本发明属于植物基因工程领域,涉及一个大豆e3泛素连接酶家族基因gmrnf1a的应用。
背景技术
果实发育和成熟是高等植物生长发育过程中的重要环节,与作物的产量和农产品质量关系紧密,进而影响经济效益.适时的荚开裂有利于收集种子,过早的开裂或不开裂都会影响农产品的收获。在大豆收获时,荚的开裂是影响大豆产量的一个重要因素。本实验室王婷婷(2016)通过gmagl1筛选大豆荚cdna文库，发现了一些能够与gmagl1相互作用的蛋白。其中一个互作蛋白glyma15g42250.1(v2.0版本基因号glyma.15g268100.1)属于e3泛素连接酶家族，含有ring-finger结构域，可能参与调节蛋白质的泛素化降解。ring-finger类e3泛素连接酶在泛素系统中主要负责识别特异性靶蛋白和e2泛素结合酶。glyma15g42250在本论文中命名为gmrnf1a，gmrnf1a能够与gmagl1相互作用，表明gmagl1有可能是gmrnf1a特异性靶蛋白，因此初步研究gmrnf1a的生物学功能。
gmrnf1a属于e3泛素连接酶家族，e3s是决定底物特异性的关键因素，迄今为止在植物中共发现四种主要类型的e3，并且根据它们的作用机制和亚基组成分类：hect、ring、u-box和cullin-ringligases(crls)。ring或u-boxe3连接酶是一类含有ring-finger或u-box结构域的单亚基e3，ring或u-box结构域负责结合e2泛素结合酶，并促进泛素分子从e2转移到靶蛋白上。ringe3s是一个数目众多的蛋白家族，广泛存在于酵母到动植物的所有真核生物中。在拟南芥基因组中有超过400个基因编码ringe3s，在水稻基因组中有超过400个基因编码ringe3s，大豆基因组中有超过700个基因编码ringe3s。ring-finger结构域是指70个氨基酸中的8个氨基酸残基(cys和his)通过与锌离子螯合作用形成c3h2c2(ring-h2)或c3h1c4(ring-hc)构型。植物中许多关键的生化过程，如形态发生、抗虫抗病等生物胁迫、盐碱等非生物胁迫、自交不亲和性、激素合成和信号传导、光形态建成及花的生长发育等都涉及蛋白的降解过程。ringe3s的功能也较为广泛，ling等(2012)发现拟南芥sp1编码一种ringe3泛素连接酶，能够通过ups来调控叶绿体的发育。wang等(2015)发现烟草ntrcp1，在生殖芽顶点的表达水平要比营养芽顶点高很多。与野生型相比，过表达ntrcp1植株表现从营养期到生殖期更快速的过渡并且开花时间显著提前，植株的顶端分生组织(sam)过早起始花序原基的发育。过表达ntrcp1的烟草by-2悬浮细胞促进细胞分裂，因为细胞周期的g2期明显缩短。serrano等(2006)发现拟南芥中atl(arabidopsistóxicosenlevadura)家族基因编码ring-h2类e3s，含有91个成员，其中atl4、atl6、atl8和atl10与植株的育性相关。zhang等(2007)发现拟南芥sdir1受到干旱和盐胁迫的诱导表达。干旱条件下sdir1在气孔保卫细胞和叶肉细胞中高表达，过表达提高了植株的气孔关闭程度及耐旱性。尽管e3泛素连接酶数目众多，但是不同的e3泛素连接酶在生物功能上发挥的作用不完全相同，因而，新的e3泛素连接酶基因的功能仍需进一步的实验验证。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供公开一个大豆e3泛素连接酶家族基因gmrnf1a的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现:
大豆gmrnf1a蛋白编码基因gmrnf1a在通过基因工程手段调控拟南芥角果成熟进程和调控荚果开裂时间中的应用；所述的大豆gmrnf1a蛋白编码基因gmrnf1a，其核苷酸序列为：seqidno.1。
过表达大豆gmrnf1a蛋白编码基因gmrnf1a加快拟南芥角果成熟进程，并且提早荚果开裂。通过抑制大豆gmrnf1a蛋白编码基因gmrnf1a的表达，抑制拟南芥果荚提早炸裂。
含有大豆gmrnf1a蛋白编码基因gmrnf1a的重组表达载体在通过基因工程手段调控拟南芥角果成熟进程和调控荚果开裂时间中的应用；所述的大豆gmrnf1a蛋白编码基因gmrnf1a，其核苷酸序列为：seqidno.1。
过表达大豆gmrnf1a蛋白编码基因gmrnf1a加快拟南芥角果成熟进程，并且提早荚果开裂。通过抑制大豆gmrnf1a蛋白编码基因gmrnf1a的表达，抑制拟南芥果荚提早炸裂。
使用gmrnf1a构建植物表达载体时,在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选,可对所用植物表达载体进行加工,如加入可在植物中表达的选择性标记基因(gus基因、gfp基因等)或者抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物、潮霉素标记物等)的抗性基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型性状筛选转化植株。
携带有本发明gmrnf1a的植物表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织,并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物,也可以是烟草、拟南芥、大豆、油菜、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等双子叶植物。
有益效果:
本发明中gmrnf1a属于e3泛素连接酶类的ring家族，含有ring-finger和zincribbon结构域。通过组织表达分析发现gmrnf1a主要在花和荚中表达，亚细胞定位显示gmrnf1a蛋白主要定位于细胞质中。利用植物过表达载体pmdc83-gmrnf1a,将本发明的gmrnf1a导入植物体内,可以调控植株裂荚情况，获得转基因植株。拟南芥中过表达gmrnf1a，发现与对照相比，转基因拟南芥的角果成熟速率加快，并且提早开裂。转基因拟南芥千粒重统计分析表明gmrnf1a转基因株系与对照相比能够显著提高种子的千粒重。本发明公开了该基因在调控植株荚果发育的效用，减少植株裂荚现象的发生。可以通过定向地改造作物的裂荚时间,为农作物提高产量。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
图1gmrnf1a基因的克隆
根据phytozome网站预测的gmrnf1a序列信息设计引物，以willmas82盛花期的花cdna为模板pcr扩增，得到一条长774bp的dna片段。经过测序结果分析，该片段的序列信息与phytozome网站预测的序列一致，即该774bp片段即为gmrnf1a基因。其中marker为2kplus，从下往上依次为100，250，500，750，1000，2000，3000和5000bp。
图2gmrnf1a基因的组织表达分析。
采用实时荧光定量pcr技术对gmrnf1a在大豆willmas82的不同组织表达进行研究，大豆不同组织分别为根、茎、叶、花、7d荚、15d荚、25d荚、35d荚、45d荚、种子。
图3gmrnf1a的亚细胞定位
(a)d35s::gfp；(b)d35s::gmrnf1a-gfp；
图4转基因拟南芥的pcr鉴定。
1-13为不同的转基因株系；wt为野生型拟南芥(阴性对照)；p：为pmdc83-gmrnf1a重组质粒(阳性对照)。
图5gmrnf1a在不同转基因拟南芥株系中的相对表达量
15-2，15-6，15-7，15-8为不同的转基因株系，wt为野生型拟南芥。
图6转基因拟南芥和野生型拟南芥果荚成熟进程比较
a：与野生型拟南芥(右)相比，转基因拟南芥(左)果荚成熟进程明显加快；b和c：转基因拟南芥果荚提早开裂(左)，对照(右)未开裂。
图7转基因拟南芥千粒重统计分析
2,6,7,8为不同的转基因株系，wt为野生型拟南芥。*表示0.01<p<0.05水平下显著差异；**表示p<0.01水平下极显著差异；
图8gmrnf1a下游相关基因在转基因拟南芥和野生型植株中的表达分析。
具体实施方式
下面结合附图和实施例,并参照数据进一步详细地描述本发明。这些实施例只是为了举例说明本发明,而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中,未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物,均在首次出现时标明,其后所用相同引物,均以首次标明的内容相同。
实施例1大豆gmrnf1a及其编码基因的克隆与鉴定
根据phytozome网站预测的gmrnf1a序列信息设计引物，以willmas82盛花期的花cdna为模板pcr扩增。
上游引物gmrnf1a-f：ggatcttccagagatgcttcttcacttcttccattctcc；(seqidno.3)
下游引物gmrnf1a-r：ctgccgttcgacgatccttattgtaaacgtcgttatcagc。(seqidno.4)
应用rt-pcr方法，从大豆花器官总rna中扩增gmrnf1a基因。取大豆花组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mlep管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mlep管中，采用植物总rna提取试剂盒(tiangendp404)进行总rna提取。用甲醛变性胶电泳鉴定总rna质量，然后在分光光度计上测定rna含量。以获得的总rna为模板,按照takara公司提供的反转录试剂盒的说明书进行反转录，合成cdna第一链。进行pcr扩增反应。pcr反应体系为:2μlcdna(0.05μg)、上、下游引物各2μl(10μm)、25μl2×phantamaxbuffer、1μldntp(10mm)和1uphantamaxsuper-fidelitydna聚合酶(vazyme),用超纯水补足50μl。pcr程序如下：在bio-radptc200型pcr仪上进行,其程序为94℃预变性3min；94℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸45s,共30个循环；然后72℃延伸5min终止反应，4℃保存。pcr产物回收将其克隆至pgem-teasy载体，测序后获得具有完整编码区的大豆基因gmrnf1a的cdna序列seqidno.1，全长702bp，编码seqidno.2所示的233个氨基酸。
实施例2gmrnf1a在大豆不同器官中的表达特征
提取willmas82根、茎、叶、花、7d荚、15d荚、25d荚、35d荚、45d荚、种子的rna，反转成cdna进行rt-pcr分析。
总rna的提取同实施例1。以大豆组成型表达基因tubulin为内参基因，其扩增引物为tubulin正向引物序列:ggagttcacagaggcagag(seqidno.5)，tubulin反向引物序列:cacttacgcatcacatagca(seqidno.6)。以来自大豆不同组织或器官的cdna为模板，进行实时荧光定量pcr分析。gmrnf1a的扩增引物为:gmrnf1a-qpcr-f:ccgtggatagaactcaactcg(seqidno.7),gmrnf1a-qpcr-r:gtcctgagcccgtagaaatc(seqidno.8)。结果(图2)分析表明gmrnf1a在花和荚中的表达相对较高，尤其在结荚后期(25d荚、35d荚、45d荚)，表明gmrnf1a可能与大豆花荚发育相关。
实施例3gmrnf1a的亚细胞定位
亚细胞定位采用拟南芥原生质体瞬时表达的方法，使用的载体是pan580，引物为gmrnf1a-an-f:aagtccggagctagctctagatggcggcgacggcgacg(seqidno.9)，gmrnf1a-an-r:gcccttgctcaccatggatccgcaagccgaatcgccgcca(seqidno.10)。pcr扩增，目的条带正确后进行割胶回收，胶回收产物通过同源重组的方法连接到载体上，构建亚细胞定位载体pan580-gmrnf1a(基因在gfp的n端)，拟南芥原生质体瞬时表达后暗培养16h，经激光共聚焦显微镜(zeiss，lsm780)激光照射后，可产生绿色荧光信号，对蛋白质进行定位，观察拍照。结果如图3-5所示，转入空载质粒在整个细胞中都有分布，gmrnf1a：gfp融合蛋白也分布于整个细胞中，表明gmrnf1a没有明确的细胞器定位，也没有与叶绿体自发红色荧光融合，表明gmrnf1a可能在细胞质中发挥功能。
实施例4gmrnf1a的基因工程应用
利用gateway方法构建载体，分为bp反应和lr反应两步，引物序列为：f:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatggcggcgacggcgacg(seqidno.11)r:ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcagcaagccgaatcgccgcca(seqidno.12)bp反应将目的片段连接到入门克隆载体pdonor221上，lr反应将入门载体上的基因连接到表达载体pmdc83中，即得表达载体pmdc83-gmrnf1a，转化大肠杆菌dh5α,转化液涂布于含50mg/l潮霉素的lb固体培养基上筛选阳性克隆。经测序验证后,提取质粒,得到pmdc83-gmrnf1a植物过量表达载体,用冻融法将pmdc83-gmrnf1a转入根癌农杆菌菌株eha105中。将pmdc83-gmrnf1a通过农杆菌株eha105的介导转化拟南芥,在含有50mg/l潮霉素的ms培养基上培养,初步筛选得到具有潮霉素抗性的转基因植株。
提取初步筛选得到具有潮霉素抗性的转基因拟南芥的基因组dna,使用基因特异性引物gmrnf1a-bp-f:gatagaactcaactcgtcgtgtc(seqidno.13),和gmrnf1a-bp-r:tgaagaagatggtcctctcctg(seqidno.14)进行pcr鉴定。能够扩增出约为702bp大小条带的为阳性转基因拟南芥(图3)。选择pcr鉴定为阳性的植株,以gmrnf1a-qpcr-fccgtggatagaactcaactcg(seqidno.7)和gmrnf1a-qpcr-rgtcctgagcccgtagaaatc(seqidno.8)为引物,进行实时荧光定量pcr检测。结果表明gmrnf1a可在转基因拟南芥中表达(图4)。将pcr、实时荧光定量pcr检测均为阳性的转基因植株命名为35s::gmrnf1a转基因拟南芥。
对35s::gmrnf1a转基因拟南芥进行表型观察。在25℃、长日照的生长条件下,与对照相比，35s::gmrnf1a转基因拟南芥与对照相比，转基因拟南芥的角果成熟速率加快，并且提早开裂(图6)。转基因拟南芥千粒重统计分析表明gmrnf1a转基因株系与对照相比能够显著提高种子的千粒重(图7)。为了进一步探究转gmrnf1a基因拟南芥表型出现的原因，我们利用实时荧光定量pcr检测了gmrnf1a下游相关基因的表达。以拟南芥组成型表达基因actin为内参基因(seqidno.15；seqidno.16)，研究gmrnf1a下游基因在拟南芥中的同源基因的表达情况，设计特异引物，进行实时荧光定量。at2g37640.1与glyma.04g123900.1同源，编码细胞松弛因子；引物序列为(seqidno.17；seqidno.18)；at2g40480.1与glyma.11g235600.2同源，编码蛋白能促进叶绿体在高强蓝光下的移动，引物序列为(seqidno.19；seqidno.20)；at5g65590.1与glyma.01g021100.1同源，编码dof转录因子，引物序列为(seqidno.21；seqidno.22)；at3g13540.1与glyma.08g025600.1同源，编码核输入蛋白亚基β1，引物序列为(seqidno.23；seqidno.24)；at1g13280.1与glyma.18g280900.1，编码丙二烯氧化物酶，引物序列为(seqidno.25；seqidno.26)；at2g03710.1与glyma.05g018900.1同源，at3g02310.1与glyma.19g034500.1同源，它们都是sep家族转录因子，引物序列分别为(seqidno.27；seqidno.28；seqidno.29；seqidno.30)；at5g32440.1与glyma.13g159500.1同源，编码cue蛋白,引物序列为(seqidno.31；seqidno.32)。结果显示：在gmrnf1a转基因株系6，7和8中，这些基因大部分是上调表达或者与对照没有显著差异,其中sep家族成员at2g03710.1和与at3g02310.1与对照相比，转录水平变化不大。at2g40480.1和at1g13280.1在所有株系中均比对照有显著提高，剩余的4个基因在有的转基因株系中很明显的上调表达，有些株系中却变化不显著。
序列表
<110>南京农业大学
<120>一个大豆e3泛素连接酶家族基因gmrnf1a的应用
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