甲基化尿囊素类生物碱及其制备方法和应用与流程

本发明涉及天然药物
技术领域：
，具体地说涉及甲基化尿囊素类生物碱及其制备方法和应用。
背景技术：
：茶叶中含有丰富的生物碱，约占茶叶干物质的3％-5％。其中，大部分是嘌呤类生物碱，以及少量的嘧啶类生物碱。其中咖啡碱占3％-4％，可可碱占0.15％-0.2％，茶碱占0.02％-0.04％。研究表明，咖啡碱是茶叶中重要的滋味物质。而且，咖啡碱还具有强心、利尿、解毒、平喘等药理功能。除了以上三种嘌呤碱，对于茶叶中具有生物活性的其它生物碱化学基础的报道比较少，如果能成功的从茶叶中研究开发出具有生物活性的生物碱类衍生物成分，将会对农业和医药等领域作出重要贡献。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种具有细胞衰老保护作用的甲基化尿囊素类生物碱及其制备方法和应用。为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：甲基化尿囊素类生物碱，由式ⅰ或式ⅱ或式ⅲ或式ⅳ或式ⅴ或式ⅵ所示结构表示：本发明还提供上述甲基化尿囊素类生物碱在制备细胞衰老保护药物中的应用。具体可提供一种细胞衰老保护药物，由上述甲基化尿囊素类生物碱和药用辅料制成。所述药物的药物剂型包括口服型和注射型。所述口服型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂等；所述注射型包括注射液、混旋液等。具体制备方法可参照制药领域的常规方法制备，所用药用辅料根据剂型不同选择制药领域通用的辅料。本发明还提供上述甲基化尿囊素类生物碱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)原料粉碎取祁门红茶，对其进行粉碎处理，得到祁门红茶粉末；(2)浸提用乙醇水溶液浸提祁门红茶粉末，然后分离出提取液，提取液经过干燥处理，得到祁门红茶提取物；(3)分离纯化将祁门红茶提取物用甲醇水溶液溶解，然后浓缩去除大部分甲醇，之后用石油醚萃取除去小极性物质以及色素，最后用二氯甲烷进行萃取，得到二氯甲烷部位浸膏a；将二氯甲烷部位浸膏a用水溶解，加入酒石酸水溶液，去除不溶物，之后再用二氯甲烷进行萃取，去除水层后加入等体积氢氧化钠水溶液进行萃取，得到二氯甲烷层和碱水层，碱水层加入氯化铵后再用二氯甲烷进行萃取，得到二氯甲烷部位浸膏b；对二氯甲烷部位浸膏b进行分离纯化处理，得到所述甲基化尿囊素类生物碱。进一步地，步骤(2)中，所用乙醇水溶液的浓度为95％。进一步地，步骤(3)中，所用酒石酸水溶液的浓度为2％，氢氧化钠水溶液的浓度为1-2％。进一步地，步骤(3)中，分离纯化处理包括硅胶柱层析、sephadexlh-20凝胶柱层析、toyopearl柱层析。进一步地，分离纯化处理的具体步骤为：将二氯甲烷部位浸膏b溶解后进行第一次硅胶柱层析，第一次硅胶柱层析以二氯甲烷-甲醇体积比500:1到1:1作为梯度洗脱，将第一次硅胶柱层析得到的二氯甲烷-甲醇体积比30:1到20:1洗脱组分进行第二次硅胶柱层析，第二次硅胶柱层析以二氯甲烷-甲醇体积比1000:1到1:1作为梯度洗脱，将第二次硅胶柱层析得到的二氯甲烷-甲醇体积比20:1洗脱组分进行甲醇重结晶，得到外消旋三甲基尿囊素二聚体，外消旋三甲基尿囊素二聚体再经手性柱用hplc拆分，以乙腈洗脱后得到式ⅳ所示的甲基化尿囊素类生物碱和式ⅴ所示的甲基化尿囊素类生物碱；将甲醇重结晶剩余的组分经toyopearl柱层析以甲醇洗脱，收集第一时间洗出的组分经hplc纯化，得到式ⅲ所示的甲基化尿囊素类生物碱，收集的第二时间洗出的组分经sephadexlh-20凝胶柱层析以甲醇洗脱，得到外消旋1,3,8-三甲基尿囊素，外消旋1,3,8-三甲基尿囊素再经手性柱用hplc拆分，以乙腈洗脱后得到式ⅰ所示的甲基化尿囊素类生物碱和式ⅱ所示的甲基化尿囊素类生物碱；将第一次硅胶柱层析得到的二氯甲烷-甲醇体积比50:1到30:1洗脱组分进行第三次硅胶柱层析，第三次硅胶柱层析以乙酸乙酯-丙酮20:1到1:1作为梯度洗脱，将第三次硅胶柱层析得到的乙酸乙酯-丙酮20:1洗脱组分进行第四次硅胶柱层析，第四次硅胶柱层析以乙酸乙酯-丙酮90:1到70:1作为梯度洗脱，将第四次硅胶柱层析得到的乙酸乙酯-丙酮70:1洗脱组分进行hplc纯化，得到式ⅵ所示的甲基化尿囊素类生物碱。这里的“第......次”并不用来限定先后顺序，仅用于区别，只要相应组分脱出，就可以实施下一步的层析分离。本发明的有益效果体现在：本发明提供的甲基化尿囊素类生物碱具有医学活性，在由高糖诱导的细胞衰老模型中有一定保护作用，可以用于制备细胞衰老保护药物，对农业和医药领域具有重要的意义；并为有效开发利用祁门红茶提供了更为广阔的前景。本发明甲基化尿囊素类生物碱的制备方法工艺简单，容易实施，成本较低，具有非常好的应用前景。附图说明图1为(±)1,3,8-trimethylallantoin的x射线晶体结构图。图2为1,3,8-trimethylallantoin4r,4's-dimer的x射线晶体结构图。图3为1,3,8-trimethylallantoin4,4'-dimer的x射线晶体结构图。图4为1,3,7-trimethyltriuret的x射线晶体结构图。图5为(±)1,3,8-trimethylallantoin、s-(+)-1,3,8-trimethylallantoin、r-(-)-1,3,8-trimethylallantoin、1,3,8-trimethylallantoin4r,4's-dimer、1,3,8-trimethylallantoin4,4'-dimer、1,3,8-trimethylallantoin4s,4's-dimer、1,3,8-trimethylallantoin4r,4'r-dimer与1,3,7-trimethyltriuret对高糖诱导人人脐静脉内皮细胞衰老的抑制实验示意图。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步描述：以下实施例所使用的各种原料，如未作特别说明，均为本领域公知的市售产品。实施例1甲基化尿囊素类生物碱的制备1.1甲基化尿囊素类生物碱的说明本发明甲基化尿囊素类生物碱，由式ⅰ或式ⅱ或式ⅲ或式ⅳ或式ⅴ或式ⅵ所示结构表示：1.2制备方法及结果(1)原料粉碎取200公斤祁门红茶，粉碎至过孔径为10.5mm筛网，得到祁门红茶粉末；(2)浸提将祁门红茶粉末加入到1000公斤95％乙醇水溶液中，搅拌提取10小时，过滤得到提取液，将提取液浓缩至400l过200目筛网，继续浓缩过200目筛网，最后对得到的浓缩液进行喷雾干燥，进风温度190℃，出风温度90℃，收集干燥粉末过40目筛网，得到祁门红茶提取物；(3)分离纯化将祁门红茶提取物用70％甲醇水溶液溶解，然后浓缩去除大部分甲醇(尽可能去除，以不影响后续萃取分层为准)，之后用石油醚萃取，去除石油醚层，以除去小极性物质以及色素，然后用二氯甲烷进行萃取，得到二氯甲烷部位浸膏a；将二氯甲烷部位浸膏a用水溶解，加入2％酒石酸水溶液，去除不溶物，之后再用二氯甲烷进行萃取，去除水层后加入等体积1％-2％氢氧化钠水溶液进行萃取，得到二氯甲烷层和碱水层，碱水层加入氯化铵后再用二氯甲烷进行萃取，得到二氯甲烷部位浸膏b；取500克二氯甲烷部位浸膏b，用氯仿溶解拌样后进行第一次经硅胶柱层析，第一次硅胶柱层析以二氯甲烷-甲醇体积比500:1到1:1作为梯度洗脱，将第一次经硅胶柱层析得到的二氯甲烷-甲醇体积比30:1到20:1洗脱组分进行第二次硅胶柱层析，第二次硅胶柱层析以二氯甲烷-甲醇体积比1000:1到1:1作为梯度洗脱，将第二次经硅胶柱层析得到的二氯甲烷-甲醇体积比20:1洗脱组分经甲醇重结晶，得到外消旋三甲基尿囊素二聚体10.0mg(命名为1,3,8-trimethylallantoin4,4'-dimer，图5中记作3)，外消旋三甲基尿囊素二聚体再经手性柱(ox-3r)用hplc拆分，以乙腈洗脱后得到式ⅳ所示的甲基化尿囊素类生物碱2.5mg(命名为1,3,8-trimethylallantoin4s,4's-dimer，图5中记作3a)和式ⅴ所示的甲基化尿囊素类生物碱2.6mg(命名为1,3,8-trimethylallantoin4r,4'r-dimer，图5中记作3b)；将甲醇重结晶剩余的组分经toyopearl柱层析以甲醇洗脱分，收集第一时间洗出的组分经hplc纯化后得到式ⅲ所示的甲基化尿囊素类生物碱6.0mg(命名为1,3,8-trimethylallantoin4r,4's-dimer，图5中记作2)，收集第二时间洗出的组分经sephadexlh-20凝胶柱层析以甲醇洗脱，得到外消旋1,3,8-三甲基尿囊素57.5mg(命名为(±)1,3,8-trimethylallantoin，图5中记作1)，外消旋1,3,8-三甲基尿囊素再经手性柱(ox-3r)用hplc拆分，以乙腈洗脱后得到式ⅰ所示的甲基化尿囊素类生物碱7.4mg(命名为s-(+)-1,3,8-trimethylallantoin，图5中记作1a)和式ⅱ所示的甲基化尿囊素类生物碱7.5mg(命名为r-(-)-1,3,8-trimethylallantoin，图5中记作1b)；将第一次硅胶柱层析得到的二氯甲烷-甲醇体积比50:1到30:1洗脱组分进行第三次硅胶主程序，第三次硅胶柱层析以乙酸乙酯-丙酮20:1到1:1作为梯度洗脱，将第三次硅胶柱层析得到的乙酸乙酯-丙酮20:1洗脱组分进行第四次硅胶柱层析，第四次硅胶柱层析以乙酸乙酯-丙酮90:1到70:1作为梯度洗脱，将第四次硅胶柱层析得到的乙酸乙酯-丙酮70:1洗脱组分进行hplc纯化，得到式ⅵ所示的甲基化尿囊素类生物碱6.5mg(命名为1,3,7-trimethyltriuret，图5中记作4)。1.3甲基化尿囊素类生物碱的性状验证1.3.1：(±)1,3,8-trimethylallantoin的特性如下：1)、白色粉末，可溶于甲醇和水；2)、熔点158-159℃；hr-esi-ms:m/z223.0808([m+na]+,calcdforc7h12n4o3na+,223.0807)。核磁共振光谱数据见表1；晶体数据和结构精修见表2；x射线晶体结构见附图1。表1.(±)1,3,8-trimethylallantoin的核磁共振光谱数据(1hnmr在600mhz，13cnmr在125mhz条件下测试，δ单位为ppm，耦合常数j单位为hz，溶剂为氘代甲醇)。位置δh(jinhz)δc2158.345.18s67.55173.27160.392.98s25.0102.87s26.8112.69s26.9表2.(±)1,3,8-trimethylallantoin的晶体数据所有波谱数据均通过1h-1hcosy，hmqc和hmbc等二维核磁共振谱归属，证明了所得化合物的结构。1.3.2：式ⅰ所示的s-(+)-1,3,8-trimethylallantoin的特性如下：1)、白色粉末，可溶于甲醇和水；2)、+60.8°(c0.7meoh)；cd(meoh)λ(δε)218(+16.1),242(-2.3)1.3.3：式ⅱ所示的r-(-)-1,3,8-trimethylallantoin的特性如下：1)、白色粉末，可溶于甲醇和水；2)、-61.3°(c0.7meoh)；cd(meoh)λ(δε)218(-17.1),242(+2.3).1.3.4：式ⅲ所示的1,3,8-trimethylallantoin4r,4's-dimer的特性如下1)、白色粉末，可溶于吡啶，微溶于甲醇；2)、熔点214-215℃；hr-esi-ms:m/z421.1560([m+na]+,calcdforc14h22n8o6na+,421.1560),819.3201([2m+na]+,calcdforc28h44n16o12na+,819.3222)。核磁共振光谱数据见表3；晶体数据和结构精修见表4；x射线晶体结构见附图2。表3.1,3,8-trimethylallantoin4r,4's-dimer的核磁共振光谱数据(1hnmr在600mhz，13cnmr在125mhz条件下测试，δ单位为ppm，耦合常数j单位为hz，溶剂为氘代甲醇)。位置δh(jinhz)δc2159.22'159.2477.74'77.75172.05'172.07158.97'158.992.97s25.29'2.97s25.2102.88s26.610'2.88s26.6112.65s27.111'2.65s27.1表4.1,3,8-trimethylallantoin4r,4's-dimer的晶体数据所有波谱数据均通过1h-1hcosy，hsqc和hmbc等二维核磁共振谱归属，以及x射线晶体数据解析，证明了所得化合物的结构。1.3.5：1,3,8-trimethylallantoin4,4'-dimer的特性如下：1)、白色粉末，可溶于吡啶；2)、hr-esi-ms:m/z421.1560([m+na]+,calcdforc14h22n8o6na+,421.1560),819.3233([2m+na]+,calcdforc28h44n16o12na+,819.3222)。核磁共振光谱数据见表5。晶体数据和结构精修见表6；x射线晶体结构见附图3。表5.1,3,8-trimethylallantoin4,4'-dimer的核磁共振光谱数据(1hnmr在600mhz，13cnmr在125mhz条件下测试，δ单位为ppm，耦合常数j单位为hz，溶剂为氘代吡啶)。表6.1,3,8-trimethylallantoin4,4'-dimer的晶体数据所有波谱数据均通过1h-1hcosy，hsqc和hmbc等二维核磁共振谱归属，证明了所得化合物的结构。1.3.6：式ⅳ所示的1,3,8-trimethylallantoin4s,4's-dimer的特性如下：1)、白色粉末，可溶于水；2)、熔点196-197℃；+32°(c0.3meoh)；cd(meoh)λ(δε)220(+23.6),245(-11.3).1.3.7：式ⅴ所示的1,3,8-trimethylallantoin4r,4'r-dimer的特性如下：1)、白色粉末，可溶于水；2)、熔点192-193℃；-28°(c0.3meoh)；cd(meoh)λ(δε)220(-21.8),245(+10.6).1.3.8：式ⅵ所示的1,3,7-trimethyltriuret的特性如下1)、白色粉末，可溶于吡啶；2)、熔点185-186℃；hr-esi-ms:m/z211.0806([m+na]+,calcdforc6h12n4o3na+,211.0807),399.1706([2m+na]+,calcdforc12h24n8o6na+,399.1717)。核磁共振光谱数据见表7；晶体数据和结构精修见表8；x射线晶体结构见附图4。表7.1,3,7-trimethyltriuret的核磁共振光谱数据(1hnmr在600mhz，13cnmr在125mhz条件下测试，δ单位为ppm，耦合常数j单位为hz，溶剂为氘代吡啶)。位置δh(jinhz)δc2157.74154.76154.282.78d(4.2)27.493.23s30.2102.86d(4.8)26.4表8.1,3,7-trimethyltriuret的晶体数据所有波谱数据均通过1h-1hcosy，hsqc和hmbc等二维核磁共振谱归属，证明了所得化合物的结构。实施例2本发明甲基化尿囊素类生物碱的体外高糖诱导的细胞衰老保护试验细胞培养：人脐静脉内皮细胞(huvec)，用含10％胎牛血清的dulbecco＇smodifiedeagle(dmem)培养基，以一定条件(温度37℃，二氧化碳浓度5％，湿度95％)培养于二氧化碳恒温培养箱中。每1-2天换培养液1次，接种后3-5天，细胞呈单层密集生长，出现融合及岛状连接。待细胞生长至融合期时用0.25％胰蛋白酶消化传代，按1：4传代培养。取对数生长期的huvec细胞，消化成单细胞悬液，10％fbs的dmem培养基重悬，接种于6孔板中。试验分为对照组(control)，模型组(model)、二甲双胍组(metformin)以及各个药物组，对照组即不加任何物质的空白对照，模型组为huvecs与33mm葡萄糖共培养，二甲双胍组为二甲双胍与huvecs及高糖共培养、各个药物组分别为本发明制得的(±)1,3,8-trimethylallantoin、s-(+)-1,3,8-trimethylallantoin、r-(-)-1,3,8-trimethylallantoin、1,3,8-trimethylallantoin4r,4's-dimer、1,3,8-trimethylallantoin4,4'-dimer、1,3,8-trimethylallantoin4s,4's-dimer、1,3,8-trimethylallantoin4r,4'r-dimer、1,3,7-trimethyltriuret分别与huvecs(用量与二甲双胍组相同)及高糖(用量与二甲双胍组相同)共培养。共培养48h后，弃培养上清，每组按照β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明书进行操作，最后通过倒置荧光显微镜观察细胞衰老情况。如图5所示，相对于对照组，加入葡萄糖后能成功诱导神经细胞损伤，衰老模型建立成功，加入二甲双胍组具有明显的细胞衰老保护作用；分别加入(±)1,3,8-trimethylallantoin、s-(+)-1,3,8-trimethylallantoin、r-(-)-1,3,8-trimethylallantoin、1,3,8-trimethylallantoin4r,4's-dimer、1,3,8-trimethylallantoin4,4'-dimer、1,3,8-trimethylallantoin4s,4's-dimer、1,3,8-trimethylallantoin4r,4'r-dimer与1,3,7-trimethyltriuret的药物组也显示了对细胞衰老具有较好的保护效果，从而说明它们对由过高糖诱导的细胞衰老有一定的保护作用。上述试验证明，本发明制备得到的产物(±)1,3,8-trimethylallantoin、s-(+)-1,3,8-trimethylallantoin、r-(-)-1,3,8-trimethylallantoin、1,3,8-trimethylallantoin4r,4's-dimer、1,3,8-trimethylallantoin4,4'-dimer、1,3,8-trimethylallantoin4s,4's-dimer、1,3,8-trimethylallantoin4r,4'r-dimer与1,3,7-trimethyltriuret对细胞衰老有较强的保护作用。因此本发明甲基化尿囊素类生物碱类化合物可应用于抑制细胞衰老药物方面的制备。具体实施中将本发明甲基化尿囊素类生物碱类化合物按医学上可接受的剂量和药学上所通用的辅料制成一种细胞衰老保护药物。该药物剂型包括口服型和注射型等。所述口服型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂等；所述注射型包括注射液、混旋液等。具体制备方法参照制药领域的常规方法制备。应当理解本文所述的例子和实施方式仅为了说明，并不用于限制本发明，本领域技术人员可根据它做出各种修改或变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12