一种人类MTHFR基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种人类mthfr基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术：
人类亚甲基四氢叶酸还原酶(mthfr，5,10-methylenetetrahydrofolatereductase，亚甲基四氢叶酸还原酶)基因位于第一号染色体1p36.3，共有12个外显子，编码656个氨基酸残基组成的蛋白，mthfr是参与叶酸循环代谢的一个重要酶，与dna的合成甲基化等相关，主要作用是将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸。叶酸是一种b族维生素，是细胞分裂合成dna时不可缺少的成分，叶酸的临床功能除了预防胎儿神经管缺陷外，还能降低孕妇妊娠高血压、自发性流产和胎儿宫内发育迟缓、早产以及新生儿低出生体重等发病率。编码mthfr的基因位点突变对酶的活性和热稳定性产生影响。该基因最常见的两个单核苷酸多态性677c>t和1298a>c，在中国发生率分别为45.2％和18.6％。mthfr677c>t突变可造成其编码的氨基酸由丙氨酸变成缬氨酸，引起耐热性和酶活性下降，杂合mthfr677ct酶活性下降30％，纯合677tt酶活性下降65％以上。mthfra1298c突变引起编码的氨基酸由谷氨酸转变为丙氨酸，也会导致酶活性下降，但下降程度比mthfrc677t突变轻微，文献报道与高同型胱氨酸血症无直接途径障碍，导致血液中叶酸浓度降低，人体缺乏叶酸可引起巨幼红细胞性贫血以及白细胞减少症，还会导致身体无力、易怒、没胃口以及精神病症状。目前临床上主要采取以下四种方式检测mthfr基因的多态性：1.pcr-测序法2.高分辨率溶解曲线法3.芯片杂交法4.taqman-qpcr法pcr-测序法灵敏度低，实验耗时长，不适合临床推广；芯片杂交法，检测灵敏度低并且特异性差，容易出现假阳性结果；高分辨率溶解曲线法对设备要求特殊，不适合临床推广，且检测灵敏度不高。taqman-qpcr法，检测灵敏度高，但往往由于位点序列原因，导致检测特异性不高，并且其通过genotyping方法进行分型，对样本数量和多态性分布有一定要求，不适合检测突变频率过低的位点。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种人类mthfr基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。本试剂盒具有高灵敏度、高特异性、低成本高通量、操作简便、实验周期短等特点，可以快速精准的对人类基因组dna中mthfr基因多态性进行检测。为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种人类mthfr基因多态性检测引物组，所述引物组由普通的外引物和带荧光标签的特异性的arms引物组成，具体序列如下：mthfr677-f1：5'-ctctcctgactgtcatccctat-3'seqidno.1mthfr677-f2：5'-fam-aagatacattgatgagggagtcg-3'seqidno.2(特异识别突变模板)mthfr677-r1：5'-gcggaagaatgtgtcagcct-3'seqidno.3mthfr677-r2：5'-vic-atcccttgtcatcgtatcgcgtc-3’seqidno.4(特异识别野生模板)mthfr1298-f1：5'-agagcaagtcccccaaggag-3'seqidno.5mthfr1298-f2：5'-fam-aagatacattgatgatgaagcaag-3'seqidno.6(特异识别突变模板)mthfr1298-r1：5'-ccgagaggtaaagaacgaagact-3'seqidno.7mthfr1298-r2：5'-vic-atcccttgtcatcgtcactttct-3’seqidno.8(特异识别野生模板)内控f：5’-cgggacctgactgactacct-3’seqidno.9内控r：5’-ggccatctcttgctcgaagt-3’seqidno.10。一种人类mthfr基因多态性检测探针组，所述探针组由特异性taqman-mgb探针和携带淬灭基团的锁核酸探针组成，具体序列如下：内控-p：5’-rox-accaccacggccgagc-mgb-bhq-3’seqidno.11野生型淬灭基团锁核酸：5’-bhq-acgatgacaagggat-3’seqidno.12突变型淬灭基团锁核酸：5’-bhq-tcatcaatgtatctt-3’seqidno.13。一种人类mthfr基因多态性检测试剂盒，所述试剂盒由分别用于扩增mthfr基因rs1801133、mthfr基因rs1801131位点的pcr预混反应液、阳性对照品及阴性对照品组成；所述pcr预混反应液的具体组分如下：(1)用于扩增mthfr基因rs1801133位点的pcr预混反应液：所述用于扩增mthfr基因rs1801133位点的引物、引物序列如seqidno：1～4所示，用于内控的引物序列、序列如seqidno：9～10所示，所述探针组、序列如seqidno：11～13所示，以及pcr反应液组成；(2)用于扩增mthfr基因rs1801131位点的pcr预混反应液：所述用于扩增mthfr基因rs1801131位点的引物，引物序列如seqidno：5～8所示；用于内控的引物序列，序列如seqidno：9～10所示；所述探针组，序列如seqidno：11～13所示；以及pcr反应液组成；所述阳性对照品包括：mthfr基因rs1801133位点野生型质粒、mthfr基因rs1801133位点突变型质粒、mthfr基因rs1801131位点野生型质粒、mthfr基因rs1801131位点突变型质粒及内参基因质粒dna；所述阴性对照品包括不包含内标基因和目的基因位点的重组质粒。上述方案中，所述pcr预混反应液中，探针组内taqman-mgb探针的浓度为50～100nm，携带淬灭基团的锁核酸探针的浓度均为100～400nm；用于扩增各位点的不带荧光基团的各引物浓度均为100～400nm，带荧光基团的各引物浓度均为50～100nm；用于内控的引物的浓度均为100～400nm。上述方案中，所述pcr反应液包括premixqpcrmix和te缓冲液。上述方案中，所述阴性对照品由puc-19质粒空载体和te缓冲液组成。上述检测试剂盒在制备用于检测人类mthfr基因多态性产品中的应用，具体地应用方式如下：采用人类mthfr基因多态性检测试剂盒检测人类mthfr基因多态性的过程，具体包括如下步骤：(1)采用基因组dna提取试剂盒提取待测人外周血的基因组dna作为待检测样本；(2)荧光定量检测：向反应管中加入pcr预混反应液和待测样本dna；同时设置阳性对照组和阴性对照组，然后将反应管置于荧光pcr仪进行pcr扩增反应，并采集fam、vic和rox荧光信号；(3)pcr扩增反应结束后，根据所采集的荧光信号起线情况进行结果判定。上述方案中，步骤(1)中将所述待检测样本dna稀释到浓度为0.1～100ng/μl，再进行pcr扩增反应。上述方案中，步骤(2)中所述pcr扩增反应的条件为：95℃1分钟预变性；15个循环：95℃5秒，61℃32秒，不收集荧光；30个循环：95℃5秒，61℃32秒，收集荧光。上述方案中，步骤(3)中所述结果判定的原则为(如下表3所示)：①当阳性对照组均有fam、vic、rox荧光信号起线，阴性对照组均无fam、vic、rox荧光起线，待检测样本有rox荧光信号起线时，判定实验成功，可以进行后续分型判定；②根据检测样本的fam、vic荧光信号判断mthfr基因rs1801133的分型：vic荧光信号起线mthfr基因rs1801133位点分型为纯合野生型；fam荧光信号起线，mthfr基因rs1801133位点分型为纯合突变型；vic、fam荧光信号均起线，mthfr基因rs1801133分型为杂合突变型；③根据检测样本的fam、vic荧光信号判断mthfr基因rs1801131的分型：vic荧光信号起线，mthfr基因rs1801131位点分型为纯合野生型；fam荧光信号起线，mthfr基因rs1801131位点分型为纯合突变型；vic、fam荧光信号均起线，mthfr基因rs1801131位点分型为杂合突变型。本发明所述人类mthfr基因多态性检测试剂盒的检测原理如图2和图3所示，携带fam荧光的带有标签序列的arms引物可特异性识别并扩增突变基因型的模板，并且随着引物的消耗，将更多的fam荧光释放出来，在循环结束时，采集各通道荧光，生成荧光曲线；携带vic荧光的带有标签序列的arms引物可特异性识别并扩增野生基因型的模板，并且随着引物的消耗，将更多的vic荧光释放出来，在循环结束时，采集各通道荧光，生成荧光曲线。内控探针采用mgb探针，特异性识别内控相应序列，通过扩增，越来越多的rox荧光被释放出来。所以当检测的基因组模板是纯合野生型，最终显示只有内控(rox)和野生(vic)荧光曲线可以正常起线且曲线呈s型，突变(fam)荧光曲线不起线，或起线很低且不呈s型。当检测的基因组模板是纯合突变型，最终显示只有内控(rox)和突变(fam)荧光曲线可以正常起线且曲线呈s型，野生(vic)荧光曲线不起线，或起线很低且不呈s型。当检测的基因组模板是杂合子，最终显示有内控(rox)、突变(fam)和野生(vic)荧光曲线均可以正常起线且曲线呈s型。本发明的有益效果如下：本发明所述人类mthfr基因多态性检测试剂盒可以简单快速的检测人类mthfr基因多态性分型，采用arms引物结合特异性荧光标签进行pcr反应实现了每个基因的多态性分型只需通过一个多重pcr反应即可完成，每个pcr反应中均含有内控，保证检测结果的准确性，防止假阴性和假阳性结果的出现；每个pcr反应体系中携带fam或vic荧光的带标签arms引物可以被相应带有淬灭基团的锁核酸锁定使荧光处于淬灭状态，pcr反应过程中，携带fam或vic荧光的带标签arms引物与待检测基因模板特异性结合后释放荧光生成荧光曲线进行结果判读；本发明利用携带荧光基团和标签序列的特异性arms引物结合携带淬灭基团的锁核酸序列、特异性的内控探针、和特异性的内控引物，可以大大提高基因分型的特异性和准确性；同时，两条外引物f1和r1也可以进行扩增，进一步富集基因组模板，可以大大提高分型效率，进而可以检测到更低浓度的基因组样本，本发明所述试剂盒最低可对0.1ng基因组dna进行多态性检测；此外，本发明所述试剂盒采用预混合的方式进行包装，使用时仅需加入基因组dna，同时简化了pcr的反应程序，可在1小时内完成阿司匹林抵抗基因多态性的检测，可直接根据荧光曲线进行结果判读，判读结果简便客观，便于分析。附图说明图1为临床上mthfr基因位点多态性及其发生频率。图2为本发明所述试剂盒的检测原理示意图。图3为本发明所述试剂盒的检测原理示意图。图4mthfr基因rs1801133位点纯合野生型检测结果。图5mthfr基因rs1801133位点杂合型检测结果。图6mthfr基因rs1801133位点纯合突变型检测结果。图7mthfr基因rs1801131位点纯合野生型检测结果。图8mthfr基因rs1801131位点杂合型检测结果。图9mthfr基因rs1801131位点纯合突变型检测结果。具体实施方式为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。实施例1制备本发明的mthfr基因检测试剂盒一、引物设计和合成：mthfr基因rs1801133位点、mthfr基因rs18011312个位点每个体系中包含6条引物；其中两条正义链上游引物f1和f2，两条反义链下游引物r1和r2，f1和r1为普通引物，f2和r2为带荧光基团和标签序列的特异性arms引物，通过引物和pcr反应条件筛选，保证引物对f1r1对模板进行富集，而f2和r1，f1和r2可正常扩增出带荧光的特定基因型pcr产物；同时，基因位点中加入内参引物。具体序列如下：mthfr677-f1：5'-ctctcctgactgtcatccctat-3'seqidno.1mthfr677-f2：5'-fam-aagatacattgatgagggagtcg-3'seqidno.2(特异识别突变模板)mthfr677-r1：5'-gcggaagaatgtgtcagcct-3'seqidno.3mthfr677-r2：5'-vic-atcccttgtcatcgtatcgcgtc-3’seqidno.4(特异识别野生模板)mthfr1298-f1：5'-agagcaagtcccccaaggag-3'seqidno.5mthfr1298-f2：5'-fam-aagatacattgatgatgaagcaag-3'seqidno.6(特异识别突变模板)mthfr1298-r1：5'-ccgagaggtaaagaacgaagact-3'seqidno.7mthfr1298-r2：5'-vic-atcccttgtcatcgtcactttct-3’seqidno.8(特异识别野生模板)内控f：5’-cgggacctgactgactacct-3’seqidno.9内控r：5’-ggccatctcttgctcgaagt-3’seqidno.10。具体的组合如下：其中seqidno.1和seqidno.4用于扩增mthfr基因位点677cdna片段，扩增产物为126bp，seqidno.2和seqidno.3用于扩增mthfr基因位点677tdna片段，扩增产物为71p，seqidno.1和seqidno.3对两种基因型均进行扩增；其中seqidno.5和seqidno.8用于扩增mthfr基因位点1298adna片段，扩增产物为84bp，seqidno.6和seqidno.7用于扩增mthfr基因位点1298cdna片段，扩增产物为57bp，seqidno.5和seqidno.7对两种基因型均进行扩增；seqidno.9和seqidno.10用于扩增内控dna片段，扩增产物为186bp；二、探针设计和合成：mthfr677、mthfr1298两个位点反应体系中包含2条特异性带淬灭基团的锁核酸探针和1条内参特异性mgb探针，2条特异性带淬灭基团的锁核酸探针其中一条用于锁定检测野生型的带vic荧光基团和标签序列的特异性arms引物，另一条用于锁定检测突变型的带fam荧光基团和标签序列的特异性arms引物；内参特异性mgb探针用于识别内参位点。具体序列如下：内控-p：5’-rox-accaccacggccgagc-mgb-bhq-3’seqidno.11野生型淬灭基团锁核酸：5’-bhq-acgatgacaagggat-3’seqidno.12突变型淬灭基团锁核酸：5’-bhq-tcatcaatgtatctt-3’seqidno.13。具体的组合如下：其中seqidno.11特异性识别内参位点；seqidno.12特异性识别并锁定检测野生型的带vic荧光基团和标签序列的特异性arms引物；seqidno.13特异性识别检测突变型的带fam荧光基团和标签序列的特异性arms引物。三、pcr预混反应液配置mthfr基因rs1801133位点c677tpcr预混反应液：由用于扩增mthfr基因rs1801133位点的特异性引物，引物序列如seqidno：1～4所示；内控引物，引物序列如seqidno：9～10所示；探针组，核苷酸序列如seqidno：11～13所示；pcr反应液组成，具体成分如下表1：表1mthfr基因rs1801133位点c677tpcr反应液试剂组成组分配比premixqpcrmix25μlseqidno.1100～400nmseqidno.250～100nmseqidno.3100～400nmseqidno.450～100nmseqidno.9100～400nmseqidno.10100～400nmseqidno.1150～100nmseqidno.12100～400nmseqidno.13100～400nmte缓冲液补足至30μlmthfr基因rs1801131位点a1298cpcr预混反应液：由用于扩增mthfr基因rs1801131位点的特异性引物，引物序列如seqidno：5～8所示；内控引物，引物序列如seqidno：9～10所示；探针组，核苷酸序列如seqidno：11～13所示；pcr反应液组成，具体成分如下表2：表2mthfr基因rs1801131位点a1298c反应液试剂组成组分配比premixqpcrmix25μlseqidno.5100～400nmseqidno.650～100nmseqidno.7100～400nmseqidno.850～100nmseqidno.9100～400nmseqidno.10100～400nmseqidno.1150～100nmseqidno.12100～400nmseqidno.13100～400nmte缓冲液补足至30μl四、对照品配置mthfr677阳性对照品：浓度各为10^4copy/μl的mthfr基因rs1801133位点野生型质粒、mthfr基因rs1801133位点突变型质粒、mthfr基因rs1801131位点野生型质粒、mthfr基因rs1801131位点突变型质粒及内参基因质粒dna和te缓冲液。所述质粒序列为本领域人员所熟知，此处不再一一列举其序列。阴性对照品：puc-19质粒空载体和te缓冲液。五、组装试剂盒试剂盒包含2管分别检测mthfr677和mthfr1298基因位点多态性的pcr预混反应液，2管阳性对照品，1管阴性对照品。计算20人份规格的使用量，配制各管中的成分并组装。实施例2使用实施例1中制备的人类mthfr基因多态性检测试剂盒对待测样本进行检测。本实施例收集100例edta抗凝静脉全血样本，提取基因组dna，使用人类mthfr基因多态性检测试剂盒检测mthfr677和mthfr1298基因多态性情况，具体操作过程如下：(1)血液样本基因组dna提取：使用商品化提取试剂盒进行基因组dna提取，提取完成后使用te缓冲液洗脱dna，并测定dna浓度；将基因组dna稀释到20ng/μl；(2)荧光定量检测：向反应管中加入30μlpcr预混反应液和20μl待测样本dna；pcr反应程序为：95℃5分钟预变性；15个循环：95℃5秒，61℃32秒，不收集荧光；30个循环：95℃5秒，61℃32秒，收集荧光。(3)pcr反应结束后按照表3，进行结果判读。表3结果判读mthfrrs1801133位点c677tfam(-t)vic(-c)rox(内控)cc(纯合野生型)–++ct(杂合突变型)+++tt(纯合突变型)+–+mthfrrs1801131位点a1298cfam(-c)vic(-a)rox(内控)aa(纯合野生型)–++ac(杂合突变型)+++cc(纯合突变型)+–+注:“+”代表detarn终点荧光值>100,000，且扩增曲线呈s型；“-”代表detarn终点荧光值<100,000，或曲线非s型；判读结果如下：mthfr基因rs1801133位点677纯合野生样本37例，其中一个检测结果如图4所示；mthfr基因rs1801133位点677杂合样本46例，其中一个检测结果如图5所示；mthfr基因rs1801133位点677纯合突变样本17例，其中一个检测结果如图6所示；mthfr基因rs1801131位点1298纯合野生样本71例，其中一个检测结果如图7所示；mthfr基因rs1801131位点1298杂合样本25例，其中一个检测结果如图8所示；mthfr基因rs1801131位点1298纯合突变样本4例，其中一个检测结果如图9所示；上述100例样本荧光定量检测结果与测序结果100％一致。以上结果表明，本试剂盒用于人类mthfr基因多态性检测结果可靠，但本发明试剂盒检测灵敏度远高于测序法。采用本发明所述试剂盒检测人类mthfr基因多态性的检测方法具有灵敏度高、特异性高、操作简便、结果可靠等优点，此外本发明简化了pcr的反应程序，将常规pcr反应中的退火和延伸步骤(退火30秒延伸1分钟)简化为一个步骤(仅需61度反应32秒)所以可在1小时内完成检测，并且本发明可直接根据荧光曲线进行结果判读，结果直观，判读简便。实施例3使用实施例1制备的试剂盒检测验证本试剂盒的最低检测线，具体包括如下操作步骤：(1)使用实施例2中已知mthfr基因rs1801133位点和rs1801131相应位点基因型的样本，每个位点分别选取野生型基因组、突变型基因组和杂合型基因组样本各一例，将上述样本稀释至10ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.25ng/μl、0.1ng/μl、0.05ng/μl、0.025ng/μl、0.001ng/μl；(2)荧光定量检测：向反应管中加入30μlpcr预混反应液和20μl待测样本dna；pcr反应程序为：95℃1分钟预变性；15个循环：95℃5秒，61℃32秒，不收集荧光；30个循环：95℃5秒，61℃32秒，收集荧光；每个样本的每个浓度梯度均重复检测20次；(3)pcr反应结束后按照表1，进行结果判读；(4)统计上述样本各个浓度梯度的检测成功率(分型与已知基因型一致即为检测成功，检测成功率＝检测结果一致结果数量/20×100％)，见表4和5。表4mthfr基因rs1801133位点检测成功率统计表5mthfr基因rs1801131位点检测成功率统计上述结果显示，本发明可对浓度低至0.1ng/μl的dna样本进行人类mthfr基因多态性检测。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。序列表<110>武汉康录生物技术股份有限公司<120>一种人类mthfr基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用<160>13<210>1<211>22bp<212>dna<213>人工序列＜400＞1ctctcctgactgtcatccctat22<210>2<211>23bp<212>dna<213>人工序列＜400＞2aagatacattgatgagggagtcg23<210>3<211>20bp<212>dna<213>人工序列＜400＞3gcggaagaatgtgtcagcct20<210>4<211>23bp<212>dna<213>人工序列＜400＞4atcccttgtcatcgtatcgcgtc23<210>5<211>20bp<212>dna<213>人工序列＜400＞5agagcaagtcccccaaggag20<210>6<211>24bp<212>dna<213>人工序列＜400＞6aagatacattgatgatgaagcaag24<210>7<211>23bp<212>dna<213>人工序列＜400＞7ccgagaggtaaagaacgaagact23<210>8<211>23bp<212>dna<213>人工序列＜400＞8atcccttgtcatcgtcactttct23<210>9<211>20bp<212>dna<213>人工序列＜400＞9cgggacctgactgactacct20<210>10<211>20bp<212>dna<213>人工序列＜400＞10ggccatctcttgctcgaagt20<210>11<211>16bp<212>dna<213>人工序列＜400＞11accaccacggccgagc16<210>12<211>15bp<212>dna<213>人工序列＜400＞12acgatgacaagggat15<210>13<211>15bp<212>dna<213>人工序列＜400＞13tcatcaatgtatctt15当前第1页12