50,115.02,114.86,108.54,65.68,40.53.hrms(esi)m/zcalcdfor[c22h15f7n4o+h]+:469.0747；found:469.0831[m+h]+.实施例20n-((6-(5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)-2-吗啉烷-1-胺(化合物20)3-((6-((5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)恶唑烷-2-酮的制备于100ml茄型瓶中加入化合物9(3g，6.553mmol)，30ml乙腈，超声使其溶解，然后加入无水k2co3(2.26g，16.382mmol)，室温搅拌下再滴加氯甲酸氯乙酯(1.87g，13.105mmol)于反应瓶中，继续搅拌反应。1.5h后tlc监测(展开剂为二氯甲烷:甲醇＝30:1)，原料反应完全。反应升温至85℃回流，12h后tlc监测(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)中间体全部反应完。停止反应，将反应液浓缩，然后用200ml乙酸乙酯萃取，有机层用饱和氯化钠溶液洗2～3次。有机层用无水硫酸钠干燥4h，然后抽滤浓缩，柱层析纯化(洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯＝5:1)。白色固体，收率：92％，熔点：204.1～205.8℃，hplc：97.82％。1hnmr(500mhz,dmso-d6):δ8.24(s,1h),8.23～8.19(m,j＝14.0hz,2h,ar-h),7.86(s,1h),7.52～7.47(m,j＝17.7hz,2h,ar-h),5.76(s,2h,-ch2-),4.45(s,2h,-ch2-),4.25(t,2h,-ch2-),3.49(t,2h,-ch2-).13cnmr(125mhz,dmso-d6):δ162.34,161.72,160.40,158.36,152.07,147.85,142.68,136.11,134.49,131.58,124.67,124.60,122.63,120.60,118.83,116.92,116.65,108.60,62.34,61.37,44.80,43.42.hrms(esi)m/zcalcdfor[c21h14clf4n5o3s+h]+:528.0442；found:528.0418[m+h]+。n-((6-(5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)-2-吗啉烷-1-胺的制备于50ml微波管中，加入3-((6-((5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)恶唑烷-2-酮(0.5g，0.947mmol)，加入15mldmso使其溶解，再加入吗啡啉(0.33g，3.789mmol)。设置反应温度为110℃，微波反应90min后，tlc监测(展开剂为二氯甲烷:甲醇＝30:1)原料全部反应完全。停止反应，冷却至室温。将反应液倒入300ml冰水中，然后用乙酸乙酯(200ml)萃取，有机层用饱和氯化钠溶液洗3次，然后用无水硫酸钠干燥4h。抽滤，浓缩，柱层析初步纯化(洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝50:1)。白色固体，收率：70％，熔点：177.4～178.9℃，hplc：96.32％。1hnmr(500mhz,dmso-d6):δ8.15～8.08(m,j＝8.5hz,2h,ar-h),8.03(s,1h),7.66(s,1h),7.31～7.27(m,2h,ar-h),5.64(s,2h,-ch2-),3.84(s,2h,-ch2-),3.76～3.70(m,4h),3.35(t,j＝5.8hz,2h),2.80～2.73(m,2h),2.58(m,j＝4.1hz,4h),1.69(s,1h).13cnmr(125mhz,dmso-d6):δ163.61,162.25,160.39,152.69,148.72,140.43,134.43,133.67,130.71,124.94,123.81,123.67,122.85,120.71,116.64,116.45,107.11,60.52,57.02(2c),56.32(2c),54.12,41.48,36.85.hrms(esi)m/zcalcdfor[c24h23clf4n6o2s+h]+:571.1228；found:571.1198[m+h]+.实施例21n-((6-(5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙烷-1-胺(化合物21)按照化合物20的合成方法，以3-((6-((5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)恶唑烷-2-酮和n-甲基哌嗪为原料，得到白色固体。收率：62％，熔点：240.4～241.7℃，hplc：96.11％。1hnmr(500mhz,dmso-d6):δ8.13～8.09(m,j＝8.7hz,2h,ar-h),7.97(s,1h),7.59(s,1h),7.47～7.43(m,2h,ar-h),5.67(s,2h,-ch2-),3.92(s,2h,-ch2-),3.38(t,j＝5.0hz,2h),3.31～3.15(m,4h),2.75(m,2h),2.47～2.36(m,4h),2.14(s,3h,-nch3),1.62(s,1h).13cnmr(125mhz,dmso-d6):δ163.67,162.34,160.41,152.61,148.64,140.43,134.73,133.98,130.75,124.92,123.71,123.62,122.78,120.71,116.62,116.48,107.33,61.43,55.6(2c),50.3(2c),46.3,44.86,41.23,38.73.hrms(esi)m/zcalcdfor[c25h26clf4n7os+h]+:585.1515；found:585.1526[m+h]+.实施例22n-((6-((5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)-2-(哌啶-1-基)乙烷-1-胺(化合物22)按照化合物20的合成方法，以3-((6-((5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)恶唑烷-2-酮和哌啶为原料，得到白色固体。收率：73％，熔点：236.3～237.2℃，hplc：96.54％。1hnmr(500mhz,dmso-d6):δ8.18～8.10(m,j＝8.0hz,2h,ar-h),7.98(s,1h),7.63(s,1h),7.50～7.44(m,2h,ar-h),5.60(s,2h,-ch2-),3.87(s,2h,-ch2-),3.43(t,j＝6.3hz,2h),2.49～2.32(m,6h),1.64～1.54(m,4h),1.58(s,1h),1.43(s,2h).13cnmr(125mhz,dmso-d6):δ163.62,162.30,160.48,152.45,148.77,139.96,134.36,133.40,130.72,124.99,123.76,123.58,122.85,120.72,118.52,116.46,107.36,61.29,56.78(2c),53.27,46.36,41.05,25.87(2c),23.49.hrms(esi)m/zcalcdfor[c25h25clf4n6os+h]+:570.1406；found:570.1435[m+h]+.实施例23n-((6-((5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)-2-(2-甲基哌啶-1-基)乙烷-1-胺(化合物23)按照化合物20的合成方法，以3-((6-((5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)恶唑烷-2-酮和2-甲基哌啶为原料，得到浅黄色油状物。收率：68％，hplc：97.49％。1hnmr(500mhz,cdcl3):δ8.15～8.09(m,j＝7.8hz,2h,ar-h),8.02(s,1h),7.61(s,1h),7.28～7.25(m,j＝11.8hz,2h,ar-h),5.66(s,2h,-ch2-),4.41(d,j＝6.7hz,2h,-ch2-),4.24(t,j＝14.9,8.9hz,2h,-ch2-),2.48～2.41(m,5h),1.56～1.45(m,6h),1.50(s,1h),1.48(s,3h).13cnmr(125mhz,cdcl3):δ162.50,160.93,160.53,156.36,153.49,147.44,141.68,134.95,134.45,130.47,124.84,123.77,122.28,120.16,119.94,116.03,109.11,61.66,60.69,56.85,52.09,40.33,31.86,29.40,25.97,23.67,18.82.hrms(esi)m/zcalcdfor[c26h27clf4n6os+h]+:584.1562；found:584.1592[m+h]+.实施例24(1-(2-(((6-((5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-1-(4-氟苯基)-4-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)氨基)乙基)哌啶-2-基)甲醇(化合物24)按照化合物20的合成方法，以3-((6-((5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)恶唑烷-2-酮和2-羟甲基哌啶为原料，得到浅黄色油状物。收率：57％，hplc：96.81％。1hnmr(500mhz,cdcl3):δ8.12～8.10(m,j＝7.9hz,2h,ar-h),7.88(s,1h),7.67(s,1h),7.29～7.24(m,j＝11.4hz,2h,ar-h),5.69(s,2h,-ch2-),4.43(d,j＝6.2hz,2h,-ch2-),4.22(m,2h,-ch2-),3.65(s,1h,-oh),2.85～2.67(m,2h),2.51～2.34(m,5h),1.74～1.30(m,6h),1.28(s,1h).13cnmr(125mhz,cdcl3):δ162.44,160.95,160.46,156.25,153.43,147.45,141.65,134.67,134.48,130.87,130.42,123.82,122.30,120.31,116.20,116.02,109.02,61.73,60.63,51.46,40.25,33.51,29.82,25.10,23.38,18.86.hrms(esi)m/zcalcdfor[c26h27clf4n6o2s+h]+:585.1541；found:595.1552[m+h]+.实施例251-(2-(((6-((5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-1-(4-氟苯基)-4-三氟甲基-1h吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)氨基)乙基)哌啶-4-醇(化合物25)按照化合物20的合成方法，以3-((6-((5-氯噻唑-2-基)甲氧基)-1-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)甲基)恶唑烷-2-酮和4-羟基哌啶为原料，得到透明油状物。收率：74％，hplc：97.63％。1hnmr(500mhz,cdcl3):δ8.15～8.07(m,2h,ar-h),7.94(s,1h),7.65(s,1h),7.33～7.21(m,2h,ar-h),5.68(s,2h,-ch2-),4.44(d,j＝6.2hz,2h,-ch2-),4.30(s,1h,-oh),4.28(m,2h,-ch2-),3.51(s,1h),2.97～2.78(m,2h),2.21～2.01(m,j＝9.4hz,2h),1.95～1.88(m,4h),1.65～1.51(m,2h),1.49(s,1h).13cnmr(125mhz,cdcl3):δ162.48,160.90,160.50,156.32,153.45,147.42,141.65,135.00,134.44,130.92,130.38,123.80,122.27,120.17,116.20,116.01,109.03,68.57,60.64,56.42,50.82,48.74,33.51,29.72,22.86(2c).hrms(esi)m/zcalcdfor[c25h25clf4n6o2s+h]+:586.1355；found:586.1384[m+h]+.实施例26化合物对a549肺癌细胞增殖的抑制实验以a-769662、ddp和5-fu为阳性对照，用mtt法测定所合成的化合物对肺癌细胞的抑制率，计算各化合物的ic50值。(1)实验材料a.细胞株：肺腺癌a549细胞株。b.药品和试剂：3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(mtt)和二甲基亚砜(dmso)购于sigma公司；胰酶、新生牛血清、胎牛血清、rpmi-1640、dmem和青霉素-链霉素购于gibco公司；其它试剂未经特殊说明均购于sigma公司。c.仪器及耗材：co2培养箱(thermo)、酶标仪和荧光倒置显微镜(olympus)、微量移液器等。(2)操作步骤a.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入200μl，铺板使待测细胞调密度8000/孔，边缘孔用无菌pbs填充。b.5％co2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物，共设置5个浓度梯度，每孔20μl，同时做3个复孔。c.放入5％co2，37℃恒温培养箱孵育72小时，放在倒置显微镜下观察。d.每孔加入50μlmtt溶液(2.5mg/ml，即0.25％mtt)，继续培养放入5％co2，37℃恒温培养箱4h。e.4h后终止培养，小心吸去孔内培养液，并用200μlpbs轻轻洗一遍。f.每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光度值，并计算抑制率。g.同时设置调零孔(培养基、mtt、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、mtt、二甲基亚砜)。(3)数据处理每个浓度梯度重复三个复孔，采用spss22.0软件，以浓度为横坐标，抑制率为纵坐标拟合曲线，计算化合物的ic50值。酶标仪上于490nm处测定每孔的吸光度od值，细胞生长抑制率按下式计算：表1：化合物对a549细胞增殖抑制活性化合物编号ic50(μm)/a549化合物编号ic50(μm)/a549化合物132.63±2.68化合物1511.01±0.73化合物277.32±4.90化合物163.88±0.1化合物324.70±1.12化合物173.74±0.03化合物410.45±1.15化合物183.36±0.02化合物544.42±2.97化合物193.77±0.25化合物630.25±2.15化合物2062.43±0.95化合物774.23±6.44化合物2198.56±6.25化合物86.23±0.13化合物2276.70±1.41化合物93.06±0.05化合物2336.90±0.57化合物105.39±0.15化合物2418.83±0.35化合物114.52±0.10化合物2527.22±0.47化合物124.24±0.20a-76966245.29±2.14化合物134.04±0.47ddp1.80±0.23化合物144.19±0.125-fu2.66±0.38实施例27化合物对a549肺癌细胞中ampk及其下游因子磷酸化水平的影响采用westernblot方法，以β-actin为内参，检测活性化合物及阳性对照药a-769662对a549细胞p-ampk、p-acc、p-4ebp1、p-70s6k水平的影响。(1)实验材料a.细胞株：肺腺癌a549细胞株。b.抗体：一抗p-ampk、p-acc、p-4ebp1、p-70s6k购于abcam.gapdh抗体购于江苏碧云天生物有限公司。二抗hrp-羊抗兔igg购于北京中杉生物技术有限公司。c.药品和试剂：化合物9按照本发明方法合成；胰蛋白酶、新生牛血清、胎牛血清、rpmi-1640培养基、dmem和青霉素-链霉素购于gibco公司；考马斯亮蓝等其它试剂未经特殊说明均购于sigma公司。d.仪器及耗材：6孔板、co2培养箱(thermo)、小型水平电泳槽(biosciences)、电泳仪(powerpacbasicbio-rad)、恒温水浴锅、恒温空气摇床、微量移液器、和荧光倒置显微镜(olympus)等。(2)样品的配置a.sds-聚丙烯酰胺凝胶:b.蛋白凝胶上样缓冲液：c.tris-甘氨酸电泳缓冲液：d.电转移缓冲液：e.10×tbs：f.tbst：向1000ml1×tbs中加入0.5ml0.05％tween-20，溶解后室温储存。g.封闭缓冲液：100mltbstbuffer中加入5g5％的脱脂奶粉，溶解后4℃储存。(3)操作步骤a.蛋白样品的提取：收集贴壁细胞，1000r/min离心5min，留细胞沉淀，加入150μl裂解液并用移液器反复吹打，超声(200w)3次，3s/次，12000r/min、4℃离心10min，收上清于1.5mlep管中，即得细胞全蛋白。取少量上清用于蛋白定量，其余上清用5×蛋白凝胶上样缓冲液调成1×浓度，100℃变性10min后，收于-80℃保存；b.蛋白定量：用bca法对蛋白样品进行浓度测定，以570nm为探测波长，630nm为参考波长，用酶标仪测量吸光值。根据标准曲线计算样品的蛋白浓度；c.制胶及上样：配置10％sds-page分离胶，混合均匀后注入厚度为2mm的两块洁净玻璃板间，其上加一薄层异丙醇，室温下静置凝固。待分离胶完全聚合后，倾去水层，以吸水纸吸净残余液体，插入加样梳，缓慢加入浓缩胶，室温静置聚合，再小心拔去加样梳。分别按顺序加入20μla-769662(20μm)及各浓度梯度(0、1、2、4、8、100μm)处理6h后收集的蛋白样品于分离胶的上样孔中。标准孔中加入等体积的分子量marker。d.电泳：加样完毕后，设置上层胶电压80v，下层胶电压120v进行电泳，待溴酚蓝燃料迁移到分离胶最下边缘时停止电泳。d.转膜：从玻璃板中取出凝胶，将其浸泡于转移缓冲液中，取与胶同样大小的1张pvdf膜，将pvdf膜置于10ml甲醇中活化1min；按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、滤纸、pvdf膜、凝胶、滤纸、海绵，轻轻赶走气泡。然后90v转膜2h。e.剪膜及膜的封闭：根据分子量的大小，转膜后将所需要的分别剪开，各印迹膜用tbst缓冲液洗涤后放入5％的脱脂奶粉封闭液内，摇床振动，室温封闭1h。f.一抗孵育：印迹膜于室温封闭1h后，将各条带分别加入按要求配制好的一抗p-ampk、p-acc、p-70s6k及p-4ebp1中，放到4℃环境中轻摇过夜。g.二抗孵育：于摇床上将一抗孵育后的膜用tbst洗膜六次，每次10min，然后放入以1:5000的浓度稀释的hrp-羊抗兔igg稀释液中，室温孵育1h后再用tbst洗膜6次左右，每次10min。f.化学发光、显影、定影：采用化学发光检测系统，在暗室中将pvdf膜与化学发光底物检测试剂盒中的a、b混合液(1:1)作用1min，用保鲜膜包裹pvdf膜，并在其上放置一张x光胶片，根据条带亮度曝光5～20s不等，然后将pvdf膜置于显影机箱中进行定影。(4)作用机制实验结果与讨论：为研究目标化合物是否通过激活ampk而影响肺癌细胞的增殖，选用化合物9进行ampk相关作用机制研究。首先通过westernblot来检测ampk及下游底物acc的磷酸化水平。不同浓度的化合物(0μm、1μm、2μm、4μm、8μm)及20μm的a-769662处理a549细胞6h后进行的westernblot分析结果如图1a和图1b。从图1(图1a和1b)可知，经化合物处理6h后，a549细胞中ampk的磷酸化形式p-ampk的水平上升，且随着浓度的增加，p-ampk的水平逐渐增高，呈现出剂量依赖性。当化合物的浓度为4μm时，a549细胞中p-ampk的水平明显高于20μm时对照药a-769662处理相同时间后细胞内p-ampk水平；当化合物的浓度为8μm时，p-ampk的水平是4μm时的4倍。同样，ampk下游底物acc的磷酸化形式p-acc的水平也提高，且与浓度呈正相关性。上述实验结果表明化合物可增加a549细胞中ampk的磷酸化水平。由于ampk激活后可以下调mtor的活性，作为mtor下游重要的靶蛋白70s6k和4ebp1的磷酸化水平可以反映mtor的活性状态。因此，通过westernblot实验比较了化合物及a-769662处理细胞6h后70s6k和4ebp1磷酸化水平(p-70s6k、p-4ebp1)的差异，结果如图2(图2a、2b和2c)。从图2(图2a、2b和2c)可以看出，20μm的a-769662激活ampk后对下游靶蛋白70s6k及4ebp1的调节作用并没预期一样都表现出负向调节，与对照组相比，p-70s6k的水平上升，而p-4ebp1的水平有所下降，推测其可能原因是低浓度的a-769662对70s6k的调节能力弱，且癌变情况下70s6k的表达还受到其它基因的影响。随着化合物浓度的增加，p-70s6k的水平逐渐降低，且在8μm时化合物对p-70s6k的抑制水平高达95％。另外，低浓度的化合物(1μm、2μm、4μm)处理a549细胞6h后，4ebp1磷酸化水平随浓度升高呈递增趋势，与低浓度的a-769662对70s6k的调节情况类似，表明4ebp1可能受其它旁通路靶基因的影响而对低浓度化合物的调节作用不敏感，但当化合物浓度为8μm时，p-4ebp1的水平显著降低，该浓度下化合物对p-4ebp1水平的抑制率为64％。总体而言，低浓度时化合物对p-70s6k、p-4ebp1的调节略有差异，但是8μm时表现出明显的负调控作用，这也从侧面说明化合物存在对ampk的激活作用。上述机制研究表明，化合物通过激活ampk从而对a549的增殖发挥抑制作用，并且其激活效能优于阳性对照药a-769662。当前第1页12