抗癌剂的制作方法

本发明涉及抗癌剂等。

背景技术：

已知乌苯美司与存在于巨噬细胞的细胞膜上的cd13/apn结合从而激活免疫，其为用于成人的急性白血病的缓解维持疗法的药物。此外，近年来，还报道了乌苯美司在几种实体癌中也抑制cd13/apn的活性。

然而，与用于急性白血病时相比，若不以非常高的浓度给药乌苯美司，则无法对实体癌发挥有效的抗癌效果。关于乌苯美司对肝细胞癌的细胞株(huh7、plc)的ic30，对huh7为394.8μg/ml，对plc为498.8μg/ml(非专利文献1)。另一方面，用于上述急性白血病的给药量为每天1次、口服给药30mg，由此得到的最大血药浓度为2.21μg/ml。因此，将乌苯美司应用于肝细胞癌等实体癌时，若不以临床上治疗急性白血病时所得到的血药浓度的数百倍之高的浓度进行使用，则无法发挥有效的抗癌效果。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：yamashitam,wadah,eguchih,ogawah,yamadad,nodat,etal.acd13inhibitor,ubenimex,synergisticallyenhancestheeffectsofanticancerdrugsinhepatocellularcarcinoma.intjoncol2016；49:89-98.

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题

本发明的技术问题在于提供一种提高乌苯美司的抗癌效果、特别是针对实体癌的抗癌效果的技术。

解决技术问题的技术手段

本申请的发明人鉴于上述技术问题进行了认真研究，结果发现，通过将多个乌苯美司连接于链状高分子，乌苯美司的抗癌效果、特别是针对实体癌的抗癌效果得以提高。本申请的发明人基于该见解进一步进行研究，结果完成了本发明。

即，本发明包含下述方案：

项1.一种化合物，其包含在链状高分子上连接多个乌苯美司而成的链状结构。

项2.根据项1所述的化合物，其中，所述链状高分子为多肽。

项3.根据项2所述的化合物，其中，所述多肽包含碱性氨基酸残基。

项4.根据项2或3所述的化合物，其中，所述连接为由所述多肽上的氨基与所述乌苯美司上的羧基形成的酰胺键。

项5.根据项1～4中任一项所述的化合物，其中，所述链状高分子的平均分子量为500～30000。

项6.根据项1～5中任一项所述的化合物，其中，连接于所述链状高分子的所述乌苯美司的数目为2～100。

项7.根据项1～6中任一项所述的化合物，其进一步包含聚乙二醇链结构。

项8.根据项1～7中任一项所述的化合物，其为通式(1a)表示的化合物、其盐或它们的溶剂化物。

[化学式1]

式中：r¹表示聚乙二醇链结构或羟基。r²¹在每次出现时独立地表示r^21a(氨基酸残基的侧链)或r^21b(连接有乌苯美司的该侧链)。n表示5～200的整数。

项9.一种药物，其含有项1～8中任一项所述的化合物。

项10.一种试剂，其含有项1～8中任一项所述的化合物。

项11.一种抗癌剂，其含有项1～8中任一项所述的化合物。

项12.根据项11所述的抗癌剂，其以实体癌为目标癌症。

项13.根据项11或12所述的抗癌剂，其进一步含有其他抗癌化合物。

项14.根据项11或12所述的抗癌剂，其以与其他抗癌化合物联合用药的方式进行使用。

项15.一种cd13/apn活性抑制剂，其含有项1～8中任一项所述的化合物。

发明效果

根据本发明，通过使用包含在链状高分子上连接多个乌苯美司而成的链状结构的化合物，能够发挥高于乌苯美司的抗癌效果、特别是针对实体癌能够发挥更高的抗癌效果。通过将该化合物与其他抗癌剂联用，也能够发挥协同作用。此外，该化合物作为cd13/apn活性抑制剂等也是有用的。

附图说明

图1为表示apn/cd13的结构的示意图。

图2的a及b为包含链状结构的化合物(合成例1-3)的结构式及示意图，所述链状结构是聚乙二醇与多聚赖氨酸的嵌段共聚物(peg-b-plys)的一部分赖氨酸残基的侧链上的氨基与乌苯美司的羧基通过酰胺键连接而成的；c表示试验例1的使用了3d培养系统的试验的结果，d表示试验例2的mtt测定的结果，c及d中，横轴表示培养基中的被测物质的乌苯美司换算浓度，*表示p值小于0.05。

图3中，a表示试验例3的cd13/apn酶活性的测定结果，a中，*表示p值小于0.05；b表示试验例4的mtt测定的结果，b中，横轴表示培养基中的被测物质(peg-b-plys(ube)50)浓度，*表示p值小于0.05。

图4中，a表示试验例5的ros水平分析结果，b表示试验例6的细胞凋亡分析结果，a及b中，*表示p值小于0.05。

图5中，a表示使用huh7细胞时的等辐射(isobologram)分析(试验例7)的结果，b表示使用hepg2细胞时的等辐射分析的结果。

图6表示抗肿瘤效果的体内分析(试验例8)的结果。

图7表示药代动力学的分析(试验例10)的结果。

图8表示与其他抗癌剂的联用效果的分析(试验例14)的结果(皮下肿瘤体积的测定结果)。

图9表示与其他抗癌剂的联用效果的分析(试验例14)的结果(苏木精-伊红染色结果)。

图10表示与其他抗癌剂的联用效果的分析(试验例14)的结果(免疫组化染色结果)。

图11表示与其他抗癌剂的联用效果的分析(试验例14)的结果(细胞增殖标志物的定量结果)。

具体实施方式

在本说明书中，“含有”及“包含”的表述包含“含有”、“包含”、“实质上由...构成”及“仅由...构成”的概念。

1.化合物

本发明涉及一种包含在链状高分子上连接多个乌苯美司而成的链状结构的化合物(在本说明书中，有时也表示为“本发明的化合物”)。以下对其进行说明。

乌苯美司为下述式表示的化合物，其化学名称为(2s)-2-[(2s,3r)-3-氨基-2-羟基-4-苯基丁酰基氨基]-4-甲基戊酸。

[化学式2]

链状高分子只要可连接乌苯美司，则没有特别限制。作为链状高分子，从乌苯美司的连接容易性的角度出发，优选保持对乌苯美司所具有的官能团(例如，羧基、氨基、羟基等)具有反应性的官能团、例如氨基、羧基、羟基、醛基、羰基、有机卤化物等的链状高分子。此外，作为链状高分子，从更容易与通常带负电的细胞膜进行相互作用的角度出发，优选阳离子性链状高分子，优选保持例如氨基、胍基、咪唑基、脒结构等的阳离子性链状高分子。

作为链状高分子的优选的具体实例，可列举出多肽、多糖类、合成高分子(例如，乙烯基聚合物、聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺、聚醚、聚酯、聚氨酯等)等聚合物高分子、连接上述之中的两种以上而成的连接物。作为更优选的具体实例，可列举出其中的多肽。

链状高分子的平均分子量没有特别限制，例如为500～30000，优选为1000～20000，更优选为2000～15000，进一步优选为3000～10000，更进一步优选为4000～8000，特别优选为5000～7000。

当链状高分子为聚合物高分子时，其聚合度(整数)例如为5～200，优选为10～150，更优选为20～100，进一步优选为30～80，更进一步优选为35～50。

多肽包含一种或两种以上的氨基酸残基。

作为氨基酸残基，可以为天然氨基酸残基及合成氨基酸残基中的任意一种，是指例如氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。例如可列举出赖氨酸、精氨酸、组氨酸等具有碱性侧链的氨基酸残基；天冬氨酸、谷氨酸等具有酸性侧链的氨基酸残基；甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸等具有不带电的极性侧链的氨基酸残基；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸等具有非极性侧链的氨基酸残基；苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸等具有β-分枝侧链的氨基酸残基；酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸等具有芳香族侧链的氨基酸残基等。

在上述氨基酸残基之中，从更容易与通常带负电的细胞膜进行相互作用的角度出发，可优选列举出具有碱性侧链的氨基酸残基(碱性氨基酸残基，例如在侧链具有氨基的碱性氨基酸残基)，可更优选地列举出侧链为式(a)：-l^a-nh2(式中：l^a表示任选被取代的亚烷基；-表示单键)表示的基团的氨基酸残基，可进一步优选地列举出赖氨酸残基。

l^a所表示的亚烷基没有特别限制，例如可列举出碳原子数为1～8、优选为2～6、更优选为3～5的直链状或支链状(优选为直链状)的亚烷基。作为该亚烷基，可列举出亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基等。

当多肽包含碱性氨基酸残基时，相对于构成多肽的所有氨基酸残基100％，该碱性氨基酸残基的比例优选为50％以上，更优选为70％以上，进一步优选为90％以上，更进一步优选为95％以上，特别优选为100％。

此外，从更容易与通常带负电的细胞膜进行相互作用的角度出发，优选多肽中具有酸性侧链的氨基酸残基的比例更少，例如相对于构成多肽的所有氨基酸残基100％，期望该具有酸性侧链的氨基酸残基的比例优选为30％以下，更优选为10％以下，进一步优选为5％以下，更进一步优选为0％。

链状结构为在链状高分子上连接多个乌苯美司而成的结构。虽然不希望进行限定性的解释，但认为本发明的化合物通过使该化合物中的多个乌苯美司多价键合于cd13/apn，从而发挥高于单体乌苯美司的抗癌效果、特别是针对实体癌的更高的抗癌效果。

链状高分子与乌苯美司的连接方式没有特别限制。该连接例如为使链状高分子上的(优选为侧链上的)官能团与乌苯美司上的官能团进行反应而形成的键，优选为使链状高分子上的(优选为侧链上的)官能团与乌苯美司上的羧基进行反应而形成的键，更优选为链状高分子上的(优选为侧链上的)氨基与乌苯美司上的羧基的酰胺键。

连接于链状高分子的乌苯美司的数目例如为2～500，优选为2～100，更优选为5～50，进一步优选为5～30，更进一步优选为10～25。

当链状高分子为聚合物高分子时，相对于其聚合度100％，连接于链状高分子的乌苯美司的数目没有特别限制，例如为5～90％，优选为10～80％，更优选为20～70％，进一步优选为30～60％，更进一步优选为30～55％。

本发明的化合物可以仅由上述“链状结构”构成，也可以进一步包含其他结构。作为其他结构，例如可列举出可提高本发明的化合物的血中稳定性的结构、可提高本发明的化合物的癌组织蓄积性的结构等。作为其他结构，例如可列举出聚乙二醇链等的聚合物结构(优选为水溶性聚合物结构)、侧链具有两性离子结构的高分子、对癌细胞显示亲和性的适体、肽分子、抗体、抗体片段及将它们组合而成的结构等。

其他结构的平均分子量没有特别限制，从血中稳定性、癌组织蓄积性等角度出发，例如为2000～50000，优选为5000～20000。

其他结构连接在上述“链状结构”上的位置没有特别限制，优选其他结构连接于上述“链状结构”的末端(主链的末端)。

作为本发明的化合物的更具体的形态，可优选列举出通式(1)表示的化合物，可更优选列举出通式(1a)表示的化合物。

[化学式3]

式中：r¹表示“其他结构”、羟基或氢原子。r²在每次出现时独立地表示r^2a(构成作为聚合物高分子的链状高分子的单体)或r^2b(连接有乌苯美司的该单体)。n表示链状高分子的聚合度。

[化学式4]

式中：r¹表示“其他结构”或羟基。r²¹在每次出现时独立地表示r^21a(氨基酸残基的侧链)或r^21b(连接有乌苯美司的该侧链)。n表示链状高分子的聚合度。

规定通式的各个术语与上文中说明的相同。通式中，相对于n的数目100％，r^2b或r^21b的数目没有特别限制，例如为5～90％，优选为10～80％，更优选为20～70％，进一步优选为30～60％，更进一步优选为30～55％。

本发明的化合物也包含盐的形态。盐只要为药学上允许的盐则没有特别限定，可采用酸性盐及碱性盐中的任意一种。作为酸性盐的实例，例如可列举出盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等无机酸盐；乙酸盐、丙酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐等有机酸盐；天冬氨酸盐、谷氨酸盐等氨基酸盐等。此外，作为碱性盐的实例，可列举出钠盐、钾盐等碱金属盐；钙盐、镁盐等碱土类金属盐等。

本发明的化合物也包含溶剂化物的形态。溶剂只要为药学上允许的溶剂则没有特别限定，例如可列举出水、乙醇、甘油、乙酸等。

能够使用各种方法来合成本发明的化合物。例如能够通过使链状结构或链状结构与其他结构的连接结构物同乌苯美司进行反应而得到。该反应的种类、条件等可根据链状高分子的种类、特别是链状高分子所具有的官能团等，进一步可根据与该官能团反应的乌苯美司上的官能团的种类等而进行适当设计。例如，在本发明的化合物中，当通式(1a)表示的化合物内的乌苯美司与链状高分子的连接为酰胺键时，例如能够按照或根据以下的反应方案i而合成，以下，对该反应方案i进行详细说明。

[化学式5]

式中，除r^21aa以外的各符号与上述相同。r^21aa表示具有氨基的氨基酸残基的侧链。

本反应中，通过使化合物a与乌苯美司进行反应，能够得到通式(1a)表示的化合物。另外，根据需要，期望使用乌苯美司的保护体(例如三氟乙酸保护体)以代替乌苯美司。

从收率等角度出发，相对于1重量份的化合物a，乌苯美司和/或其保护体的使用量通常优选为0.1～2重量份，更优选为0.3～1.2重量份。

本反应优选在缩合剂的存在下进行。作为缩合剂，没有特别限制，例如可广泛使用公知的缩合剂。作为缩合剂，可优选列举出dmt-mm(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐n水合物)等三嗪类缩合物。缩合剂可以单独使用一种，也可以组合使用两种以上。

缩合剂的使用量根据缩合剂的种类的不同而不同，作为一个实例，相对于1摩尔的乌苯美司和/或其保护体，缩合剂的使用量优选为0.7～1.5摩尔，更优选为1.0～1.2摩尔。

本反应通常在反应溶剂的存在下进行。作为反应溶剂，没有特别限制，例如可列举出水等。溶剂可以单独使用，此外，也可以同时使用多种溶剂。此外，优选在溶剂中添加碳酸盐缓冲剂等缓冲剂。

关于反应温度，可在加热下、常温下及冷却下中的任意一种条件下进行，通常优选在0～50℃(特别是10～30℃)下进行。反应时间没有特别限制，通常可设为4小时～48小时，特别是可设为8小时～24小时。

能够使用如色谱法这样的通常的方法来追踪反应的进行。反应结束后，能够根据需要进行脱保护处理，然后蒸馏去除溶剂，并使用色谱法、重结晶法等通常的方法对产物进行分离提纯。此外，可利用元素分析、ms(fd-ms)分析、ir分析、¹h-nmr、¹³c-nmr等鉴定产物的结构。

2.用途

本发明的化合物具有细胞增殖抑制效果、细胞凋亡促进效果、cd13/apn酶活性抑制效果、细胞内活性氧增加效果等。因此，本发明的化合物可用作药物、试剂等(在本说明书中，有时也表示为“本发明的药剂”)的有效成分，更具体而言，可用作抗癌剂、细胞增殖抑制剂、细胞凋亡促进剂、cd13/apn酶活性抑制剂、细胞内活性氧增加剂等的有效成分。

本发明的药剂只要含有本发明的化合物，则没有特别限制，也可以根据需要进一步含有其他成分。作为其他成分，只要为药学上允许的成分，则没有特别限定。作为其他成分，除了含有具有药理作用的成分以外，还可含有添加剂。作为添加剂，例如可列举出基质、载体、溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、增稠剂、保湿剂、着色剂、香料、螯合剂等。

另外，本发明的化合物可单独发挥上述效果等。因此，本发明的药剂即使不含有具有上述效果和/或作用的其他成分，也能够发挥其所需的效果，但也可以含有具有药理作用的其他成分。

本发明的化合物能够与其他抗癌剂联用。由此，可发挥进一步得到了提升的效果。作为其他抗癌剂，没有特别限制，能够使用各种抗癌剂。作为抗癌剂，例如可列举出烷化剂、抗代谢药、微管抑制剂、抗生素抗癌剂、拓扑异构酶抑制剂、铂制剂、分子靶向药物、激素制剂、生物制剂等，可优选列举出抗代谢药、抗生素抗癌剂、铂制剂等。

作为烷化剂，例如可列举出环磷酰胺、异环磷酰胺、亚硝基脲、达卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、马法兰、丙卡巴肼、雷莫司汀等。

作为抗代谢药，例如可列举出依诺他滨、卡莫氟、卡培他滨、替加氟、优福定、替吉奥、吉西他滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸钠、奈拉滨、氟尿嘧啶、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、甲氨蝶呤、克拉屈滨、去氧氟尿苷、羟基脲、巯嘌呤等。

作为微管抑制剂，例如可列举出长春新碱等生物碱类抗癌剂、多西他赛、紫杉醇等紫杉烷类抗癌剂。

作为抗生素抗癌剂，例如可列举出丝裂霉素c、阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、博莱霉素、放线菌素d、阿克拉霉素、伊达比星、吡柔比星、培洛霉素、米托蒽醌、氨柔比星、净司他丁斯酯等。

作为拓扑异构酶抑制剂，可列举出具有拓扑异构酶i抑制作用的cpt-11、伊立替康、拓扑替康(nogitecan)、具有拓扑异构酶ii抑制作用的依托泊苷、索布佐生。

作为铂制剂，例如可列举出顺铂、奈达铂、奥沙利铂、卡铂等。

作为激素制剂，例如可列举出地塞米松、非那司提、他莫昔芬、阿那曲唑、依西美坦、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、比卡鲁胺、氟他胺、泼尼松龙、亮丙瑞林、来曲唑、雌莫司汀、托瑞米芬、磷雌酚、米托坦、甲睾酮、甲羟孕酮、美雄烷等。

作为生物制剂，例如可列举出干扰素α、干扰素β及干扰素γ、白细胞介素2、乌苯美司、干燥bcg等。

作为分子靶向药物，例如可列举出利妥昔单抗、阿仑单抗、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、吉非替尼、厄洛替尼、坦罗莫司、贝伐单抗、vegftrap、舒尼替尼、索拉非尼、托珠单抗、硼替佐米、吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab-ozogamicin)、替伊莫单抗奥唑米星(ibritumomab-ozogamicin)、替伊莫单抗、他米巴罗汀、维甲酸等。除此处指定的分子靶向药物以外，还可含有人表皮生长因子受体2抑制剂、表皮生长因子受体抑制剂、bcr-abl酪氨酸激酶抑制剂、表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂、mtor抑制剂、血管内皮生长因子受体2抑制剂(α-vegfr-2抗体)等以血管生成为目标的抑制剂、map激酶抑制剂等各种酪氨酸激酶抑制剂、以细胞因子为靶向的抑制剂、蛋白酶体抑制剂、抗体-抗癌剂配合物等分子靶向药物等。上述抑制剂中也包含抗体。

本发明的药剂的使用方式没有特别限制，可根据其种类而采用适宜的使用方式。本发明的药剂根据其用途，例如能够在体外使用(例如，添加至培养细胞的培养基中)，也能够在体内使用(例如，给药于动物)。

本发明的药剂的适用对象没有特别限定，哺乳动物中，例如可列举出人、猴、小鼠、大鼠、犬、猫、兔、猪、马、牛、绵羊、山羊、鹿等。此外，作为细胞，可列举出动物细胞等。细胞的种类也没有特别限制，例如可列举出血细胞、造血干细胞/祖细胞、配子(精子、卵子)、成纤维细胞、上皮细胞、血管内皮细胞、神经细胞、肝细胞、角质形成细胞、肌细胞、表皮细胞、内分泌细胞、es细胞、ips细胞、组织干细胞、癌细胞等。

将本发明的药剂用作抗癌剂时以及将其用于癌细胞时，作为目标癌症，没有特别限制，例如可列举出肝细胞癌、胰腺癌、肾癌、白血病、食管癌、胃癌、大肠癌、肺癌、前列腺癌、皮肤癌、乳腺癌、宫颈癌等。其中，优选实体癌，更优选肝细胞癌。

本发明的药剂可以为任意的剂型，例如可采用片剂(包含口腔崩解片、咀嚼片、泡腾片、锭剂、果冻状滴剂(jelly-likedrops)等)、丸剂、颗粒剂、细粒剂、散剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、干糖浆剂、液体制剂(包含健康饮品、混悬剂、糖浆剂)、胶冻剂(ゼリー剤)等口服制剂形态；注射用制剂(例如，滴注剂(例如静脉滴注用制剂等)、静脉注射剂、肌肉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂)、外用剂(例如，软膏剂、凝胶膏剂、洗剂)、栓剂、吸入剂、滴眼剂、眼膏剂、滴鼻剂、滴耳剂、脂质体制剂等非口服制剂形态。

作为本发明的药剂的给药途径，只要可得到所需的效果，则没有特别限制，可列举出口服给药、管饲、灌肠给药等经胃肠道给药；静脉给药、动脉给药、肌内给药、心内给药、皮下给药、皮内给药、腹腔给药等非口服给药等。

本发明的药剂中的有效成分的含量受使用方式、适用对象、适用对象的状态等左右，没有限定，但例如可设为0.0001～100重量％，优选设为0.001～50重量％。

将本发明的药剂给药于动物时的给药量只要为发挥药效的有效量，则没有特别限定，通常，以有效成分的重量计，在常规口服给药的情况下，为每天0.1～1000mg/kg体重，优选为每天0.5～500mg/kg体重，在非口服给药的情况下，为每天0.01～100mg/kg体重，优选为0.05～50mg/kg体重。上述给药量也可根据年龄、病情、症状等而适当增减。

实施例

以下，基于实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不受这些实施例限定。

合成例1.peg-b-plys(ube)20的合成

以以下方式合成包含链状结构的化合物，所述链状结构通过使聚乙二醇与多聚赖氨酸的嵌段共聚物(peg-b-plys)的20％的赖氨酸残基的侧链上的氨基同乌苯美司的羧基经酰胺键连接而成，具体而言，合成图2的a及图2的b中示出的结构式中的n＝8的化合物。

合成例1-1.peg-b-plys的合成

取1.1g的在一个末端具有甲氧基、在另一个末端具有氨基的聚乙二醇(peg)(平均分子量为10000)，并溶解于10ml的二甲基亚砜中。将1.3g的n-(4-(2,5-二氧代-4-噁唑烷基)丁基)-2,2,2-三氟乙酰胺(lys(tfa)-nca)溶解于10ml的二甲基亚砜。在氩气氛围下混合得到的两个溶液，于室温下搅拌过夜。接着，将反应溶液倒入过量的乙醚中从而使产物再次沉淀并进行回收，进行减压干燥。将得到的白色粉末溶解于100ml的甲醇/1mnaoh水溶液(9/1[v/v])的混合溶液中，于35℃搅拌过夜。用盐酸将反应溶液的ph中和至1～2。进一步进行透析处理，经冷冻干燥得到白色粉末(1.1g，收率61％)。

通过¹hnmr解析确认结构，确认到为赖氨酸链的平均聚合度为40的peg-b-plys(d2o、内标物tspa、δ(ppm)：1.3-1.9(240h,m,co-ch-ch2-ch2-ch2-ch2-nh2),3.0(80h,m,co-ch-ch2-ch2-ch2-ch2-nh2),3.6-3.8(912h,m,ch3-o-(ch2-ch2-o)-ch2-ch2-ch2),4.3(40h,m,co-ch-ch2-ch2-ch2-ch2-nh2)。

合成例1-2.乌苯美司的三氟乙酸保护体的合成

将1.5g的乌苯美司溶解于15ml的甲醇中。向得到的溶液中加入900mg的三乙胺、1350mg的三氟乙酸乙酯，于室温下搅拌2天。接着，在减压下去除液体成分，在10ml的盐酸(0.01m)中再次沉淀。对得到的白色粉末进行减压干燥，从而得到目标产物(1.8g，92％)。

通过¹hnmr解析确认其为目标结构(meod、内标物tms、δ(ppm)：0.9(6h,d,(ch3)2-ch-ch2),1.3(1h,m,(ch3)2-ch-ch2-ch-cooh),1.6(2h,t,(ch3)2-ch-ch2-ch-cooh),2.9-3.1(2h,m,c6h5-ch2-ch-ch-oh),4.1(1h,d,c6h5-ch2-ch-ch-oh),4.5(1h,m,c6h5-ch2-ch-ch-oh),4.6(1h,t,(ch3)2-ch-ch2-ch-cooh),7.1-7.3(5h,m,c6h5-ch2-ch-ch-oh)。

合成例1-3.peg-b-plys(ube)20的合成

将300mg的peg-b-plys溶解于20ml的碳酸盐缓冲液(50mm，ph7.4)中。添加160mg的乌苯美司的三氟乙酸保护体与125mg的dmt-mm，于室温下搅拌过夜。进一步，用纯水对得到的水溶液进行透析处理，进行冷冻干燥，由此得到白色粉末。接着，将得到的白色粉末溶解于10ml的甲醇/水(1/2[v/v])的混合溶液中，加入130mg的碳酸钾后，于37℃静置三天。用纯水对得到的溶液进行透析后进行冷冻干燥，由此得到白色粉末(280mg，收率76％)。

进行¹hnmr解析，确认到其为在peg-b-plys的赖氨酸侧链的20％中导入有乌苯美司的结构(peg-b-plys(ube)20)(meod、内标物tms、δ(ppm)：0.9(48h,m,(ch3)2-ch-ch2-ch-conh),1.3-2.3(264h,m,(ch3)2-ch-ch2-ch-conh,co-ch-ch2-ch2-ch2-ch2-nhco),2.9-3.2(96h,m,c6h5-ch2-ch-ch-oh,co-ch-ch2-ch2-ch2-ch2-nhco),3.6-3.8(912h,m,ch3-o-(ch2-ch2-o)-ch2-ch2-ch2),3.9-4.7(64h,m,c6h5-ch2-ch-ch-oh,c6h5-ch2-ch-ch-oh,(ch3)2-ch-ch2-ch-conh,co-ch-ch2-ch2-ch2-ch2-nhco),7.1-7.3(40h,m,c6h5-ch2-ch-ch-oh)。

合成例2.peg-b-plys(ube)35的合成

以以下方式合成包含链状结构的化合物，所述链状结构通过使peg-b-plys的35％的赖氨酸残基的侧链上的氨基与乌苯美司的羧基经酰胺键连接而成，具体而言，合成图2的a及图2的b中示出的结构式中的n＝14的化合物。

将100mg的peg-b-plys溶解于10ml的碳酸盐缓冲液(50mm，ph7.4)中。加入54mg的乌苯美司的三氟乙酸保护体与41mg的dmt-mm，于室温下搅拌过夜。进一步，用纯水对得到的水溶液进行透析处理，进行冷冻干燥，由此得到白色粉末。接着，将得到的白色粉末溶解于5ml的甲醇/水(1/2[v/v])的混合溶液中，加入46mg的碳酸钾后，于40℃搅拌两天。用纯水对得到的溶液进行透析后进行冷冻干燥，由此得到白色粉末(80mg，收率63％)。

进行¹hnmr解析，确认到其为在peg-b-plys的赖氨酸侧链的35％中导入有乌苯美司的结构(peg-b-plys(ube)35)(meod、内标物tms、δ(ppm)：0.9(84h,m,(ch3)2-ch-ch2-ch-conh),1.3-2.3(282h,m,(ch3)2-ch-ch2-ch-conh,co-ch-ch2-ch2-ch2-ch2-nhco),2.9-3.2(108h,m,c6h5-ch2-ch-ch-oh,co-ch-ch2-ch2-ch2-ch2-nhco),3.6-3.8(912h,m,ch3-o-(ch2-ch2-o)-ch2-ch2-ch2),3.9-4.7(82h,m,c6h5-ch2-ch-ch-oh,c6h5-ch2-ch-ch-oh,(ch3)2-ch-ch2-ch-conh,co-ch-ch2-ch2-ch2-ch2-nhco),7.1-7.3(70h,m,c6h5-ch2-ch-ch-oh)。

合成例3.peg-b-plys(ube)50的合成

以以下方式合成包含链状结构的化合物，所述链状结构通过使peg-b-plys的50％的赖氨酸残基的侧链上的氨基与乌苯美司的羧基经酰胺键连接而成，具体而言，合成图2的a及图2的b中示出的结构中的n＝20的化合物。

将300mg的peg-b-plys溶解于20ml的碳酸盐缓冲液(50mm，ph7.4)中。加入320mg的乌苯美司的三氟乙酸保护体与250mg的dmt-mm，于室温下搅拌过夜。进一步，用纯水对得到的水溶液进行透析处理，进行冷冻干燥，由此得到白色粉末。接着，将得到的白色粉末溶解于10ml的甲醇/水(1/2[v/v])的混合溶液中，加入260mg的碳酸钾后于37℃静置三天。用纯水对得到的溶液进行透析后进行冷冻干燥，由此得到白色粉末(360mg，收率81％)。

进行¹hnmr解析，确认到其为在peg-b-plys的赖氨酸侧链的50％中导入有乌苯美司的结构(peg-b-plys(ube)50)(meod、内标物tms、δ(ppm)：0.9(120h,m,(ch3)2-ch-ch2-ch-conh),1.3-2.3(300h,m,(ch3)2-ch-ch2-ch-conh,co-ch-ch2-ch2-ch2-ch2-nhco),2.9-3.2(120h,m,c6h5-ch2-ch-ch-oh,co-ch-ch2-ch2-ch2-ch2-nhco),3.6-3.8(912h,m,cah3-o-(ch2-ch2-o)-ch2-ch2-ch2),3.9-4.7(100h,m,c6h5-ch2-ch-ch-oh,c6h5-ch2-ch-ch-oh,(ch3)2-ch-ch2-ch-conh,co-ch-ch2-ch2-ch2-ch2-nhco),7.1-7.3(100h,m,c6h5-ch2-ch-ch-oh)。

试验例1.使用了3d培养系统的抗肿瘤效果的评价

使用含有500μg/ml的抗生素青霉素-链霉素与10％fbs的达尔伯克改良伊格尔培养基(dmem)(以下称作完全培养基)，在调节至37℃、5％co2的培养箱中进行细胞的培养(以下的试验例也相同)。为了进行3d培养，将8×10³个huh7细胞接种于96孔的cell-able(toyogosei，注册商标)中，于37℃培养3天。用显微镜确认到在孔上几乎均匀地形成了半球形后，向各个孔中添加被测物质(乌苯美司(freeubenimex(未经处理的乌苯美司))、peg-b-plys(ube)35或peg-b-plys(ube)50)，于37℃进一步培养2天。然后，用dapi溶液将细胞染色30分钟，用酶标仪在570nm处测定培养板的吸光度，并测定650nm处的吸光度。结果以相对于未经处理的对照的吸光度的百分比表示。

将结果示于图2的c。如图2的c所示，可知peg-b-plys(ube)35或peg-b-plys(ube)50以低于乌苯美司的浓度发挥了显著高于乌苯美司的抗肿瘤效果。

试验例2.基于mtt测定的抗肿瘤效果的评价

使用96孔细胞培养板，在包含被测物质(乌苯美司、peg-b-plys(ube)35或peg-b-plys(ube)50)的培养基中培养huh7细胞。培养72小时后，向各个孔中添加10μl(50μg)的mtt，于37℃培养4小时。接着，去除培养基并添加100μl的酸性异丙醇，使甲臜结晶溶解，利用微孔板震荡器平稳地振荡15分钟。用酶标仪在570nm处测定培养板的吸光度，并测定650nm处的吸光度。结果以相对于未经处理的对照的吸光度的百分比表示。

将结果示于图2的d。在基于mtt测定的评价中，得到了与图2的c相同的结果。

试验例3.对cd13/apn酶活性的效果的评价

使用作为cd13/apn的底物的l-亮氨酸对硝基苯胺(peptideinstitute，inc)，以分光光度法测定cd13/apn酶活性。将hepg2细胞悬液接种于96孔板的各个孔中，所述hepg2细胞悬液在200μl的pbs中有5×10⁵个细胞。然后以使最终浓度为1.6mm的方式添加上述底物，进一步以使换算为乌苯美司的最终浓度为100μg/ml的方式添加被测物质(乌苯美司或peg-b-plys(ube)50)。于37℃培养60分钟后，使用酶标仪(perkinelmerenspire2300multimodeplatereader)测定405nm处的吸光度，由此评价cd13/apn酶活性。

将结果示于图3的a。如图3的a所示，可知与乌苯美司相比，peg-b-plys(ube)50显著地抑制了cd13/apn酶活性。

试验例4.cd13/apn敲低对抗肿瘤效果的影响的分析

将以cd13/apn为靶标的2个shrna(sh1：序列号1、及sh2：序列号2)克隆于慢病毒载体plko中。将载体与包含gag/pol、rev及vg基因的表达载体一同共转染至huh7细胞中。转染48小时后收集慢病毒，添加5μg/ml的凝聚胺。用收集的慢病毒感染huh7细胞，用1μg/ml的嘌呤霉素筛选2周。用定量rt-pct及蛋白质印迹法确认得到的细胞的cd13/apn表达量，确认到cd13/apn被敲低。使用cd13/apn敲低细胞及作为其亲株的huh7细胞(parent)，以与试验例2相同的方式进行mtt测定。

将结果示于图3的b。如图3的b所示，可知peg-b-plys(ube)50的抗肿瘤效果因cd13/apn敲低而减弱。该结果及试验例3的结果(图3的a)暗示了，通过抑制cd13/apn的酶活性而发挥peg-b-plys(ube)50的抗肿瘤效果。

试验例5.对细胞内活性氧(ros)量的影响的分析

cellroxdeepredreagent由invitrogen(carlsbad，ca)购入，测定细胞内的ros水平。用100μg/ml的被测物质(乌苯美司或peg-b-plys(ube)50)处理hepg2细胞。于37℃培养6小时，将样品的细胞浓度调节至5×10³个细胞/ml。然后，使用cellroxdeepredreagent(1mm，invitrogen)，一边避光一边将细胞于37℃培养30分钟。进一步，使用sytoxbluedeadcellstain(5mm，invitrogen)进行染色，由此用流式细胞术排除死细胞并计数。用cantoii流式细胞仪(bdbiosciences)进行流式细胞术分析。

将结果示于图4的a。如图4的a所示，可知乌苯美司具有提高细胞内ros水平的效果，且peg-b-plys(ube)50的该效果显著优于乌苯美司。

试验例6.对细胞凋亡的影响的分析

以与试验例5相同的方式用被测物质(乌苯美司或peg-b-plys(ube)50)处理hepg2细胞。关于该细胞的细胞凋亡测定，根据制造商的实验方案，使用annexinv-fitc细胞凋亡检测试剂盒(biovision，mountainview，ca)，进行流式细胞术。对hepg2细胞(5×10⁵个细胞)进行胰蛋白酶处理，用pbs平稳地洗涤2次，接着再混悬于500μl的1×bindingbuffer中，以进行流式细胞术分析。添加5μl的annexinv-fitc及碘化丙啶(pi)，并在暗处/室温下对细胞染色5分钟。使用cantoii流式细胞仪(bdbiosciences)测定fitc结合膜联蛋白v的绿色荧光、及dna结合pi的红色荧光。

将结果示于图4的b。如图4的b所示，可知乌苯美司具有诱导细胞凋亡的效果，且peg-b-plys(ube)50的该效果显著优于乌苯美司。

试验例7.与其他抗癌剂的联用效果的分析1

作为被测物质，使用各种浓度的peg-b-plys(ube)50与各种浓度的其他抗癌剂(5-fu、cddp或dxr)的组合，并使用huh7细胞或hepg2细胞，以与试验例2相同的方式进行mtt测定。基于得到的结果，进行等辐射分析。将合用指数(combinationindex；ci)作为使用中效制图分析而对复合效果进行分析的手段而进行。按照式[ci＝(da/d30a)+(db/d30b)]计算ci。此处，d30a为产生效果的30％所需的药物a(peg-b-plys(ube)50)的浓度，da为与db组合时产生效果的30％所需的药物a的浓度。同样的，d30b为产生效果的30％所需的药剂b(其他抗癌剂)的浓度，db为与da组合时产生效果的30％所需的药剂b的浓度。ci值的定义如下：<0.8＝协同作用；0.8～1.2＝相加效果；>1.2＝拮抗作用。

将结果示于图5的a及图5的b。根据该结果，计算的ci均小于0.8。由此可知，peg-b-plys(ube)50通过与其他抗癌剂(5-fu、cddp或dxr)联用，从而发挥协同作用。

试验例8.抗肿瘤效果的体内分析

从cleajapan购入8周龄的nod/scid，在没有病原体的环境下进行饲养。将huh7细胞(5×10⁶个细胞)混合于50μl的pbs及50μl的基质胶(matrigel)(bdbiosciences)中，皮下移植至小鼠的背部。当皮下肿瘤体积达到100mm³后，每隔1天腹腔给药pbs、peg-b-plys及peg-b-plys(ube)50中的任意一种。皮下肿瘤体积以(最大直径)×(最短直径)²÷2进行计算。在所有的组中，将给药量设为100μl，peg-b-plys(ube)50的浓度设为1mg/ml。另外，以使浓度与1mg/ml的peg-b-plys(ube)50溶液所含有的peg-b-plys的浓度相同的方式调节peg-b-plys的浓度。对于peg-b-plys及peg-b-plys(ube)50治疗组的小鼠，进行治疗至开始给药后的第21天，第24天使其安乐死。对于pbs处理组的小鼠，打算最初进行与peg-b-plys及peg-b-plys(ube)50处置组相同的处置后，实施安乐死。然而，由于一只小鼠的肿瘤超过了2cm，因此从伦理角度出发，不得不将安乐死的时间提前，在开始给药后的第18天使其安乐死。

将结果示于图6。如图6所示，可知通过给药peg-b-plys(ube)50，肿瘤显著缩小。

试验例9.膜通透性的分析

用alexa647标记peg-b-plys(ube)50，得到标记化合物。将10μl的标记化合物的dmso溶液(2.5mm)与990μl的hbss(ph6.5)混合，涡旋10分钟，得到试验溶液(500μm标记化合物溶液)。将300μl的试验溶液添加至caco-2细胞(在transwell中培养21天)中，在孔(well)的下方添加1ml的含bsa的hbss(ph7.4)，于37℃培养2小时。分别回收孔的上方及下方的液体，使用荧光检测仪(m1000，tecangroupltd.制造)分别对150μl的孔的上方的样品(s)：10μl(+含bsa的hbss：140μl)与孔的下方的样品(m)进行荧光(650nm/668nm)测定后，基于得到的荧光强度计算通透系数(apparentpermeabilitycoefficient；papp)。

其结果，标记化合物的通透系数(papp(10^-6cm/秒))小于0.1，可知标记化合物几乎不穿透膜。

试验例10.cyp抑制性的分析

反应溶液的组成如下所示。

peg-b-plys(ube)50：终浓度0.1、1、10μm

肝微粒体：终浓度0.1mgprotein/ml

辅酶组(nadph、g-6-p、mgcl2)

g6pdh

模型底物mix(对于时间依赖性抑制的情况，在反应60分钟后添加上述组成)

混合上述组成(最终容量200μl)，得到反应溶液。于37℃培养20分钟后，添加200μl的乙腈，涡旋30秒钟。进行离心(3500rpm，20分钟)后，使用lc/ms分析上清液，计算各模型底物的峰面积。根据各模型底物的剩余量计算cyp抑制性(10μm时的抑制率与可计算的情况下的ic50值)。

将结果示于表1。如表1所示，未观察到对各种cyp的抑制活性。

试验例11.药代动力学的分析

以使alexa647标记peg-b-plys(ube)50成为1mg/ml的方式用pbs对其进行溶解。以3.33mg/kg将alexa647标记peg-b-plys(ube)50溶液给药至c57bl/6jjcl小鼠(10-20周龄)的腹腔内(n＝5)。在开始给药0.5、2、8、48小时后从各小鼠的中心静脉采血，然后摘取心脏、肺、肝脏、肾脏、脾脏。用pbs清洗摘取的组织，去除水分后，进行称重。加入脏器的重量(mg)×4μl的裂解缓冲液(wakopurechemicalindustries,ltd.)并用多珠震荡器进行破碎。破碎后，以8,400×g、5分钟、4℃进行离心分离，将50μl上清液转移至96孔板(黑色)，使用荧光检测仪(enspire，perkinelmer公司)进行荧光(610nm/670nm)测定。在采血后，通过以860×g、15分钟、4℃进行离心分离，从而将血液分离成血浆与血细胞成分，并对血浆中的药物浓度进行定量。将alexa647标记peg-b-plys(ube)50加标到未经处置的小鼠的各个组织中，由此制作校准曲线，对各组织中的药物进行定量。

其结果，给药的alexa647标记peg-b-plys(ube)50的大部分在48小时以内消失。alexa647标记peg-b-plys(ube)50在肾脏中分布最多。

将结果示于图7。

试验例12.心脏毒性的分析

将源自人ips细胞的心肌细胞：carmya-human(myoridge)接种于被基质胶包被的384孔板(8,000个细胞/孔)中，每天更换培养基并培养1周。添加染色试剂：cal520am(aatbioquest,inc.)(终浓度5μm)。添加peg-b-plys(ube)50(终浓度：2、6.7、20μm(n＝2))。在添加peg-b-plys(ube)50之前、添加10分钟后、添加30分钟后，进行钙通量测定(使用fdss7000(hamamatsuphotonicsk.k.))。

其结果，虽观察到了峰间距因添加化合物而稍稍变宽的倾向，但并没有观察到引发qt延长或心动过速的倾向。

试验例13.溶解度的分析

将10μl的试验例9中得到的标记化合物的dmso溶液(10mm)与990μl的pbs混合(＝1％dmso)，涡旋10分钟，得到试验溶液(alexa647标记化合物的1％dmso/pbs溶液(100μm))。用过滤板(multiscreenhts-pcf)过滤250μl试验溶液，使用荧光检测仪(m1000，tecangroupltd.制造)对200μl所得到的过滤样品进行荧光(650nm/668nm)测定。此外，以化合物的5％dmso/pbs溶液作为对照而进行相同的操作。比较对照(100μm)的荧光值与样品的荧光值。

其结果，计算出peg-b-plys(ube)50在pbs中的溶解度为73.7μm。

试验例14.与其他抗癌剂的联用效果的分析2

从cleajapan购入8周龄的nod/scid，在spf环境下进行饲养。将huh7细胞(5×10⁶个细胞)混合于50μl的pbs及50μl的基质胶(bdbiosciences)中并皮下移植至小鼠的背部。当皮下肿瘤体积达到100mm³后，每隔1天腹腔给药pbs、cddp或cddp与peg-b-plys(ube)50这两者。皮下肿瘤体积以(最大直径)×(最短直径)²÷2进行计算。将结果示于图8。

通过用10％甲醛处理24小时来固定所有的小鼠的组织，将其包埋在石蜡中并切成5μm切片。使用所得到的切片进行苏木精-伊红染色及免疫组化染色。将抗bax抗体(商品目录号ab32503；abcam，cambridge，uk)用于bax阳性细胞的计数。也以相同的方式使用了抗ki67抗体(商品目录号ab15580；abcam)及抗pcna抗体(商品目录号ab18197；abcam)。在随机的三个不同的视野中分析bax、pcna及ki67表达，评价阳性细胞的平均比例。将结果示于图9～11。

其结果可知，与单独的cddp相比，peg-b-plys(ube)50联用组的肿瘤体积显著缩小，并且在体内，peg-b-plys(ube)50与现有的抗癌剂也显示出了协同作用。此外，给药peg-b-plys(ube)50在组织学上并没有对肝脏、肾脏及肺造成不良影响。与单独的cddp相比，peg-b-plys(ube)50联用组中bax的表达显著较高，细胞增殖标志物则显著较低。

<110>国立大学法人大阪大学

国立大学法人东京工业大学

<120>抗癌剂

<130>khp202112449.5

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<212>dna

<213>人工序列

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