sacB介导的绿针假单胞菌遗传操作方法与流程

本发明涉及一株生防菌遗传操作方法，特别是一种sacb介导的绿针假单胞菌遗传操作方法。

背景技术：

假单胞菌(pseudomonasspp.)是活跃在植物根际的一类微生物，属内许多菌株有防治植物病害、促进植株生长的作用，属植物根围促生细菌(plantgrowth-promotingrhizobacteria，pgpr)类。绿针假单胞菌(pseudomonaschlororaphis)属于假单胞菌科，假单胞菌属，菌体为杆状，大小为0.3μm-0.8μm×1.0μm-1.1μm，单极生鞭毛，在普通细菌培养基上能产生橙色色素，具有一般假单胞菌共有的生化特性。该菌对多种植物有控病促生作用、能增强植物抗逆性、对环境友好、对生物无致病性(choetal.,2008；dilfuza,2012；raioetal.,2011；susanaetal.,2012)。其中有的菌株已开发为商用生防产品，如瑞士bioagriab公司研制的基于绿针假单胞菌的生防药剂cedomon，主要用于大麦和燕麦种子处理，可防治苗期多种真菌病害(latouretal.,2009)。目前，国际上研究报道较多的是利用绿针假单胞菌防治真菌和卵菌病害。

生防相关基因及基因簇的深入研究对于揭示绿针假单胞菌的生防机制和生产应用具有重要的科学价值，因此需要简单和高效的遗传操作技术来实现相关基因的突变，揭示基因功能。目前在细菌中应用比较多的基因突变策略有3种：目的基因的插入突变体系、转座子介导的基因突变体系和无标记基因的缺失突变体系。前两种突变体系均会引入一个抗生素基因，可能会带来极性化影响，混淆因抗生素造成的突变表型和目的基因突变造成的表型。无标记的缺失突变体系中自杀性载体整合到细菌染色体中进行双交换，其中需要负选择标记来筛选双交换子。目前已陆续发现了很多负选择标记基因，如sacb，lacy、phes等。其中sacb基因介导的无标记基因的缺失突变体系一般可以把双交换的同源重组分两步来进行，双交换的重组子可能恢复为野生型，也可能是突变体，经过菌落pcr验证就能够获得正确的突变体。

一个成功突变体系的建立，外源的重组质粒能否顺利导入受体细胞中是一个很关键的因素。外源dna向受体细菌转移主要有三种方式：化学转化、电转化和接合转移。大肠杆菌主要采用电转化法和cacl2法(化学转化)将外源dna导入受体细胞中，需要制备相应的感受态细胞，目前该技术比较成熟。但是对于其他种属细菌来说，由于个体之间生化性质差异很大，制备感受态细胞的条件需要大量实验去摸索，有时都很难建立成功。接合转移又可称为两亲交配、两亲结合等，是指通过细菌细胞之间的直接接触导致dna从一个细胞转移至另一个细胞的过程，这个过程通常由接合型质粒来完成。一般来说，接合转移效率高于电转化和化学转化。在接合转移过程中，酶切体系各成分的参数比、连接体系各成分的参数比、大肠杆菌化学感受态细胞的制备条件(热击时间、冰浴时间等)、两亲交配时菌株处理温度、时间、加入量等参数至关重要，直接影响转化成功与否和转化效率。目前在黄单胞菌、链霉菌、荧光假单胞菌的遗传操作中已经建立了很好的两亲交配体系来进行dna的转移(邹丽芳，博士论文，南京农业大学，2007年)，由于不同种属细菌生化性质差别很大，遗传转化条件各异，目前绿针假单胞菌还未见两亲交配遗传操作的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有的绿针假单胞菌遗传转化难题，提供一种高效、稳定的sacb介导的绿针假单胞菌遗传操作方法，本发明是这样实现的：

(1)选取目标基因两端的旁侧序列，利用软件分别设计前端旁侧序列的上游引物f1、前端旁侧序列的下游引物下游引物r2、后端旁侧序列的上游引物f2、后端旁侧序列的下游引物r2，每个引物5’端加上与接合型自杀质粒多酶切位点相匹配的限制性酶切位点，以ctab法快速提取绿针假单胞菌(氨苄青霉素抗性，amp)的基因组dna作为模板进行梯度pcr扩增，用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段大小，pcr产物用试剂盒进行纯化回收，获得上游旁侧序列扩增片段和下游旁侧序列扩增片段。

目前，利用软件设计目标序列引物为本领域常规技术，如利用bioxm、daman、primerexpress、perlprimer等常见软件设计目标序列引物，相关引物设计方法可参见文献“基于windows的核酸序列分析软件的开发”黄骥等，《生物信息学》，2004”或其他文献。

上述设计限制性内切酶位点同样为本领域常规技术，该酶切位点一般与步骤(2)接合型自杀质粒携带的多酶切位点匹配即可，常见酶切位点如hindiii、kpni、ecori、xbai等位点。

上述旁侧序列为根据实际情况选取，一般不超过1000bp为宜。

(2)将步骤(1)的上游旁侧序列扩增片段、下游旁侧序列扩增片段、接合型自杀质粒分别进行相应的限制性双酶切，酶切产物用试剂盒进行纯化回收(具体纯化步骤参见试剂盒说明书)，获得上游旁侧序列回收产物、下游旁侧序列回收产物和接合型自杀质粒回收产物。

上述接合型自杀质粒可选择任何本领域常见的接合型自杀质粒，如接合型自杀质粒pex18(庆大霉素抗性，gm)；

限制性酶切体系为本领域常规设计，如100μl酶切体系：相应的限制性内切酶各5μl，buffer10μl，dna扩增片段(上游旁侧序列扩增片段、下游旁侧序列扩增片段、接合型自杀质粒中的一种)15μl，ddh2o补足100μl；37℃恒温水浴1h。

在具体实施中，也可以使用本领域其他常规的双酶切体系，如(参见文献：

“secgisrequiredforantibioticactivitiesofpseudomonassp.yl23againsterwiniaamylovoraanddickeyachrysanthemi”youzhouliu等，《journalofbasicmicrobiology》，2015)。

如实施例中以对绿针假单胞菌上pvds基因为目标基因，选用引物f1、r1、f2和r2的核苷酸序列依次如seqidno.1-seqidno.4所示，在具体实施中，也可以选择其他目标基因或其他上下游引物序列。

(3)将步骤(2)的回收产物进行连接，构建携带融合基因的重组质粒；

10μl连接反应体系：上游旁侧序列回收产物1μl，下游旁侧序列回收产物1μl，t4buffer1μl，t4dna连接酶0.5μl，接合型自杀质粒回收产物2μl，ddh2o补足10μl，16℃恒温水浴过夜。

(4)将步骤(3)中10μl连接体系加入100μl大肠杆菌dh5α化学感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，随后42℃水浴热击60s，冰浴150s，加入800μl新鲜的lb液体培养基，37℃，180rpm摇床中培养1h，6000rpm离心3min，保留约100μl上清，其余弃掉，轻轻吹打悬浮菌体，吸取100μl悬浮菌液用灭菌涂布棒涂在相应的gm50+x-gal100μg/ml的lb平板上，37℃静置培养约24h，进行蓝白斑筛选，挑选长出的白色单菌落，利用引物f1和r2进行菌落pcr验证，用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段大小，如果片段长度与融合基因片段长度一致，表明转化试验正确。

上述大肠杆菌dh5α化学感受态细胞参见文献：“一种改进大肠杆菌dh5α转化效率的方法”杜红旗等，《安徽农业科学》，2009。

(5)将步骤(4)中验证正确的白色单菌落转接到加入50μg/mlgm的5mllb液体培养基中，37℃、220rpm摇床培养10-14h，取750μl菌液和750μl50％甘油混匀于2ml离心管中，液氮速冻，-70℃保存；剩余菌液用试剂盒提取重组质粒，用1％琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒的浓度和大小，如果浓度大于50ng/μl，重组质粒大小≈空质粒+融合基因片段，表明转化试验正确。

(6)将10μl重组质粒加入事先制备好的100μl大肠杆菌s17-1化学感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30-40min，随后42℃水浴热击60-90s，冰浴150-180s，加入800μl新鲜的lb液体培养基于上述体系中，37℃，180rpm摇床中培养1h，6000rpm离心3min，保留约100-150μl上清其余弃掉，轻轻吹打悬浮菌体，吸取100μl悬浮菌液用灭菌涂布棒涂在相应的gm50+x-gal100μg/ml的lb平板上，37℃静置培养约24h，进行蓝白斑筛选，挑选蓝色单菌落，利用引物f1和r2进行菌落pcr验证，用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段大小，如果片段长度与融合基因片段长度一致，表明转化试验正确；

大肠杆菌s17-1化学感受态细胞制备方法参见文献：“铜绿假单胞菌感应分子对照质粒及整合突变株的构建，马睿等，《上海交通大学学报》，2006”。

(7)用灭菌牙签蘸取步骤(6)pcr验证正确的蓝色单菌落于5mllb液体培养基中，37℃，180rpm摇床中过夜培养，即为携带重组质粒的大肠杆菌液，备用；然后用接种环挑取绿针假单胞菌(氨苄青霉素抗性，amp)菌苔于5mllb液体培养基中，28℃，180rpm摇床中过夜培养，即为野生型绿针假单胞菌液，备用；然后取携带重组质粒的大肠杆菌液和绿针假单胞菌液各取2ml于2个离心管中，6000rpm离心3min，分别弃上清液收集菌体；用1mllb液体培养基分别将两种菌体悬浮，6000rpm离心3min，弃上清液收集菌体，连续清洗2次，洗掉菌液中的抗生素；清洗处理后的野生型绿针假单胞菌体和携带重组质粒的大肠杆菌体分别用1mllb液体培养基悬浮，获得处理后携带重组质粒的大肠杆菌液和处理后野生型绿针假单胞菌液；其中，处理后携带重组质粒的大肠杆菌液先放入4℃冰箱，备用；处理后野生型绿针假单胞菌液置于33℃水浴处理2h后备用；然后再将处理后携带重组质粒的大肠杆菌液与处理后野生型绿针假单胞菌液各取200μl按体积比1:1的比例混合，获得混合菌液；取混合菌液50μl点接于lb平板上，吹干0.5h后28℃倒置培养24h；待lb平板长出菌落后，用接种环刮取菌落于gm50+amp100μg/ml的lb平板上划线，长出单菌落后于gm50+amp100μg/ml的lb平板上再次划线，即为一次交换子菌苔。

(8)用接种环刮取步骤(7)中的一次交换子菌苔于10％蔗糖+amp100μg/ml的lb平板上单菌落划线，28℃培养两天左右长出单菌落，长出的单菌落即为二次交换子或野生型菌株；挑取厚实的单菌落，分别划gm50+amp100μg/ml和amp100μg/ml的lb平板；再用灭菌牙签点取gm50+amp100μg/ml的lb平板上不生长而amp100μg/ml的lb平板上生长的单菌落于lb液体培养基中，28℃、180rpm摇床中过夜培养，取750μl菌液和750μl50％甘油混匀于2ml离心管中，即为接合子，液氮速冻，-70℃保存。

(9)接合子的检测

以ctab法快速提取接合子dna作为模板，利用引物f1和r2进行pcr扩增，再用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的大小，送上海生物工程公司进行测序验证。如果片段长度与融合基因片段长度一致且基因序列完全相同，表明获得的接合子是正确的，遗传操作方法也是正确的。

本发明实现了sacb介导的绿针假单胞菌两亲交配遗传操作方法，获得了无标记且稳定遗传的转化菌株。本发明通过改进转化条件包括：酶切体系各成分的参数比、连接体系各成分的参数比、化学感受态细胞的制备条件(热击时间、冰浴时间等)、两亲交配时菌株处理温度、时间、加入量等参数，成功获得接合子。可进行绿针假单胞菌抗菌活性物质相关基因及基因簇的无标记突变，用于相关基因的作用机理和功能研究。

附图说明

图1目的基因pvds上下游两端的旁侧序列pcr扩增电泳图

图2携带融合基因的自杀质粒pex18-pvds转化大肠杆菌dh5α后菌落pcr扩增电泳图

图3携带融合基因的自杀质粒pex18-pvds双酶切电泳图

图4携带融合基因的自杀质粒pex18-pvds转化大肠杆菌s17-1后菌落pcr扩增电泳图

图5两亲交配后双交换，pvds缺失突变体pcr扩增电泳图

图6绿针假单胞菌、突变体和互补菌株液体培养肉眼观察图

具体实施方式

为了更详细的理解本发明方法，下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。

实施例中涉及的培养基及抗生素母液配方：

lb培养液/lb液体培养基(1l)：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，用去离子水定容至1l，调节ph至7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。

lb平板/lb固体培养基(1l):胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，琼脂粉15g，用去离子水定容至1l，调节ph至7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。

氨苄青霉素(ampicillin，amp)、庆大霉素(gentamicin，gm)和四环素(tetracyyline，tet)购自invitrogen公司。溶解1g氨苄青霉素于足量的水中，最后定容至10ml，浓度为100mg/ml，分装成1ml/管放置-20℃贮存。溶解100mg庆大霉素于足量的水中，最后定容至10ml，浓度为10mg/ml，分装成1ml/管放置-20℃贮存。溶解100mg四环素于无水乙醇中，最后定容至10ml，浓度为10mg/ml，分装成1ml/管放置-20℃贮存。

x-gal溶液：溶解200mg二甲基甲酰胺(dmf)于足量的水中，最后定容至10ml，配制成20mg/ml的溶液，4℃贮存。

50μg/mlgm的lb培养液：在灭菌后冷却至60℃左右的5ml的lb培养液中加入25μl浓度为10mg/ml的gm溶液，备用。

gm50+amp100μg/ml的lb平板：在灭菌后冷却至60℃左右的100ml的lb固体培养基中加入500μl浓度为10mg/ml的gm溶液和100μl浓度为100mg/ml的amp溶液，倒平板备用。

amp100μg/ml的lb平板：在灭菌后冷却至60℃左右的100ml的lb固体培养基中加入100μl浓度为100mg/ml的amp溶液，倒平板备用。

gm50+x-gal100μg/ml的lb平板：在灭菌后冷却至60℃左右的100ml的lb固体培养基中加入500μl浓度为20mg/ml的x-gal溶液和500μl浓度为10mg/ml的gm溶液，倒平板备用。

10％蔗糖+amp100μg/ml的lb平板：在灭菌后冷却至60℃左右的100ml的lb固体培养基中加入10g蔗糖和100μl浓度为100mg/ml的amp溶液，倒平板备用。

实施例中涉及菌株和载体的来源：

绿针假单胞菌yl-1采自大豆根围，来源于江苏省农业科学院植物保护研究所生防实验室(参见文献：“绿针假单胞菌yl-1抗细菌活性相关基因的克隆和分析”刘邮洲等，《植物病理学报》，2015)；

接合型质粒pex18(庆大霉素抗性，gm)(参见文献：“pseudomonasplecoglossicidanyz12基因无痕敲除方法的建立”毛灵琪等，《生物技术通报》，2016；或“铜绿假单胞菌中pmpr基因对iii型分泌系统的调节”梁海华等，《科学通报》，2012)、大肠杆菌dh5α和s17-1来源于南京农业大学植保学院植物检疫实验室。

pucp载体(tet抗性)(参见文献：“secgisrequiredforantibioticactivitiesofpseudomonassp.yl23againsterwiniaamylovoraanddickeyachrysanthemi”youzhouliu等，《journalofbasicmicrobiology》，2015)来源于美国密西西比州立大学植物病理系dr.shi-enlu教授实验室。

实施例1绿针假单胞菌yl-1、大肠杆菌dh5α和s17-1对氨苄青霉素、庆大霉素和四环素的敏感性测定

本实施例使用的绿针假单胞菌yl-1是申请者分离获得的一株对农业上多种重要病原细菌(荚壳伯克霍尔德菌burkholderiaglumae；解淀粉欧文氏菌erwiniaamylovora；胡萝卜果胶杆菌pectobacteriumcarotovora等)和病原真菌(立枯丝核菌rhizoctoniasolani等)有较强抑制作用的生防细菌(刘邮洲等，《植物病理学报》，2015)。

将绿针假单胞菌yl-1在lb液体培养基中28℃、180rpm摇床过夜培养后，浓度约为10⁸cfu/ml的菌液，备用。梯度稀释菌液后分别涂在氨苄青霉素浓度分别为10、50、100μg/ml的lb平板、庆大霉素和四环素浓度分别为10、25、50μg/ml的lb平板上，28℃静置培养2d，观察生长情况，结果如表1所示。可见，绿针假单胞菌yl-1具有amp100μg/ml的天然抗性，不具有gm和tet抗性。

表1绿针假单胞菌对氨苄青霉素、庆大霉素和四环素的敏感性测定

注：表1中“+”：绿针假单胞菌能生长繁殖，“-”：绿针假单胞菌不能生长繁殖。

大肠杆菌dh5α和s17-1在lb液体培养基中37℃、180rpm培养6-8h后，浓度约为10⁸cfu/ml。梯度稀释(菌落数10²、10⁴、10⁶、10⁸cfu/ml)后分别涂在氨苄青霉素浓度分别为10、50、100μg/ml的lb平板、庆大霉素和四环素浓度分别为10、25、50μg/ml的lb平板上，37℃静置培养12h，观察生长情况，结果表明：大肠杆菌dh5α和s17-1对amp、gm、tet没有任何抗性，菌落均不能生长。

实施例2目标基因缺失片段的构建与连接

为挖掘绿针假单胞杆菌yl-1拮抗病原细菌和真菌的活性物质、定位其合成基因簇，本实施例以绿针假单胞菌yl-1中荧光性嗜铁素(pyoverdine)合成基因簇上pvds基因为目标基因，它是σ因子，调控菌株yl-1嗜铁素的转录，一旦pvds基因被破坏，菌株yl-1就不能合成嗜铁素，lb液体培养基中培养2d后也无法显示野生型菌株特有的绿色。

表2实施例2中所使用的引物表

(1)选取目标基因pvds两端的旁侧序列，利用bioxm软件分别设计上下游引物f1、r1、f2和r2，分别加上hindiii、kpni、xbai酶切位点，如表2所示；(2)ctab法(《分子克隆实验指南》(下册)，(美)萨姆布鲁克(sambrook，j.)等著，北京：科学出版社，2002)提取绿针假单胞菌基因组dna：

①培养菌株yl-1菌液(实施例1)至od值0.6左右，吸取1.5ml菌液于2ml离心管中，10000rpm离心10min，去除上清，取沉淀物；

②沉淀物加入500μl的te缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬，加入30mg的溶菌酶和9μl20mg/ml的蛋白酶k，37℃温育直至细胞壁破裂，再加入45μl20％的sds，混匀，于37℃温育1h；

③加入300μl5mnacl，充分混匀，再加入240μlctab/nacl溶液，混匀，于65℃温育10min；

④加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，12000rpm离心20min；

⑤加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，12000rpm离心20min，将上清液转入一只新管中；

⑥加入0.6体积异丙醇，12000rpm离心20min。将沉淀转移至1ml的70％乙醇中洗涤；

⑦12000rpm离心5min，弃上清，吹干后重溶于50-100μl的te缓冲液。

上述ctab法提取方法为本领域常规方法，具体也可以参见文献：“《分子克隆实验指南》(下册)，(美)萨姆布鲁克(sambrook，j.)等著，北京：科学出版社，2002”。

(3)梯度pcr扩增，绿针假单胞菌pcr反应体系：10×transtaq-tbuffer(+mg²⁺)2.5μl，dntp2μl，引物f0.5μl，引物r0.5μl(即上下游引物各0.5μl)，transtaq-tdnapolymerase0.3μl，dna0.3μl，ddh2o补足至25μl。

梯度pcr程序：95℃预变性5min；94℃变性30s；55-70℃退火30s；72℃延伸30s；30个循环数；72℃延伸10min；16℃保温。

用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的大小，结果见图1。图1中，a为基因pvds上游旁侧序列pcr扩增电泳图，图中泳道m：dnamarker，泳道1-8：目的基因pvds上游旁侧序列温度梯度pcr扩增图；b为基因pvds下游旁侧序列pcr扩增电泳图，图中泳道m：dnamarker，泳道1-7：目的基因pvds下游旁侧序列温度梯度pcr扩增图；其中pvds上游端旁侧序列大小为351bp，pvds下游端旁侧序列大小为330bp。

在具体实施中，目标基因上下游旁侧序列也可以根据实际研究情况选择，一般以不超过1000bp为宜。

(4)pcr产物回收

使用axygen公司的axypreppcr清洁试剂盒对pcr产物进行cleanup回收，具体操作步骤如下：

①在pcr反应液中，加入pcr反应液3倍体积的bufferpcr-a，混匀，转移至吸附柱中；

②吸附柱置于2ml离心管中，12000rpm离心1min，弃废液，吸附柱放回离心管中；

③加入700μlbufferw2(已按要求加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，吸附柱放回离心管中；

④加入400μlbufferw2，12000rpm离心1min，弃废液，吸附柱放回离心管中；⑤室温放置数分钟，晾干残存的漂洗液；

⑥将吸附柱转入干净的1.5ml离心管中，加入30-50μl去离子水，室温静置2min，12000rpm离心2min，收集2个dna片段。

在具体实施中，回收步骤也可参见清洁试剂盒说明书。

(5)将步骤(4)的2个dna扩增片段、自杀载体pex18分别进行相应的限制性双酶切，

结合表1可知，本实施例中，上游dna扩增片段采用kpni和hindiii双酶切，下游dna扩增片段采用hindiii和xbai双酶切，自杀载体采用kpni和xbai双酶切，具体如下：

上游dna扩增片段的100μl酶切体系：限制性内切酶kpni5μl，限制性内切酶hindiii5μl，buffer10μl，dna扩增片段15μl，ddh2o65μl，总体积100μl，加入1.5ml离心管中混匀，37℃恒温水浴1h；

下游dna扩增片段的100μl酶切体系：限制性内切酶hindiii5μl，限制性内切酶xbai5μl，buffer10μl，dna扩增片段15μl，ddh2o65μl，总体积100μl，加入1.5ml离心管中混匀，37℃恒温水浴1h；

自杀载体pex18的100μl酶切体系：限制性内切酶kpni5μl，限制性内切酶xbai5μl，buffer10μl，自杀载体pex1815μl，ddh2o65μl，总体积100μl，加入1.5ml离心管中混匀，37℃恒温水浴1h。

(6)酶切产物纯化回收：同步骤(4)，获得2个dna片段和载体pex18。

(7)步骤(6)的酶切产物进行连接，10μl体系：dna片段11μl，dna片段21μl，t4buffer1μl，t4dna连接酶0.5μl，质粒pex182μl，ddh2o4.5μl，16℃恒温水浴过夜，质粒与插入片段的比值为1:3到1:10。

实施例3携带融合基因的连接产物遗传转化大肠杆菌dh5α

(1)大肠杆菌dh5α化学感受态细胞制备

①挑取新鲜的大肠杆菌单菌落于25mllb液体培养基中，37℃，220rpm过夜培养；

②将培养好的菌液按照1:100转接到50ml新鲜的lb液体培养基中，37℃，220rpm，3-3.5h至od600nm≈1.0；

③将上述菌液冰浴10min后，4℃，6000rpm离心10min，弃上清，留沉淀菌体；

④加入预冷的cacl2(0.1m)10ml，轻轻吹打至悬浮菌体，冰浴30min；

⑤4℃，6000rpm离心10min，弃上清，留沉淀菌体；

⑥加入预冷的cacl2(0.1m含15％甘油)1ml，轻轻吹打至悬浮菌体。1.5ml离心管分装，每管约100μl，-70℃保存备用。

(2)携带融合基因的接合型质粒pex-18遗传转化大肠杆菌dh5α

①取10μl连接产物加入事先制备好的100μl化学感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；

②将上述体系42℃水浴60s，冰浴150s；

③加入800μl新鲜的lb液体培养基于上述体系中；

④37℃，180rpm摇床培养1h；

⑤6000rpm离心3min，保留约100μl上清其余弃掉，轻轻吹打悬浮菌体；

⑥吸取悬浮菌液100μl用灭菌涂布棒涂在相应的gm50+x-gal100μg/ml的lb平板上；

⑦37℃静置培养约24h，直至长出单菌落，挑选白色单菌落。

(3)菌落pcr验证

pcr反应体系：10×transtaq-tbuffer(+mg²⁺)2.5μl，dntp2μl，浓度为10μm/l的引物f1和r2各0.5μl，transtaq-tdnapolymerase0.3μl，用灭菌牙签或枪头蘸白色单菌落做dna模板，ddh2o补足至25μl。

梯度pcr程序：95℃预变性5min；94℃变性30s；60.9℃退火30s；72℃延伸45s；30个循环数；72℃延伸10min；16℃保温。用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的大小，结果见图2，图2中泳道m：dnamarker；泳道+：绿针假单胞菌(pvds全基因)；泳道-：大肠杆菌dh5α；泳道1-10：白色转化子扩增目的基因pvds部分片段；可见，扩增片段大小为750bp左右，与融合基因片段长度基本一致，表明转化试验正确。

实施例4重组质粒提取与酶切验证

(1)质粒提取

使用axygen公司的axyprep质粒dna小量试剂盒提取质粒。具体操作步骤如下或参照试剂盒说明书：

①挑取pcr验证正确的阳性克隆(白色单菌落)转接至含有gm50μg/ml的lb液体培养基中，37℃，220rpm摇床过夜培养；

②吸取2ml菌液于2ml离心管中，12000rpm离心1min，弃上清，留沉淀菌体；

③加入250μlsolutioni(已加入rnasea)，吹打悬浮菌体；

④加入250μlsolutionii，温和上下翻转5-6次使菌体充分裂解至形成透亮溶液；

⑤加入350μlsolutioniii，温和上下翻转7-8次，室温12000rpm离心10min；

⑥吸取步骤⑤中的上清至吸附柱中，12000rpm离心1min，弃滤液，吸附柱放回离心管中；

⑦加入500μlbufferw1，12000rpm离心1min，弃滤液，吸附柱放回离心管中；

⑧加入700μlbufferw2，12000rpm离心1min，弃滤液，吸附柱放回离心管中；重复此操作一次；

⑨空离一次，12000rpm离心2min；

⑩将吸附柱置于1.5ml离心管中，向吸附柱的膜中央悬空滴加50-60μl去离子水(事先预热)，12000rpm离心1min，收集质粒。

(2)质粒双酶切验证

双酶切采用20μl体系：5μl步骤(1)获取的质粒(浓度约为50ng/μl)，2μlbuffer，限制性内切酶kpni和xbai各1μl，无菌水补足至20μl，37℃，1h。

1％琼脂糖凝胶电泳分析质粒双酶切结果显示(结果见图3)：图3中泳道m(左)：2000bpdnamarker，泳道m(右)：15000bpdnamarker；泳道1-2：重组质粒pex18-pvds双酶切；切开的两个条带分别与空质粒和融合基因大小一致，说明重组质粒构建成功。

实施例5携带融合基因的重组质粒遗传转化大肠杆菌s17-1

(1)大肠杆菌s17-1化学感受态细胞制备(制备方法同实施例3中大肠杆菌dh5α化学感受态细胞制备)

(2)携带融合基因的质粒pex-18遗传转化大肠杆菌s17-1

①将10μl携带缺失目的基因的融合基因的质粒pex18加入事先制备好的100μl化学感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30-40min；

②将上述体系42℃水浴60-90s，冰浴150-180s；

③加入800μl新鲜的lb液体培养基于上述体系中；

④37℃，180rpm摇床培养1h；

⑤6000rpm离心3min，保留约100-150μl上清其余弃掉，轻轻吹打悬浮菌体；⑥吸取100μl悬浮菌液用灭菌涂布棒涂在gm50+x-gal100μg/ml的lb平板上；⑦37℃静置培养约24h，直至长出单菌落，挑选蓝色单菌落。

(3)菌落pcr验证(方法同实施例3)，结果见图4，图4中泳道m：dnamarker；泳道+：携带融合基因的自杀质粒pex18-pvds；泳道-：大肠杆菌s17-1；泳道1-6：蓝色转化子扩增目的基因pvds部分片段；图41％琼脂糖凝胶电泳结果显示，扩增片段大小与融合基因一致，表明转化试验正确。

实施例6绿针假单胞菌和大肠杆菌pex18-s17-1的两亲交配

①用灭菌牙签或枪头蘸取菌落pcr验证正确的蓝色单菌落于5ml的lb液体培养基中，37℃，180rpm摇床中过夜培养；用接种环挑取绿针假单胞菌yl-1菌苔于5ml的lb液体培养基中，28℃，180rpm摇床中过夜培养；

②分别取二者菌液2ml于2个离心管中，6000rpm，3min，弃液收集菌体；

③用1mllb液体培养基将菌体悬浮起来，6000rpm，3min，弃液收集菌体，连续清洗2次，洗掉菌液中的抗生素；

④处理后的yl-1菌体和pex18-s17-1菌体分别用1mllb液体培养基悬浮起来，pex18-s17-1菌液先放入4℃冰箱，yl-1菌液33℃水浴处理2h；

⑤将pex18-s17-1菌液与yl-1菌液各取200μl按1:1的比例混合；

⑥取混合后的菌液50μl点接于lb平板上，吹干0.5h后28℃倒置培养24h；

⑦待lb平板长出菌落后，用接种环刮取菌落于gm50+amp100μg/ml的lb平板上划线，长出单菌落后于gm50+amp100μg/ml的lb平板上再次划线，28℃培养至长出单菌落，即为交换子菌落。

实施例7接合子的筛选和检测

(1)接合子的筛选

①用接种环刮取实施例6扩大培养的一次交换子菌落于10％蔗糖+amp

100μg/ml的lb平板上单菌落划线，28℃培养2d左右长出单菌落，利用自杀载体pex18上的筛选标记基因sacb，通过蔗糖的筛选压力使一次交换子致死，长出的单菌落即为二次交换子或野生型菌株；

②挑取黄色且厚实的单菌落，分别划gm50+amp100μg/ml和amp100μg/ml的lb平板。用灭菌牙签点取gm50+amp100μg/ml的lb平板上不生长而amp100μg/ml的lb平板上生长的单菌落于5mllb液体培养基中、28℃培养过夜；

③取750μl菌液和750μl50％甘油混匀于2ml离心管中，液氮速冻，-70℃保存。

(2)接合子的检测

pcr检测：

根据目的基因pvds的上下游引物f1/r2进行pcr验证接合子，以ctab法(同实施例2)快速提取接合子dna作为模板进行pcr扩增，再用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的大小，结果见图5，图5中泳道m：dnamarker；泳道+：绿针假单胞菌；泳道-：空白对照；泳道1-5：突变体扩增目的基因pvds的部分片段；将扩增片段送上海生物工程公司测序验证。

液体培养肉眼观察：

参照文献报道的方法(liuyouzhou，2015，《journalofbasicmicrobiology》)，利用大肠杆菌-假单胞菌穿梭载体pucp26，获得pvds基因互补菌株δpvds互补菌株和空质粒对照菌株δpvds-pucp26。

挑取pcr检测为阳性的接合子δpvds、野生型菌株yl-1、δpvds互补菌株、空质粒对照菌株δpvds-pucp26的菌苔分别在5ml的lb液体培养基中，28℃，180rpm摇床中过夜培养，肉眼观察培养液的颜色同时用分光光度计检测od405/od600值，如图6和表3所示。

表3野生型菌株、突变体、互补菌株和空质粒对照菌株液体培养后od值

图6中，图中yl-1：绿针假单胞菌；δpvds：pvds缺失突变体；δpvds互补：pvds互补菌株；δpvds-pucp26：空质粒pucp26转入pvds缺失突变体的对照菌株。由表3和图6可见，与野生型菌株yl-1相比，突变体δpvds液体培养后没有绿色，od值也明显下降。δpvds互补菌株能恢复表型，液体培养后呈现绿色，od值与野生型菌株yl-1无明显差异，空质粒对照菌株δpvds-pucp26液体培养后没有绿色，od值也明显下降。以上结果说明pvds基因的部分缺失确实影响菌株yl-1嗜铁素的合成，与现有文献报道一致。

以上实施例以菌株yl-1pvds基因为例，表明构建的绿针假单胞菌遗传操作系统稳定、高效。在具体实施中，其他绿针假单胞菌的相关基因，如还嗜铁素合成相关基因pvdf、pvdl、吩嗪合成相关基因phze、phzf等基因，同样可以使用本发明的遗传操作方法。

序列表

<110>江苏省农业科学院

<120>sacb介导的绿针假单胞菌遗传操作方法

<141>2018-11-11

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggggtaccactgctgtggcgggatgttc28

<210>2

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cccaagcttccgcgattttgaccaggatc29

<210>3

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>4

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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