具有细胞渗透性的Hg离子高灵敏可逆探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种具有细胞渗透性的hg离子高灵敏可逆探针及其制备方法和应用。

背景技术

由于产业迅猛发展及经营粗放，导致世界上许多地区的重金属污染已超出了常规的限制，这个问题很快得到人们的广泛关注。其中，汞(ii)离子由于其自身对巯基的强亲和力，容易导致大多数蛋白质和酶的功能障碍，因而成为人类健康的重大威胁之一。而且，由于其生物聚集性和不可降解性，这种污染物可以通过食物链积聚在人体内，即使在低浓度下也会引起大脑和神经系统受损、肾衰竭和认知障碍等有害疾病。因此，这种危害的严重性促使广大研究者们致力于开发汞离子探针，使其能应用在生物和环境传感和监控中。

由于荧光传感器可以定量检测重金属离子，因而是监测汞污染的有用工具。近年来，有大量的工作集中在开发各种基于荧光基团的传感器，例如罗萨明荧光团，半方酸菁荧光团和卟啉荧光团等。其中，基于罗丹明b的传感器是一种设计新颖的具有可逆化学特性的传感器。其金属诱导的开环过程在灵敏度，选择性和响应时间方面有着明显的光物理优势。但是，就像其他有机染料传感器一样，这种荧光传感器仍然需要克服重大挑战。例如：其水溶性差，导致大多数传感器需要水和有机溶剂的混合溶液。而且，由于有机染料的斯托克斯位移较窄，来自激发光的干扰也限制了它的应用。而荧光共振能量转移(fret)是克服这种离子化学传感的问题的有效工具之一。fret是被激发的施主和受主之间具有距离依赖性的相互作用，因而能帮助我们清楚地观察受主发射。而镧系元素螯合物由于其施主吸收和金属受主发射之间存在较宽的波长漂移，较长的发光寿命(微秒到毫秒)和特征性的尖峰形发光，因此在发光传感器方面具有很大的发展潜力。先前报道的一些基于yb(iii)的hg²⁺传感器ybpor-l也具有一些较高灵敏度和选择性的特征。但值得注意的是，传感器的发射虽然位于近红外光谱区，可以穿透生物组织，然而传感器的水溶性差，仅在有机溶剂中有响应，不能将其运用在活细胞或组织中。而且，由于在有机溶剂和缓冲液的混合溶液中，传感器的检测极限处于微摩尔级(10μm)，因而对于许多应用来说，这种传感器的灵敏度不高。另外，其还存在着可见响应信号的波长非常接近激发波长等缺点。这些缺点使传统的hg²⁺传感器不适用于活细胞中，促使了我们开发出更灵敏及具有生物相容性的hg²⁺荧光探针。

中国公开专利cn105486668a公开了一种基于罗丹明-噻吩衍生物的快速响应性hg²⁺显色-荧光探针的制备方法，其主要是用于水环境中复杂样品的测量，然而其并未报道适应于活细胞或组织中使用。

技术实现要素：

本发明主要提供了一种具有细胞渗透性的hg离子高灵敏可逆探针及其制备方法和应用，该探针具有快速检测响应，低检测限和可逆等特性，适用于生物应用。其技术方案如下：

一种含有yb³⁺配合物与罗丹明b感应单元组合而成的双通道传感器，所述传感器为探针rpyb001，探针结构中含有yb³⁺配合物、罗丹明b感应单元、二硫代甲酸酯片段和4-(苯基乙炔基)吡啶片段，rpyb001的结构式如式(a)所示：

式中：

(1)左侧部分为yb³⁺配合物，充当显示发射响应单元(nir)及特高化合物的水溶性；

(2)右侧部分包含了py、二硫代甲酸酯和罗丹明b片段，充当收集光子、能量传递、hg²⁺的“捕捉”单元以及显示发射响应(可见)。

本发明设计的双通道传感器rpyb001是基于yb³⁺配合物与罗丹明b感应单元组合设计而成。本发明制得的yb³⁺配合物是利用易进行取代的大环多胺作为yb³⁺阳离子的配位单元，因而具有优异的水溶性；二硫代甲酸酯部分充当hg²⁺的“捕捉”单元，此外，它还能触发罗丹明b单元的开环过程，从而使传感器具有高选择性和高灵敏度。本发明通过进行取代的4-(苯基乙炔基)吡啶(py)单元收集光子，并通过fret将能量传递至开环的罗丹明b和yb³⁺离子。这种新型传感器在hg²⁺存在下，能在可见光和近红外区域显示发射响应，形成rpyb001-hg复合物，所述rpyb001-hg复合物在巯基化合物存在下恢复形成低荧光的不含hg²⁺的rpyb001。可见光和近红外这两种发射通道都远离激发波长，具有快速检测响应，低检测限和可逆等特性，因此使其适用于生物应用。上述工作原理如下：

采用上述方案，本发明具有以下优点：

yb³⁺配合物具有优异的水溶性；二硫代甲酸酯部分充当hg²⁺的“捕捉”单元，hg²⁺被“捕捉”后，触使罗丹明b开环。而4-(苯基乙炔基)吡啶(py)单元被激发后，并通过fret将能量传递至开环的罗丹明b和yb³⁺离子，使其分别具有可见和近红外发射。由于hg²⁺对巯基化合物具有很高的结合能力，因此巯基将从rpyb001-hg复合物上剥离结合的hg²⁺，从而恢复低荧光的不含hg²⁺的传感器，使此探针具有可逆性。总而言之，这种新型传感器在hg²⁺存在下，能在可见光和近红外区域显示发射响应。这两种发射通道都远离激发波长，具有快速检测响应，灵敏度高和可逆等特性。

本发明的yb³⁺配合物和罗丹明b化合物rpyb001作为检测hg离子的荧光探针，可以选择性的与分析物汞离子反应，其灵敏度高，可逆性强。而且与传统的探测器相比，强荧光增强效应明显，并且具有更好的水溶性，能更好的应用在水或者血清之中，有效的实现了对汞离子的非破坏性的和快速的监测，因此其作为检测hg离子的荧光探针在生物医药学中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为rpyb001化合物的光谱图；

图2为rpyb001化合物的功能实施图；

图3为rpyb001化合物的细胞毒活性情况图；

图4为rpyb001化合物的细胞成像图。

具体实施方式

实施例1

(2-((吡咯烷-1-硫羰基)硫基)乙酰基)苯甲酸(化合物i-3)的制备过程及反应流程如下。

一、4-(2-溴乙酰基)苯甲酸甲酯(化合物i-1)的制备

在茄形瓶中加入4-乙酰基苯甲酸甲酯(5.00g，28.08mmol)，p-tsoh·h2o(8.01g，42.12mmol)和100mlmecn的溶液，随后加入nbs(5.22g，29.48mmol)。将反应物加热至85℃并搅拌4小时。析出固体后加入300ml水。用dcm(200ml×3)萃取混合物，然后用饱和nahco3水溶液(300ml)洗涤。用无水na2so4干燥得粗品，经柱层析分离纯化，用己烷/乙酸乙酯(4:1，v/v)作为洗脱剂，得到为白色固体产物4-(2-溴乙酰基)苯甲酸甲酯5.80g，产率80.3％(化合物i-1)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ＝8.15(d,j＝8.7hz,2h),8.04(d,j＝8.7hz,2h),4.47(s,2h),3.96(s,3h).¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ＝190.78,165.91,137.12,134.58,129.98,128.84,52.57,30.71。

二、4-(2-((吡咯烷-1-硫羰基)硫代)乙酰基)苯甲酸甲酯(化合物i-2)的制备

在4-(2-溴乙酰基)苯甲酸甲酯(化合物i-1)(4.00g，15.52mmol)和丙酮(120ml)的溶液中加入吡咯烷-1-二硫代磷酸铵(3.82g，23.27mmol)。将反应混合物在室温下搅拌8小时。析出固体后加入300ml水，然后用dcm(200ml×3)萃取，用盐水(100ml)洗涤并用无水na2so4干燥。析出固体后，通过硅胶色谱法用己烷/dcm(1:1，v/v)作为洗脱液纯化粗产物，得到白色固体副产物4-(2-((吡咯烷-1-硫羰基)硫代)乙酰基)苯甲酸甲酯4.52g，产率90.1％(化合物i-2)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.14(d,j＝1.6hz,4h),4.90(s,2h),3.96(s,3h),3.92(t,j＝7.0hz,2h),3.76(t,j＝6.9hz,2h),2.12(p,j＝6.9hz,2h),2.00(p,j＝6.9hz,2h).¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ＝193.18,190.65,166.15,139.40,134.11,129.87,128.47,55.56,52.50,50.83,44.30,26.16,24.37。

三、(2-((吡咯烷-1-硫羰基)硫基)乙酰基)苯甲酸(化合物i-3)的制备

将4-(2-((吡咯烷-1-硫羰基)硫代)乙酰基)苯甲酸甲酯(化合物i-2)(1.00g，3.10mmol)溶于20ml的thf溶液中，加入lioh·h2o(651mg，15.50mmol)的水溶液(4ml)，随后使用冰水浴，最终使反应混合物达到室温，并搅拌4小时。通过1m盐酸水溶液将ph调节至酸性范围，过滤沉淀，用水和dcm洗涤，然后真空干燥，得到白色固体产物(2-((吡咯烷-1-硫羰基)硫基)乙酰基)苯甲酸550mg，产率78.2％(化合物i-3)。¹hnmr(400mhz,dmso)δ＝13.36(s,1h),8.11(m,4h),4.96(s,2h),3.72(m,4h),2.13–2.00(m,2h),1.98–1.85(m,2h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ＝192.85,189.93,166.56,139.44,134.64,129.58,128.32,55.35,50.76,43.43,25.69,23.84。

实施例2

2，2'，2'-(1，4，7，10-四甲基-1，4，7-三基)三(n-(叔丁基)乙酰胺)(化合物ii-2)的制备过程及反应流程如下。

一、2-溴-n-(叔丁基)乙酰胺(化合物ii-1)的制备

向2-甲基丙-2-胺(12.43ml，82.72mmol)的250mldcm溶液中加入k2co3(37.8g，273.50mmol)，并使用冰水浴将反应混合物冷却至0℃。然后在0℃滴加2-溴乙酰溴(13.10ml，150.31mmol)。使反应混合物达到室温并搅拌6小时。然后用水(200ml)淬灭反应混合物并用dcm(3×200ml)萃取。将有机相合并，并用饱和nh4cl水溶液(200ml)和水(200ml)洗涤，经无水na2so4干燥。滤出固体，除去有机相溶剂，将所得固体真空干燥，最终得到白色固体产物2-溴-n-(叔丁基)乙酰胺24.25g，产率91.3％(化合物ii-1)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ6.29(s,1h),3.79(s,2h),1.38(s,9h).¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ164.35,51.92,29.89,28.40。

2、2，2'，2'-(1，4，7，10-四甲基-1，4，7-三基)三(n-(叔丁基)乙酰胺)(化合物ii-2)的制备

向1，4，7，10-四氮杂环十二烷(4.0g，23.22mmol)的ch3cn(150ml)溶液中加入nahco3(19.50g，232.20mmol)。在室温下滴加2-溴-n-(叔丁基)乙酰胺(化合物ii-1)(13.97g，72.50mmol)的150mlch3cn溶液。将反应混合物在室温下搅拌24小时，滤出的固体用ch3cn洗涤数次。将有机相合并，除去溶剂后得到淡黄色固体。将固体溶于250ml水中，并用1mnaoh水溶液将溶液的ph调节至8。水相用dcm(3×50ml)洗涤，然后用1mnaoh水溶液将溶液的ph调节至13，并用dcm(5×50ml)萃取。最后将有机相合并，除去溶剂，所得固体用水重结晶，真空干燥。最终得到白色固体产物2，2'，2'-(1，4，7，10-四甲基-1，4，7-三基)三(n-(叔丁基)乙酰胺)5.00g，产率42.3％(化合物ii-2)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.63(s,1h),7.54(s,2h),3.46(s,1h),3.01(s,4h),2.95(s,2h),2.63(s,8h),2.54(s,8h),1.27(s,9h),1.25(s,18h).¹³cnmr(101mhz,dmso-d6)δ＝169.94,169.86,58.19,57.19,52.44,51.96,50.46,50.01,49.83,46.08,28.63,28.58。

实施例3

4-乙炔基吡啶-2-基)甲醇(化合物iii-2)的制备过程及反应流程如下。

一、(4-((三甲硅基)乙炔基)吡啶-2-基)甲醇(化合物iii-1)的制备

向500ml烧瓶中加入(4-溴吡啶-2-基)甲醇(10.00g，53.12mmol)，pd(pph3)4(614mg，0.53mmol)和cui(202mg，1.06mmol)。加入250m的dcm和92.54ml的dipea(531.24mmol)，并将混合物用氮气鼓泡0.5h。随后滴加乙炔基三甲基硅烷(9.00ml，63.70mmol)。在室温和氮气下将该溶液搅拌15小时。加入250ml水并用dcm(250ml×3)萃取。将有机相合并，用无水na2so4干燥，过滤，并通过硅胶色谱法用己烷/乙酸乙酯(1:1-1:2，v/v)作为洗脱液纯化，最终得到所需黄色固体产物(4-((三甲硅基)乙炔基)吡啶-2-基)甲醇8.00g，产率73.3％(化合物iii-1)。¹hnmr(400mhz,dmso)δ＝8.48(d,j＝5.0hz,1h),7.43(s,1h),7.27(d,j＝5.0hz,1h),5.47(t,j＝5.9hz,1h),4.54(d,j＝5.9hz,2h),0.25(s,9h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ＝162.57,149.01,130.25,123.37,121.80,102.56,99.13,63.88,-0.39。

二、(4-乙炔基吡啶-2-基)甲醇(化合物iii-2)的制备

将(4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)吡啶-2-基)甲醇(化合物iii-1)(8.00g，38.96mmol)溶解于250mldcm中，滴加tbaf(14.26g，54.46mmol)的250mldcm溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时。随后加入350ml水并将内容物用dcm(500ml×3)萃取。将有机相合并，用无水na2so4干燥，过滤并通过硅胶色谱法用己烷/乙酸乙酯(2:1，v/v)作为洗脱液进行纯化，最终得到黄色固体产物(4-乙炔基吡啶-2-基)甲醇4.89g，产率94.3％(化合物iii-2)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ＝8.54(d,j＝5.1hz,1h),7.34(s,1h),7.27(d,j＝5.1hz,1h),4.76(d,j＝5.2hz,2h),3.65(t,j＝5.2hz,1h),3.30(s,1h).¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ＝159.38,148.55,131.00,124.75,122.92,81.96,80.89,64.00。

实施例4

本发明中最终产物rpyb001(化合物a)的制备过程及反应流程如下。

一、(4-((2-(羟基甲基)吡啶-4-基)乙炔基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(化合物iv-1)的制备

将(4-碘苯基)氨基甲酸叔丁酯(2.88g，9.01mmol)溶解在80mlthf的溶液中，加入dipea(13.08ml，75.10mmol)，pd(pph3)4(173mg，0.15mmol)，cui(57mg，0.30mmol)和(4-乙炔基吡啶-2-基)甲醇(化合物iii-2)(1.00g，7.51mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3天。加入100ml的水，并用dcm(100ml×3)萃取内容物。将有机相合并，用无水na2so4干燥，过滤，并通过硅胶色谱法用己烷/乙酸乙酯(2/1至1/1，v/v)作为洗脱液纯化，最终得到白色固体产物(4-((2-(羟基甲基)吡啶-4-基)乙炔基)苯基)氨基甲酸叔丁酯2.10g，产率86.2％(化合物iv-1)。

¹hnmr(400mhz，cdcl3)：δ8.53(d，j＝5.1hz1h),7.48(d，j＝8.7hz，2h),7.39(d,j＝8.7hz，2h)，7.34(s,1h)，7.28(d,j＝5.1hz，1h)，6.61(s，1h)，4.76(d,j＝4.1hz，2h)9h).¹³cnmr(101mhz,cdcl3)：δ159.14,152.31,148.48,139.43,132.90,132.40,124.15,122.18,118.08,116.14,94.26,86.08,81.14,64.05,28.31。

二、(4-((2-((4,7,10-三(2-(叔丁基氨基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)甲基)吡啶-4-基)-乙炔基)苯基)氨基甲酸甲酯(化合物iv-2)的制备

将(4-((2-(羟基甲基)吡啶-4-基)乙炔基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(化合物iv-1)(8；973mg，3.00mmol)和dipea(5.23ml，30.00mmol)溶解在150ml的无水dcm中，然后滴加mscl(0.70ml，9.00mmol)，将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后用dcm(100ml×3)萃取，用饱和nahco3水溶液(50ml)洗涤，并用无水na2so4干燥。残余物通过硅胶色谱法用dcm/乙酸乙酯(1/1，v/v)作为洗脱剂快速纯化。将得到的白色固体产物(1.11g，产率92.3％)立即用于下一步，将白色固体产物(1.05g，2.61mmol)和k2co3(2.77g，20.07mmol)溶解在acn(250ml)的溶液中，然后加入2，2'，2'-(1，4，7，10-四甲基-1，4，7-三基)三(n-(叔丁基)乙酰胺)(化合物ii-2)。将反应混合物在50℃下搅拌19小时。滤出固体，除去溶剂。将残余物通过洗脱液dcm/甲醇(50/1，v/v)后，使用中性al2o3进行色谱纯化，最终得到黄色固体产物(4-((2-((4,7,10-三(2-(叔丁基氨基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)甲基)吡啶-4-基)-乙炔基)苯基)氨基甲酸甲酯1.60g，两步产率90.0％(化合物iv-2)。¹hnmr(400mhz，dmso)：δ9.68(s，1h)，8.36(d，j＝5.1hz，1h)，7.83(s，2h)，7.65(s，1h)(d，j＝8.8hz，2h)，7.46(d，j＝8.8hz，2h)，7.36(d，j＝5.1hz，1h)，3.97-3.44(br，2h)，3.19-2.56，12h)，2.46-1.82(br，10h)，1.48(s，9h)，1.29(s，9h)，1.21(s，18h)。¹³cnmr(101mhz，dmso)：δ170.54,169.90,158.61,152.55,148.94,140.89,132.47,131.21,125.02,123.39,117.91,114.21,94.17,85.88,79.64,58.04,57.96,57.26,54.93,50.42,50.38,28.28,28.13,28.08。

三、2,2',2”-(10-((4-((4-氨基苯基)乙炔基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7(n-(叔丁基)乙酰胺)(化合物iv-3)的制备

将(4-((2-((4,7,10-三(2-(叔丁基氨基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)甲基)吡啶-4-基)乙炔基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(化合物iv-2)(1.00g，1.22mmol)溶解在meoh(30ml)溶液中，使用冰水浴加入6mhcl水溶液(30ml)。待反应混合物温度回升至室温后继续搅拌6小时。用1.0mnaoh水溶液将溶液的ph调节至9，将溶液用dcm(100ml×3)萃取，并将萃取的物质经无水na2so4干燥。除去溶剂，残余物经中性al2o3色谱纯化，用洗脱剂dcm/甲醇(50/1，v/v)进行纯化后，最终得到黄色固体产物2,2',2”-(10-((4-((4-氨基苯基)乙炔基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7(n-(叔丁基)乙酰胺)750mg，产率85.5％(化合物iv-3)。¹hnmr(400mhz，dmso)：δ8.31(d，j＝5.1hz，1h)，7.82(s，2h)，7.65(s，1h)，7.43(s，1h)，7.28(dd，，7.21(d，j＝8.6hz，2h)，6.56(d，j＝8.6hz，2h)，5.75(s，2h)，3.65(br，2h)，2.72(br，12h)，2.19(br，10h)，1.30(s，9h)，1.21(s，18h)。¹³cnmr(101mhz，dmso)：δ170.52,169.93,158.42,150.40,148.86,133.15,132.01,124.53,123.04,113.58,106.68,96.54,84.62,58.03,57.36,54.93,50.43,50.39,28.28,28.13。

四、2-氧代-2-(4-((4-((2-((4,7,10-三(2-(叔丁基氨基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-三四氮杂环十二烷-1-基)甲基)吡啶-4-基)乙炔基)苯基)氨基甲酰基)苯基)乙基吡咯烷-1-碳二硫酸盐(化合物iv-4)的制备

将(2-((吡咯烷-1-硫羰基)硫基)乙酰基)苯甲酸(化合物i-3)(172mg，0.56mmol)溶解在25ml无水mecn溶液中，然后加入dipea(0.24ml，1.39mmol)，edci(160mg，0.84mmol)和hobt(112mg，0.84mmol)。将反应混合物在室温下搅拌0.5小时，加入2,2',2”-(10-((4-((4-氨基苯基)乙炔基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7(n-(叔丁基)乙酰胺)(200mg，0.28mmol)(化合物iv-3)。将反应混合物在室温下再搅拌36小时。加入30ml水，用dcm(30ml×3)萃取，萃取剂用无水na2so4干燥。除去溶剂，残余物通过中性al2o3和dcm/甲醇(50/1，v/v)作为洗脱液色谱纯化，最终得到黄色固体产物2-氧代-2-(4-((4-((2-((4,7,10-三(2-(叔丁基氨基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-三四氮杂环十二烷-1-基)甲基)吡啶-4-基)乙炔基)苯基)氨基甲酰基)苯基)乙基吡咯烷-1-碳二硫酸盐164mg，产率58.6％(化合物iv-4)。¹hnmr(400mhz，dmso)：δ10.70(s，1h)，8.39(d，j＝5.0hz，1h)，8.19(d，j＝8.5hz，2h)，8.09(d，j＝8.5hz，2h)，7.91(d，j＝8.6hz，2h)，7.41(d，j＝2h)，3.73(m，6h)，2.66(m，12h)，2.39-1.87(m，14h)，1.30(s，9h)，1.22(s，18h)。¹³cnmr(101mhz，dmso):δ192.84,189.99,170.55,169.89,165.12,158.67,148.97,140.23,138.59,133.14,132.39,131.06,128.24,125.14,123.47,120.22,116.17,113.56,93.83,86.40,58.10,57.90,57.22,55.40,54.93,50.81,50.41,50.35,49.39,43.35,28.27,28.12,25.74,23.88。

五、2-(4-((2-((4,7,10-三(2-(叔丁基-氨基)-2-氧代乙基)-1,4,7-三氮杂-甲基)-吡啶-4-基)乙炔基)苯基)氨基甲酰基)苯基)乙基吡咯烷-1-二硫代甲酸酯(化合物iv-5)的制备

将2-氧代-2-(4-((4-((2-((4,7,10-三(2-(叔丁基氨基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-三四氮杂环十二烷-1-基)甲基)吡啶-4-基)乙炔基)苯基)氨基甲酰基)苯基)乙基吡咯烷-1-碳二硫酸盐(化合物iv-4)(230mg，0.23mmol)溶解于thf(12ml)12ml)中，然后加入水合肼(0.23ml)和乙酸(0.23ml)。将反应混合物加热回流并搅拌2小时。待混合物冷却后除去大部分溶剂。加入40ml的水和3ml的饱和nahco3水溶液，然后用dcm(30ml×3)萃取并用无水na2so4干燥。除去溶剂的残余物在dcm/甲醇(50/1，v/v)作为洗脱液色谱纯化，在中性al2o3上进行色谱分离，最终得到黄色固体产物2-(4-((2-((4,7,10-三(2-(叔丁基-氨基)-2-氧代乙基)-1,4,7-三氮杂-甲基)-吡啶-4-基)乙炔基)苯基)氨基甲酰基)苯基)乙基吡咯烷-1-二硫代甲酸酯128mg，产率54.9％(化合物iv-5)。¹hnmr(400mhz，dmso)：δ10.46(s，1h)，8.38(d，j＝5.1hz，1h)，7.92(m，4h)，7.83(s，2h)，7.75(d，hz，2h)，7.65(s,1h),7.61(s,1h),7.56(d,j＝8.7hz,2h),7.40(dd,j＝5.1,1.1hz,1h),7.32(s,2h),4.61(s,2h),3.71(m,6h),2.66(br,12h),2.40-1.80(m,14h),1.30(s,9h),1.22(s,18h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ189.99,170.54,169.88,165.43,158.65,148.96,141.07,140.54,135.79,132.66,132.33,131.10,127.92,125.10,124.25,123.45,120.05,115.76,93.94,86.27,58.07,57.87,57.21,55.56,50.59,50.40,50.34,29.34,28.26,28.11,25.57,23.73.

六、2-((3'，6'-二(二乙基氨基)-3-氧代螺[异吲哚啉-1,9'-x吨]-2-基)亚氨基)-2-(4-((4-((2-((4,7,10-三(2-(叔丁基氨基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)甲基)-吡啶-4-基)乙炔基)苯基)氨基甲酰基)苯基)乙基吡咯烷-1-二硫代碳酸酯(gb001，化合物iv-6)的制备

将罗丹明b(43mg，0.10mmol)和pocl3(0.20ml)在1,2-二氯乙烷(4ml)中回流5小时，然后除去溶剂。将获得的粗罗丹明b酰氯与三甲胺(0.30ml)和2-(4-((2-((4,7,10-三(2-(叔丁基-氨基)-2-氧代乙基)-1,4,7-三氮杂-甲基)-吡啶-4-基)乙炔基)苯基)氨基甲酰基)苯基)乙基吡咯烷-1-二硫代甲酸酯(化合物iv-5)(50mg，0.05mmol)混合，并在室温下搅拌12小时。加入10ml水后，用dcm(10ml×4)萃取，并用无水na2so4干燥，通过硅胶色谱法用dcm/meoh(100/1至50/1，v/v)进行纯化，最终得到红色固体产物gb00150mg，产率71.0％(化合物iv-6)。¹hnmr(400mhz，dmso)：δ10.51(s，1h)，8.38(d，j＝5.1hz，1h)，7.88(m，7h)，7.62(m，8h)，7.39(d，j＝5.81h)，7.20(d，j＝6.8hz，1h)，6.49(d，j＝8.8hz，2h)，6.43-6.27(m，4h)，4.73(s，2h)，3.74(m，4h)，3.31(q，8h)，2.71(br，14h)，2.33(br，8h)，2.00-1.77(br，6h)，1.30(s，9h)j＝6.9hz，12h)。¹³cnmr(101mhz,dmso):δ189.43,170.56,169.90,165.51,165.01,160.36,158.68,153.15,150.81,148.97,148.35,140.26,138.02,136.26,133.37,132.38,131.07,129.77,128.93,128.27,127.10,127.86,127.17,125.14,124.06,123.47,123.19,120.08,116.04,107.93,105.97,97.24,93.84,86.36,66.97,58.10,57.88,57.24,55.78,54.92,23.65,12.41。

七、rpyb001(化合物a)的制备

将gb001(化合物iv-6)(14mg，0.01mmol)溶解在1.0mlmeoh的溶液中，然后加入0.01mybcl3水溶液(1.05ml，0.0105mmol)，并将混合物在室温下搅拌24小时。除去溶剂，将残余物溶于2ml水中并用dcm(2ml×3)洗涤。除去水，将残余物进行真空干燥，最终得到紫色固体产物rpyb00115mg，产率83.3％(化合物a)。¹hnmr(400mhz,dmso):δ10.51(s,1h),8.38(d,j＝5.2hz,1h),7.95-7.76(m,7h),7.74-7.52(m,8h),7.39(d,j＝5.2hz,1h),7.20(d,j＝7.2hz,1h),6.49(d,j＝8.9hz,2h),6.42-6.27(m,4h),4.72(s,4h),3.74(s,8h),3.31-3.29(m,14h),2.65(d,j＝14.3hz,8h),2.28(d,j＝35.9hz,6h),1.89(dd,j＝21.8,6.3hz,9h),1.30(s,1h),1.18(d,j＝26.4hz,18h),1.08(7,j＝6.9hz,12h).hplcretentiontime:16.06min.

实施例5rpyb001的光谱特性

本发明人采用346nm波长的光激发本发明所述的化合物，在加入hg²⁺后，hepes缓冲液中的rpyb001(5μm)的可见荧光响应(λem＝596nm)和在ch3cn中rpyb001(10μm)的nir荧光响应(λem＝980nm)都得到大幅度的增强，因此可作为检测hg²⁺的指标。

实施例6rpyb001的实施特性

本发明人比对了rpyb001对不同金属离子/空白(空白；hg²⁺；cu²⁺；cu⁺；co²⁺；cd²⁺；ca²⁺；k⁺；li⁺；fe³⁺；fe²⁺；cs²⁺；mg²⁺；pb²⁺；sn²⁺；ni²⁺；al³⁺；na⁺)的检测能力。无论是hepes缓冲液中的rpyb001(5μm)的可见光荧光响应(λem＝596nm)还是ch3cn中的rpyb001(10μm)的nir荧光响应(λem＝980nm)，都只对hg²⁺离子有很强的增强作用。因此，本发明rpyb001化合物具有很强的选择性。

实施例7rpyb001的细胞毒活性情况

本发明人以人胚肺成纤维细胞(mrc-5)为作用对象，对rpyb001化合物进行体外细胞毒活性测定。取不同浓度的rpyb001化合物(0μm，1μm，5μm，10μm，50μm，100μm)，与mrc-5在暗室中作用24小时后，测定其细胞成活力情况。实验表明，浓度≤10μm时，其细胞成活率高达80％。因此，本发明rpyb001化合物在低浓度下未表现出明显毒性。

实施例8rpyb001的细胞成像

本发明人以mrc-5为作用对象，采用共聚焦成像技术对rpyb001化合物(5μm)的细胞成像及可逆性进行了研究。实验结果表明，在mrc-5中加入不同浓度的重金属hg²⁺离子(0μm，2.5μm，5μm，10μm)，从hg²⁺离子不存在的细胞中只能观察到微弱的红色荧光，一旦加入微量的hg²⁺离子就能观察到耀眼的红色荧光。当经过na2s处理后，由于s^2-基团与hg²⁺有很强的结合能力，能从rpyb001-hg复合物上剥离结合的hg²⁺，所以只能在此细胞中观察到微弱的发光。因此，rpyb001化合物细胞成像质量佳，同时还具有很高的灵敏性和可逆性。

对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。