一种快速检测人所有23对染色体数目的试剂盒的制作方法

本发明涉及染色体的检测，具体涉及一种快速检测人所有23对染色体数目的试剂盒。

背景技术：

自然流产是指妊娠不足28周，胎儿体重不足1000g而自然终止者。其发病率约占临床妊娠的10％～20％，其中80％为早期自然流产。导致自然流产的原因较多，如胚胎因素、母体因素、免疫功能异常和环境因素，其中胚胎染色体异常占50％以上，而在胚胎染色体异常中，胎儿染色体非整倍体异常占染色体异常胚胎的86％以上。不明原因的反复自然流产不仅给流产患者带来了严重的身体创伤，而且对下一次妊娠结果的未知性，也使之饱受着无尽的焦虑。帮助流产患者找到病因，不仅可以避免不必要的检查和治疗，同时还可以有效地指导下一次妊娠，减轻精神压力。

通过绒毛细胞培养和核型分析可以全面、直观地判断每条染色体数目和大的结构异常，客观地反应胚胎的遗传学信息，但流产组织多为陈旧标本，送检时多已腐烂变质和污染，导致绒毛细胞培养失败率高达10％～40％。因此，高成功率的分子诊断方法成为了流产物诊断的迫切需求。

近年来发展的染色体光谱核型分析(sky)、cgh、单核苷酸多态性微阵列(snp-array)等分子遗传学技术实现了流产物全染色体异常的评估，但由于其检测费用昂贵以及操作繁琐，导致该类项目很难成为一种常规的筛查项目。mlpa技术用于染色体数目的检测，大大降低了检测成本和操作的难度，逐渐推动了该项目的检测。但是，其也存在着一些缺点或不足，首先，mlpa技术需要pcr前处理，即探针连接步骤，该步骤决定了检测结果的成功或失败，而探针连接效率容易受dna纯度的影响，因此，在血液或羊水的检测中往往比较稳定，而在流产物组织的检测中，由于dna纯度往往较低，导致mlpa的连接效率不高，并最终可能产生无法判断的结果。其次，mlpa的判断较复杂，必须要有专门的软件分析，无法得到直观的检测结果。

本申请发明人在之前的研究中，已开发出几种常见染色体异常的重复序列分子标记(rapiddiagnosisofaneuploidyusingsegmentalduplicationquantitativefluorescentpcr)，并将其应用于21,18,13，x和y染色体的数目检测，但是，此研究仅是针对几条常见染色体数目异常，而流产胎儿涉及人所有染色体的数目异常，因此，之前的检测体系不能完全满足临床检测的需要。

鉴于前期检测方法学的不足，本发明人对该项目继续研究，经过几年的研究，通过大量的临床筛选和验证，开发出可用于检测人所有23对染色体数目(22对常染色体和1对性染色体)异常的检测体系。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种快速检测人所有23对染色体数目的试剂盒。该试剂盒可以在单个反应管中实现人22对常染色体，以及1对性染色体数目的快速检测，且检测结果准确、可靠、特异性强。

本发明所述的快速检测人所有23对染色体数目的试剂盒，包括扩增检测试剂，其特征在于：所述的扩增检测引物由下述(1)-(16)所示的引物对组成：

(1)同时扩增22号染色体特异序列chr22-1与18号染色体特异序列chr18的引物对，它们的碱基序列分别如seqidno：1和seqidno：2所示；

(2)同时扩增8号染色体特异序列chr8-1与17号染色体特异序列chr17的引物对，它们的碱基序列分别如seqidno：3和seqidno：4所示；

(3)同时扩增14号染色体特异重复序列chr14与22号染色体特异重复序列chr22-2的引物对，它们的碱基序列分别如seqidno：5和seqidno：6所示；

(4)同时扩增21号染色体特异重复序列chr21-1与1号染色体特异重复序列chr1-1的引物对，它们的碱基序列分别如seqidno：7和seqidno：8所示；

(5)同时扩增16号染色体特异重复序列chr16与6号染色体特异重复序列chr6的引物对，它们的碱基序列分别如seqidno：9和seqidno：10所示；

(6)同时扩增21号染色体特异重复序列chr21-2与15号染色体特异重复序列chr15的引物对，其碱基序列分别如seqidno：11和seqidno：12所示；

(7)同时扩增12号染色体特异重复序列chr12与20号染色体特异重复序列chr20的引物对，它们的碱基序列分别如seqidno：13和seqidno：14所示；

(8)同时扩增13号染色体特异重复序列chr13与5号染色体特异重复序列chr5的引物对，它们的碱基序列分别如seqidno：15和seqidno：16所示；

(9)同时扩增4号染色体特异重复序列chr4-1与9号染色体特异重复序列chr9的引物对，它们的碱基序列分别如seqidno：17和seqidno：18所示；

(10)同时扩增3号染色体特异重复序列chr3与4号染色体特异重复序列chr4-2的引物对，它们的碱基序列分别如seqidno：19和seqidno：20所示；

(11)同时扩增10号染色体特异重复序列chr10与19号染色体特异重复序列chr19的引物对，它们的碱基序列分别如seqidno：21和seqidno：22所示；

(12)同时扩增2号染色体特异重复序列chr2与11号染色体特异重复序列chr11的引物对，它们的碱基序列分别如seqidno：23和seqidno：24所示；

(13)同时扩增8号染色体特异重复序列chr8-2与7号染色体特异重复序列chr7的引物对，它们的碱基序列分别如seqidno：25和seqidno：26所示；

(14)同时扩增4号染色体特异重复序列chr4-3与x染色体特异重复序列chrx-1的引物对，它们的碱基序列分别如seqidno：27和seqidno：28所示；

(15)同时扩增y号染色体特异重复序列chry-1与x染色体特异重复序列chrx-2的引物对，它们的碱基序列分别如seqidno：29和seqidno：30所示；

(16)同时扩增1号染色体特异重复序列chr1-2与y染色体特异重复序列chry-2的引物对，它们的碱基序列分别如seqidno：31和seqidno：32所示。

本发明技术方案中，各组引物的正向引物和反向引物中，至少有一个的5’端经过荧光标记。可采用现有常规的荧光标记对各组引物的正向引物和/或反向引物进行荧光标记，如fam、hex、tamra、rox、ned或vic等。具体的，本发明所述试剂盒采用ned荧光标记seqidno：1，seqidno：3，seqidno：5，seqidno：7，seqidno：9，seqidno：11，seqidno：13，seqidno：15，seqidno：17，seqidno：19，seqidno：21，seqidno：23以及seqidno：25；采用fam荧光标记seqidno：27，seqidno：29以及seqidno：31。

本发明所述技术方案中，每一对引物均可以同时扩增不同两条染色体上的不同片段大小的特异序列，因此，本发明所述试剂盒可以实现在单个反应管中实现人1号、2号、3号、3号、4号、5号、6号、7号、8号、9号、10号、11号、12号、13号、14号、15号、16号、17号、18号、19号、20号、21号、22号、x染色体和y染色体的数目进行检测。此外，本发明所述技术方案中的每对引物均可单独使用，也可以任意两对以上组合使用，以实现不同的检测需求。

本发明技术方案中，所涉及的各重复序列及其公开扩增引物如下述表1所示：

表1：

上述表1中的“序列编号”是指在本试剂盒或反应体系中给予的序列编号，同时，也是其在毛细管电泳中的片段大小排列顺序；“序列所在染色体”是指扩增的序列具体位于其所在的两条染色体；“扩增序列的名称”是本试剂盒给予的检测序列位点的名字或代码；“扩增引物”是指本试剂盒中扩增对应重复序列所用到引物的名称。

本发明试剂盒用于检测染色体数目的原理如下：通过在染色体间特异重复序列(两个相似序列)的两端完全相同的dna序列部位设计一对共同的扩增引物，避免了不同引物扩增不同序列产生的相互干扰或其它条件的干扰，从而保证了两个序列(即为一个重复序列)扩增效率的一致性；再根据扩增产物的荧光信号的高度计算重复序列间的峰值比例，即通过定量重复序列间的荧光比值判断两条染色体之间拷贝数的变化。对于常染色体，正常样本的重复序列的相对定量比值为2:2，即比值为1；而三体样本的比值为3:2，即比值为1.5；对于性染色体的判断，利用常染色体与x染色体进行比较，x染色体与y染色体进行比较，以判断性染色体的数目。

对于染色体数目的计算主要是根据两个相似序列间的扩增产物荧光值的比例来计算，具体如下：

引物seqidno：1和seqidno：2用于扩增相似序列chr22-1与chr18，而扩增产物chr22-1与chr18间的相对量可以计算出22号和18号染色体的数目；

引物seqidno：3和seqidno：4用于扩增相似序列chr8-1与chr17，而扩增产物chr8-1与chr17间的相对量可以计算出8号和17号染色体的数目；

引物seqidno：5和seqidno：6用于扩增相似序列chr14与chr22-2，而扩增产物chr14与chr22-2间的相对量可以计算出14号和22号染色体的数目；

引物seqidno：7和seqidno：8用于扩增相似序列chr21-1与chr1-1，而扩增产物chr21-1与chr1-1间的相对量可以计算出21号和1号染色体的数目；

引物seqidno：9和seqidno：10用于扩增相似序列chr16与chr6，而扩增产物chr16与chr6间的相对量可以计算出16号和6号染色体的数目；

引物seqidno：11和seqidno：12用于扩增相似序列chr21-2与chr15，而扩增产物chr21-2与chr15间的相对量可以计算出21号和15号染色体的数目；

引物seqidno：13和seqidno：14用于扩增相似序列chr12与chr20，而扩增产物chr12与chr20间的相对量可以计算出12号和20号染色体的数目；

引物seqidno：15和seqidno：16用于扩增相似序列chr13与chr5，而扩增产物chr13与chr5间的相对量可以计算出13号和5号染色体的数目；

引物seqidno：17和seqidno：18用于扩增相似序列chr4-1与chr9，而扩增产物chr4-1与chr9间的相对量可以计算出4号和9号染色体的数目；

引物seqidno：19和seqidno：20用于扩增相似序列chr3与chr4-2，而扩增产物chr3与chr4-2间的相对量可以计算出3号和4号染色体的数目；

引物seqidno：21和seqidno：22用于扩增相似序列chr10与chr19，而扩增产物chr10与chr19间的相对量可以计算出10号和19号染色体的数目；

引物seqidno：23和seqidno：24用于扩增相似序列chr2与chr11，而扩增产物chr2与chr11间的相对量可以计算出2号和11号染色体的数目；

引物seqidno：25和seqidno：26用于扩增相似序列chr8-2与chr7，而扩增产物chr8-2与chr7间的相对量可以计算出8号和7号染色体的数目；

引物seqidno：27和seqidno：28用于扩增相似序列chr4-3与chrx，而扩增产物chr4-3与chrx间的相对量可以计算出4号和x染色体的数目；

引物seqidno：29和seqidno：30用于扩增相似序列chry-1与chrx-2，而扩增产物chry-1与chrx-2间的相对量可以计算出y和x染色体的数目；

引物seqidno：31和seqidno：32用于扩增相似序列chr1-2与chry-2，而扩增产物chr1-2与chry-2间的相对量可以计算出1号和y染色体的数目。

进一步的，本发明提供的试剂盒中优选还包括有分子量内标，采用荧光染料标记分子量内标，包括75、100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490、500等14个片段长度，使用时加入电泳混合液与待测样本一起电泳，用于检测等位基因的片段长度。

本发明技术方案中所述的重复序列是指不同的两条染色体上的两个大部分碱基序列相同的两个dna序列，在一些文献中，也称为相似序列或同源基因或同源序列等。

本发明所述的试剂盒还包括一些现有试剂盒中常规且必须的组分，如阳性对照模板、阴性对照模板、缓冲液、酶液、dntp、mg²⁺等。

与现有技术相比，本发明所述试剂盒可实现单管快速检测人所有23对染色体数目，具有快速、简便、准确、可批量化、应用广泛、成本低廉等诸多优点。本发明所述试剂盒可用于检测人外周血、羊水、胚胎、脐血以及绒毛等细胞组织中所有染色体的数目变化情况。

附图说明

图1为质控品(正常男性样本)的电泳结果；其中，(a)为正常男性性染色体的电泳结果，(b)为正常男性22对常染色体的电泳结果；

图2为质控品(正常女性样本)的电泳结果；其中，(a)为正常女性性染色体的电泳结果，(b)为正常女性22对常染色体的电泳结果；

图3为16-三体综合征流产物胎儿样本的电泳结果；其中，(a)为正常女性性染色体的电泳结果，(b)为16号染色体三体的电泳结果；

图4为20-三体综合征流产物胎儿样本的电泳结果；其中，(a)为正常女性性染色体的电泳结果，(b)为20号染色体的电泳结果；

图5为22-三体综合征流产物胎儿样本的电泳结果；其中，(a)为正常女性性染色体的电泳结果，(b)为22号染色体三体的电泳结果；

图6为47,xxy流产物胎儿样本的电泳结果；其中，(a)为性染色体为xxy的电泳结果，(b)为常染色体正常的的电泳结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1：采用本发明所述试剂盒对正常男性标本、正常女性标本、以及通过染色体核型分析验证的4例已知核型标本进行检测。

1、试剂盒的组成：

1.1试剂盒用于扩增的引物

本发明所述的快速检测人所有23对染色体数目的试剂盒，包括16对引物，即32条引物，具体为seqidno：1至seqidno：32。

在32条引物中，采用ned荧光标记seqidno：1，seqidno：3，seqidno：5，seqidno：7，seqidno：9，seqidno：11，seqidno：13，seqidno：15，seqidno：17，seqidno：19，seqidno：21，seqidno：23以及seqidno：25；采用fam荧光标记seqidno：27，seqidno：29以及seqidno：31；其余的引物未进行标记。

本试剂盒中，一对引物可同时检测两条染色体的数目，其中，seqidno：1和seqidno：2用于检测22号和18号染色体的数目；seqidno：3和seqidno：4用于检测8号和17号染色体的数目；seqidno：5和seqidno：6用于检测14号和22号染色体的数目；seqidno：7和seqidno：8用于检测21号和1号染色体的数目；seqidno：9和seqidno：10用于检测16号和6号染色体的数目；seqidno：11和seqidno：12用于检测21号和15号染色体的数目；seqidno：13和seqidno：14用于检测12号和20号染色体的数目；seqidno：15和seqidno：16用于检测13号和5号染色体的数目；seqidno：17和seqidno：18用于检测4号和9号染色体的数目；seqidno：19和seqidno：20用于检测3号和4号染色体的数目；seqidno：21和seqidno：22用于检测10号和19号染色体的数目；seqidno：23和seqidno：24用于检测2号和11号染色体的数目；seqidno：25和seqidno：26用于检测8号和7号染色体的数目；seqidno：27和seqidno：28用于检测4号和x染色体的数目；seqidno：29和seqidno：30用于检测y号和x染色体的数目；seqidno：31和seqidno：32用于检测1号和y染色体的数目。

1.2其它组成成分：

hotstar-taq酶，缓冲液，datp、dttp、dctp和dgtp以及mg2+均购自天根生化科技(北京)有限公司。

2、pcr反应体系的配制：

按下述表2配制pcr反应体系：

表2：(mm表示mmol/l，μm表示μmol/l)

pcr反应体系为50ul。

3、样本的来源及处理

样本来源于经传统染色体核型分析方法确定核型的dna样本，dna样本采用实验室常规dna提取方法进行提取，以双蒸水稀释至30ng/μl，并于-20℃保存备用。

4、pcr扩增程序：

pcr反应所用仪器为普通的pcr仪。pcr反应程序为：95℃预变性10min；95℃15sec，60℃30sec，72℃1min，30个循环；在72℃延伸30min；最后于15℃保温备用。

5、毛细管电泳分析：将1ulpcr产物与23ul甲酰胺和1ul分子量标准品(appliedbiosystems)混合。该混合物在95℃下变性3分钟，并放置在冰上，以防止重新退火，直到进一步分析。使用pop4凝胶(abi)在abi3130xl遗传分析仪(appliedbiosystems)进行电泳分析。对pcr产物进行分离，采用genemapperid软件v3.2(appliedbiosystems)进行数据分析。分别统计sd-qf-pcr和染色体核型分析检测结果，并进行比对分析。

6、结果检测与分析：

对于22对常染色体的结果分析，当样本为正常标本时，重复序列(相似序列)间的扩增量比值为2:2，即1:1的比值关系(检测结果见图1和图2)；而当目标染色体为三体时，其比值关系则为3:2，即为1.5:1的关系(检测结果见图3、图4、图5)。

对于性染色体，当样本为正常男性标本时，4:x＝2:1，y:x＝1:1，1:y＝2:1(检测结果见图1)；当样本为正常女性标本时，y＝0，4:x＝2:2(检测结果见图2)；当样本为47,xxy样本时，4:x＝2:2，y:x＝2:1，1:y＝2:1的比值关系(检测结果见图6)。

实验结果显示，试剂盒的检测体系能非常有效检测出所举例样本染色体的数目，其它染色体的检测方法和原理均与此相同，因此，本发明所述试剂盒能用于临床标本的检测。

sequencelisting

<110>孙雷

<120>一种快速检测人所有23对染色体数目的试剂盒

<130>2019

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