本发明涉及一种酰胺类化合物及其合成方法和治疗癌症的用途。
背景技术：
肺癌是全球最常见、导致死亡人数最多的呼吸系统恶性肿瘤。据中国癌症统计报告，中国2015年有4.29×106例肺癌新发病例，2.81×106例肺癌死亡病例。其中，非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌病例的85％以上，死亡率高达80％～90％。非小细胞肺癌的药物治疗中，靶向治疗药物相对于传统细胞毒性药物，其可以更加精确地作用于肿瘤组织，大大减少了对周围正常组织的损伤，不仅降低了患者药物不良反应的发生率，还显著提高了抗击肿瘤的准确性。随着肿瘤分子生物学技术的发展与推进，靶向药物治疗成为了近年来肿瘤学界的研究热点之一。
EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)是上皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体。EGFR酪氨酸激酶抑制剂是近来抗肿瘤药物研发的兵家重地，世界各地有许多的跨国药企已经或正在投入大量人力财力在新型EGFR抑制剂的研究中。目前，EGFR酪氨酸激酶的抑制剂家族，正在往多靶点、非可逆型方向发展。早期研究及上市的可逆型EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗中，药物的耐药性已经引起人们的关注。患者在接受半年至一年的治疗后，约有一半患者出现了耐药现象。越来越多的迹象表明，研发新骨架类型的更加安全有效的非可逆型EGFR酪氨酸激酶抑制剂已不容缓。
AZD9291为阿斯利康研制，2015年12月FDA批准上市，适应症为本品适用于既往经表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗时或治疗后出现疾病进展，并且经检测确认存在EGFR T790M突变阳性的局部晚期或转移性非小细胞性肺癌(NSCLC)成人患者的治疗。突变选择性不可逆EGFR抑制剂，在肿瘤实验模型中显示期对EGFR-TKI敏感型及T790M耐药突变有效，对野生型EGFR有弱选择性。AZD9291目前已经有耐药性报道，AZD9291获得性耐药突变的机制包括：EGFR C797S突变，FGFR1扩增，HER2扩增，cMet扩增或MAPK旁路途径激活，组织学转变(部分转成小细胞肺癌)，或复合其它基因突变。
技术实现要素：
本发明提供了一种新结构类型的化合物，具体为如式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、溶剂化合物，
其中，R1、R2和R3各自独立的选自H、CH3或F。
所述的如式Ⅰ所示的化合物优选为：
本发明还提供了所述的如式Ⅰ所示的化合物的合成方法，其合成路线为：
其具体合成步骤为：
1)在无机碱的存在下，半胱氨酸(化合物1)与2-(氯甲基)-4,6-二氟苯并[d]噻唑(化合物2)发生反应生成含有硫醚键的S-((4,6-二氟苯并[d]噻唑-2-基)甲基)半胱氨酸(化合物3)；
2)在碱性条件下，化合物3中的氨基被(9H-芴-9-基)氯甲酸甲酯保护，生成N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-S-((4,6-二氟苯并[d]噻唑-2-基)甲基)半胱氨酸(化合物4)；
3)在酸性条件下，化合物4中的羧基与异恶唑-4-基胺中的氨基发生反应生成((3-(((4,6-二氟苯并[d]噻唑-2-基)甲基)硫基)-1-(异恶唑-4-基氨基)-1-氧代丙烷-2-甲酸(9H-芴-9-基)基)氨基甲酸酯(化合物5)；
4)在合适的溶剂中，化合物5在碱性条件下发生水解反应生成2-氨基-3-(((4,6-二氟苯并[d]噻唑-2-基)甲基)硫基)-N-(异恶唑-4-基)丙酰胺(化合物6)；
5)化合物6中的氨基与相应的酰氯反应生成对应的酰胺产物。
进一步地，所述步骤1)中的碱可以是氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化钙，氢氧化镁，优选氢氧化钠。
进一步地，所述步骤2)中的碱可以是碳酸钠，碳酸氢钠，碳酸钾，碳酸氢钾，优选碳酸钠。
进一步地，所述步骤3)中使用酸可以是甲磺酸，乙烷磺酸，丙烷磺酸，对甲苯磺酸，苯磺酸，对硝基苯磺酸等，优选对甲苯磺酸。
进一步地，所述步骤4)中水解反应溶剂可以是哌啶，乙睛，2,2,2-三氟乙烷-1-醇，优选哌啶。
本发明还提供了所述的如式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐作为EGFR酪氨酸激酶抑制剂的应用。
本发明还提供了所述的如式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐在治疗癌症药物中的应用。所述癌症可以选自非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、子宫内膜癌、前列腺癌、白血病、胃癌、肝癌、胃肠间质瘤、甲状腺癌、急性髓细胞性白血病、鼻咽癌、胆管癌中的任一种。
本发明还提供了一种药物组合物，包含如式Ⅰ所示的化合物和/或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体。
本发明的化合物可与药学上各种常用添加剂(如稀释剂和赋形剂等)制成药物组合物。根据治疗目的，可将药物组合物制成各种类型的给药单位剂型，如片剂、丸剂、粉剂、液体、悬浮液、乳液、颗粒剂、胶囊、栓剂和针剂(溶液及悬浮液)等。
为了使片剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知的并广泛使用的赋形剂。例如，载体，如乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素和硅酸等；粘合剂，如水、乙醇、丙醇、普通糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明教溶液，羧甲基纤维素、紫胶、甲基纤维素和磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，如干淀粉、藻酸钠、琼脂粉和海带粉，碳酸氢钠、碳酸钙、聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘酯、淀粉和乳糖等；崩解抑制剂，如白糖、甘油三硬脂酸酯、椰子油和氢化油；吸附促进剂，如季胺碱和十二烷基硫酸钠等；润湿剂，如甘油、淀粉等；吸附剂，如淀粉、乳糖、高岭土、膨润土和胶体硅酸等；以及润滑剂，如纯净的滑石，硬脂酸盐、硼酸粉和聚乙二醇等。如果需要的话，还可以用通常的涂渍材料使片剂作为糖衣片剂、涂明胶膜片剂、肠衣片剂、涂膜片剂、双层膜片剂及多层片剂。
为了使丸剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知的并广泛使用的赋性剂，例如，载体，如乳糖，淀粉，椰子油，硬化植物油，高岭土和滑石等；粘合剂，如阿拉伯树胶粉，黄著胶粉，明胶和乙醇等；崩解剂，如琼脂和海带粉等。
为了使栓剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知并广泛使用的赋性剂，例如，聚乙二醇，椰子油，高级醇，高级醇的酯，明胶和半合成的甘油酯等。
为了制备针剂形式的药物组合物，可将溶液和悬浮液消毒，并最好加入适量的氯化钠，葡萄糖或甘油等，制成与血液等渗压的针剂。在制备针剂时，也可使用本领域内任何常用的载体。例如，水，乙醇，丙二醇，乙氧基化的异硬脂醇，聚氧基化的异硬脂醇和聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯等。此外，还可加入通常的溶解剂、缓冲剂和止痛剂等。根据需要，在治疗精神分裂症期间，也可加入着色剂、防腐剂、香料、调味剂、香化剂和其它药物等。
本发明中，所述的药物组合物的给药方法没有特殊限制。可根据病人年龄、性别和其它条件及症状，选择各种剂型的制剂给药。例如，片剂、丸剂、溶液、悬浮液、乳液、颗粒剂和胶囊是口服给药；针剂可以单独给药，或者和注射用输送液(如葡萄糖溶液及氨基酸溶液)混合进行静脉注射，如有必要可以单纯用针剂进行肌肉、皮内、皮下或腹内注射；栓剂为给药到直肠。
本发明中，可以根据服药方法、病人年龄、性别和其它条件以及症状适当地选择用药剂量。
具体实施方式
实施例1：3-(((4,6-二氟苯并[d]噻唑-2-基)甲基)硫基)-2-((噻吩-2-基)甲酰氨基)-N-(异恶唑-4-基)丙酰胺的合成
1、S-((4,6-二氟苯并[d]噻唑-2-基)甲基)半胱氨酸的合成
将半胱氨酸(化合物1)(4.85g，0.04mol)溶于2mol/L的NaOH(80mL)溶液中，然后在冰浴条件下加入2-(氯甲基)-4,6-二氟苯并[d]噻唑(化合物2)(13.18g，0.06mol)，然后将混合物溶液在室温下搅拌至均匀。使用乙酸调节pH＝5，产生大量固体沉淀，然后过滤并用水洗涤，得到S-((4,6-二氟苯并[d]噻唑-2-基)甲基)半胱氨酸(化合物3)，9.74g，产率80％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.89(s,1H),2.02(s,1H),2.90(dd,1H),3.15(dd,1H),4.02(t,1H),4.45(s,2H),7.34(t,1H),7.80(d,1H).13C-NMR(125MHz,CDCl3)δ:30.56,33.43,56.03,104.03,112.59,137.51,138.68,156.01,158.07,159.06,173.56.LC-MS(ESI,pos,ion)m/z:305[M+H]。
2、N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-S-((4,6-二氟苯并[d]噻唑-2-基)甲基)半胱氨酸的合成
将化合物3(9.74g，0.032mol)和(9H-芴-9-基)氯甲酸甲酯(8.80g，00.34mol)加入到10％的Na2CO3(35mL)水溶液和新蒸馏的乙醇(30mL)的混合物中，并将反应搅拌64小时。加入水(80mL)后，反应混合物用乙醚洗涤3次。用HCl小心地将水层酸化至pH＝3，并将所得含有沉淀物的体系在4℃冷却过夜，过滤并用冷水洗涤。得到棕褐色固体N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-S-((4,6-二氟苯并[d]噻唑-2-基)甲基)半胱氨酸(化合物4)，11.51g，产率68.3％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:2.89(m,1H),3.14(m,1H),3.95(t,1H),4.42(s,2H),5.15-5.21(m,3H),5.26(s,1H),7.23(t,2H),7.33(t,3H),7.64(d,2H),7.79(d,1H),7.89(d,2H).13C-NMR(125MHz,CDCl3)δ:30.56,32.36,48.95,56.36,66.63,104.03,112.59,120.89,125.07,126.18,127.52,137.51,138.68,139.81,143.41,156.01,158.07,158.48,159.06,174.84.LC-MS(ESI,pos,ion)m/z:527[M+H]。
3、((3-(((4,6-二氟苯并[d]噻唑-2-基)甲基)硫基)-1-(异恶唑-4-基氨基)-1-氧代丙烷-2-甲酸(9H-芴-9-基)基)氨基甲酸酯的合成
将化合物4(11.51g，0.022mol)，异恶唑-4-基胺(11.85g，0.022mol)和对甲苯磺酸(～0.40g)的悬浮液置于装有机械搅拌器，油浴和Dean-Stark冷凝器的圆底烧瓶中，将反应混合物加热回流(内部温度150-155℃，油浴温度170-180℃)15-18小时，同时通过TLC监测反应。反应完成后，将反应物冷却至80℃，通过滴液漏斗缓慢加入甲醇(27mL)，滴加完毕后，使反应混合物在搅拌下缓慢冷却至室温，过滤得到的固体并用甲醇(45mL)洗涤，并在100-120℃下干燥2小时，得到白色固体((3-(((4,6-二氟苯并[d]噻唑-2-基)甲基)硫基)-1-(异恶唑-4-基氨基)-1-氧代丙烷-2-甲酸(9H-芴-9-基)基)氨基甲酸酯(化合物5)，9.26g，产率71％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:2.90(m,1H),3.15(m,1H),4.02(t,1H),4.49(s,2H),5.10(d,2H),5.21(s,1H),5.35(t,1H),7.24(t,2H),7.34(t,3H),7.43(d,2H),7.80(d,1H),7.90(d,2H),8.28(s,1H),9.74(s,1H).13C-NMR(125MHz,CDCl3)δ:30.56,32.17,48.95,53.75,66.63,104.03,112.59,118.36,120.89,125.07,126.18,127.52,137.51,138.68,139.81,143.41,151.21,152.81,156.01,158.07,158.48,159.06,168.93.LC-MS(ESI,pos,ion)m/z:593[M+H]。
4、2-氨基-3-(((4,6-二氟苯并[d]噻唑-2-基)甲基)硫基)-N-(异恶唑-4-基)丙酰胺的合成
将化合物5(9.26g，0.016mol)溶于CHCl3(25.0mL)中，并加入哌啶(44mL，0.48mol)。将反应混合物搅拌24小时，真空蒸发除去挥发物。通过柱色谱法(SiO2；DCM/MeOH＝10:1)纯化混合物，得到微黄色油状物2-氨基-3-(((4,6-二氟苯并[d]噻唑-2-基)甲基)硫基)-N-(异恶唑-4-基)丙酰胺(化合物6)，4.03g，产率68％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:2.08(s,1H),2.88(m,1H),3.13(m,1H),3.65(s,1H),4.41(s,2H),4.72(t,1H),7.30(t,1H),7.76(d,1H),7.90(s,1H),9.90(s,1H).13C-NMR(125MHz,CDCl3)δ:30.56,34.13,53.90,104.03,112.59,118.36,137.51,138.68,151.21,152.81,156.01,158.07,159.06,169.83.LC-MS(ESI,pos,ion)m/z:371[M+H]。
5、3-(((4,6-二氟苯并[d]噻唑-2-基)甲基)硫基)-2-((噻吩-2-基)甲酰氨基)-N-(异恶唑-4-基)丙酰胺的合成
将化合物6(4.03g，0.011mol)加入到无水乙醇(25.0mL)中，然后逐渐加入(噻吩-2-基)甲酰氯(0.017mol)，搅拌升温至反应回流。约6小时后反应完毕，TLC监测反应终点。将反应液静置冷却后，抽滤，并用少量无水乙醇洗涤滤饼，得到白色固体产物3-(((4,6-二氟苯并[d]噻唑-2-基)甲基)硫基)-2-((噻吩-2-基)甲酰氨基)-N-(异恶唑-4-基)丙酰胺，4.49g，产率85％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:2.88(m,1H),3.12(m,1H),4.69(s,2H),5.09(t,1H),7.20(t,1H),7.34(td,1H),7.80(dd,1H),7.98(dd,1H),8.17(s,1H),8.30(dd,1H),8.45(s,1H),9.65(s,1H).13C-NMR(125MHz,CDCl3)δ:30.56,32.17,53.09,104.03,112.59,118.36,122.93,126.97,128.8,137.51,138.68,142.12,151.21,152.81,156.01,158.07,159.06,164.38,168.93.LC-MS(ESI,pos,ion)m/z:481[M+H]。
实施例3：3-(((4,6-二氟苯并[d]噻唑-2-基)甲基)硫基)-2-((5-甲基-噻吩-2-基)甲酰氨基)-N-(异恶唑-4-基)丙酰胺的合成
将化合物6(4.03g，0.011mol)加入到无水乙醇(25.0mL)中，然后逐渐加入(5-甲基-噻吩-2-基)甲酰氯(0.017mol)，搅拌升温至反应回流。约6小时后反应完毕，TLC监测反应终点。将反应液静置冷却后，抽滤，并用少量无水乙醇洗涤滤饼，得到白色固体产物3-(((4,6-二氟苯并[d]噻唑-2-基)甲基)硫基)-2-((5-甲基-噻吩-2-基)甲酰氨基)-N-(异恶唑-4-基)丙酰胺，4.57g，产率84％。LC-MS(ESI,pos,ion)m/z:495[M+H]。
实施例3：3-(((4,6-二氟苯并[d]噻唑-2-基)甲基)硫基)-2-((5-氟-噻吩-2-基)甲酰氨基)-N-(异恶唑-4-基)丙酰胺的合成
将化合物6(4.03g，0.011mol)加入到无水乙醇(25.0mL)中，然后逐渐加入2-(5-氟-噻吩-2-基)乙酰氯(2.93g，0.017mol)，搅拌升温至反应回流。约6小时后反应完毕，TLC监测反应终点。将反应液静置冷却后，抽滤，并用少量无水乙醇洗涤滤饼，得到白色固体产物3-(((4,6-二氟苯并[d]噻唑-2-基)甲基)硫基)-2-((5-氟-噻吩-2-基)甲酰氨基)-N-(异恶唑-4-基)丙酰胺，4.88g，产率89％。LC-MS(ESI,pos,ion)m/z:499[M+H]。试验例部分：
测试1：Exon19缺失EGFR(激活单突变体)细胞磷酸化测试
将人肺细胞系PC9(Exon19缺失EGFR)维持在含有10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI 1640中。使细胞在有5％CO2的加湿培养箱中于37℃生长。将40μL细胞播种(10000细胞/孔)于Coming黑色透明底384孔板中的生长培养基中，于37度下在5％CO2中培养过夜。使用Echo555声波定剂量，将100％DMSO中连续稀释的化合物加至细胞。将培养板再培养2小时，轻柔混合培养基之后，将40μL裂解缓冲液添加到各孔中。将Greiner黑色高结合力384孔板用捕捉抗体覆盖，然后用3％BSA进行封闭。接着去除封闭液，将15μL裂解液转移到Greiner黑色高结合力384孔板中，培养2小时。轻柔混合和用PBS清洗培养板之后，添加20μL检测抗体，培养2小时。轻柔混合和用PBS清洗培养板之后，添加20μL QuantaBlu荧光过氧化物酶底物，培养1小时。将20μL QuantaBlu终止溶液添加到培养板中，在采用352nm激发波长和460nm发射波长的Envision微孔板检测仪读出荧光。将各化合物获得的数据输入合适的软件包以执行曲线拟合分析。基于此数据并通过计算获得50％效果所需的化合物浓度来确定IC50值。
测试2：L858R/T790M EGFR(双突变体)细胞磷酸化测试
将人肺细胞系NCI-H1975维持在含有10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI1640中。使细胞在有5％CO2的加湿培养箱中于37℃生长。将40μL细胞播种(10000细胞/孔)于Coming黑色透明底384孔板中的生长培养基中，于37度下在5％CO2中培养过夜。使用Echo555声波定剂量，将100％DMSO中连续稀释的化合物加至细胞。将培养板再培养2小时，轻柔混合培养基之后，将40μL裂解缓冲液添加到各孔中。将Greiner黑色高结合力384孔板用捕捉抗体覆盖，然后用3％BSA进行封闭。接着去除封闭液，将15μL裂解液转移到Greiner黑色高结合力384孔板中，培养2小时。轻柔混合和用PBS清洗培养板之后，添加20μL检测抗体，培养2小时。轻柔混合和用PBS清洗培养板之后，添加20μL QuantaBlu荧光过氧化物酶底物，培养1小时。将20μL QuantaBlu终止溶液添加到培养板中，在采用352nm激发波长和460nm发射波长的Envision微孔板检测仪读出荧光。将各化合物获得的数据输入合适的软件包以执行曲线拟合分析。基于此数据并通过计算获得50％效果所需的化合物浓度来确定IC50值。
测试3：野生型EGFR细胞磷酸化试验
将人结肠细胞系LoVo保存在含有3％剥离的胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI1640中。使细胞在有5％CO2的加湿培养箱中于37℃生长。将40μL细胞播种(10000细胞/孔)于Corning黑色透明底384孔板中的生长培养基中，于37度下在5％CO2中培养过夜。使用Echo555声波定剂量，将100％DMSO中连续稀释的化合物加至细胞。将培养板再培养2小时，轻柔混合培养基之后，将40μL裂解缓冲液添加到各孔中。将Greiner黑色高结合力384孔板用捕捉抗体覆盖，然后用3％BSA进行封闭。接着去除封闭液，将15μL裂解液转移到Greiner黑色高结合力384孔板中，培养2小时。轻柔混合和用PBS清洗培养板之后，添加20μL检测抗体，培养2小时。轻柔混合和用PBS清洗培养板之后，添加20μL QuantaBlu荧光过氧化物酶底物，培养1小时。将20μL QuantaBlu终止溶液添加到培养板中，在采用352nm激发波长和460nm发射波长的Envision微孔板检测仪读出荧光。将各化合物获得的数据输入合适的软件包以执行曲线拟合分析。基于此数据并通过计算获得50％效果所需的化合物浓度来确定IC50值。
实验结果见下表：
由上表可知，表中所列化合物对Exon19缺失EGFR(激活单突变体)细胞和L858R/T790M EGFR(双突变体)细胞均具有很好的活性，相比野生型EGFR细胞具有更好的选择活性，而且本发明化合物选择性优于AZD9291。由此可以推知，本发明化合物可以作为癌症治疗药物进行开发，尤其在非小细胞肺癌中可能具有突出的优势。