靶向淋巴细胞活化基因3(LAG-3)的核酸适体及其用途的制作方法

靶向淋巴细胞活化基因3(lag
‑
3)的核酸适体及其用途
1.相关申请
2.本申请根据35 u.s.c.
§
119要求于2018年6月12日提交的美国临时申请号62/684,139以及于2018年10月3日提交的美国临时申请号62/740,751的权益，其各自的全部内容通过引用并入本文。


背景技术：

3.活化的t细胞表达多种共抑制分子(称为免疫检查点分子)以调节t细胞反应。示例性免疫检查点分子包含程序性细胞死亡蛋白1(pd
‑
1)、淋巴细胞活化基因3(lag
‑
3)和细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla
‑
4)。这些免疫检查点分子在维持免疫稳态和预防自身免疫中起重要作用。
4.免疫检查点分子通常在癌症中被活化，导致抗肿瘤免疫反应被抑制。因此，免疫检查点抑制剂疗法为多种癌症提供了有效的长期治疗。然而，仅发现一部分癌症患者对这些治疗有响应。因此，开发用于通过调节免疫细胞活性(诸如t细胞增殖和活化)来抑制免疫检查点靶标以用于治疗癌症和其他疾病的新药剂是非常有意义的。


技术实现要素：

5.本公开至少部分基于单体形式或四聚体形式的核酸适体的开发，该核酸适体以高亲和力结合人淋巴细胞活化基因3(lag
‑
3)并通过例如破坏lag
‑
3与mhc ii类分子之间的相互作用来调节免疫反应。出乎意料的是，这种核酸适体单独显示抗肿瘤活性并增强检查点抑制剂(诸如抗pd
‑
1抗体)的抗肿瘤活性。
6.因此，本公开的一个方面的特征在于一种能够结合人lag
‑
3的核酸适体。这种核酸适体可包括以下核苷酸基序：gx1gggx2ggtx3a(seq id no：1)，其中x1和x2各自独立地为g、c或不存在，并且x3为t或c。在一个实例中，该核苷酸基序可以为ggggggggtta(seq id no：2)。替代地，该核酸适体可包括以下核苷酸基序：l
‑
(g)n
‑
l'，其中n为5
‑
9的整数(包含5和9)(seq id no：3
‑
7)，以及l和l'为具有互补序列的核苷酸区段(例如，每个含有5
‑
8个核苷酸)。
7.本文所述的任何核酸适体可包括与以下核苷酸序列之一至少85％(例如，至少90％，至少95％或更高)相同的核苷酸序列：
8.(i)tggggggggttagttcaatacatgcgggcg(seq id no：8)；
9.(ii)tgggggggggttagacttacactcttattcg(seq id no：9)；
10.(iii)agaggggggggttagctgctttaactcatg(seq id no：10)；以及
11.(iv)agggggggggttactgcgcatgtatctcag(seq id no：11)。
12.在一些实例中，核酸适体包括上述核苷酸序列之一。
13.在一个实例中，核酸适体包括核苷酸序列tggggggggttagttcaatacatg(seq id no：12)。具体实例包含：
14.(a)
15.tccctacggcgctaactggggggggttagttcaatacatgcgggcggccaccgtgctacaac(seq id no：13)；
16.(b)acggcgctaactggggggggttagttcaatacatg(seq id no：14)；
17.(c)gctaactggggggggttagttcaatacatgcgggc(seq id no：15)；以及
18.(d)ctggggggggttagttcaatacatgcgggcggcca(seq id no：16)。
19.在另一方面，本公开的特征在于多聚体核酸适体(例如，四聚体适体)，其包括第一多核酸、第一核酸适体和第二核酸适体。第一多核酸可包括核苷酸序列式5'
‑
x
‑
l1‑
y
‑
l2‑
z
‑
3'，其中x和z各自为与第一核酸适体和/或第二核酸适体的一部分互补的核苷酸区段，l1和l2各自独立地为接头，以及y为具有回文序列的核苷酸区段。第一核酸适体和第二核酸适体可与第一多核酸的x和z区形成双链体。
20.在一些实施例中，本文所述的多聚体核酸适体还可包括第二多核酸、第三核酸适体和第四核酸适体。第二多核酸包括核苷酸序列式5'
‑
x'
‑
l1'
‑
y
‑
l2'
‑
z'
‑
3'，其中x'和z'各自为与第三核酸适体和/或第四核酸适体的一部分互补的核苷酸区段，l1'和l2'各自独立地为接头或不存在，以及y为具有回文序列的核苷酸区段。第三核酸适体和第四核酸适体可与第二多核酸的x'和z'区形成双链体。第一多核酸和第二多核酸可在y区的回文序列处形成双链体。
21.在一些实施例中，本文所述的多聚体核酸适体可包括至少两种对同一目的靶分子具有特异性的核酸适体。在一些实例中，本文所述的多聚体核酸适体可包括至少两个相同的核酸适体。在一些实例中，多聚体核酸适体中的所有核酸适体部分均是相同的。
22.在其它实施例中，本文所述的多聚核酸适体可包括至少两种对不同目的靶分子具有特异性的核酸适体。在一些实例中，本文所述的多聚体核酸适体可包括至少两种不同的核酸适体。在一些实例中，多聚体核酸适体中的所有核酸适体部分均是不同的。
23.在一些实施例中，任何多聚体核酸适体中的第一核酸适体、第二核酸适体、第三核酸适体和第四核酸适体中的至少一个可以为本文公开的能够结合人lag
‑
3的那些核酸适体。
24.在又一方面，本公开提供了多聚体核酸复合物，其包括第一多核酸和任选地第二多核酸。第一多核酸包括核苷酸序列式5'
‑
x
‑
l1‑
y
‑
l2‑
z
‑
3'，其中x表示第一核酸，z表示第二核酸，l1和l2各自独立地为接头，以及y为具有回文序列的核苷酸区段。第二多核酸包括核苷酸序列式5'
‑
x'
‑
l1'
‑
y'
‑
l2'
‑
z'
‑
3'，其中x'表示第三核酸，z'表示第四核酸，l1'和l2'各自独立地为接头或不存在，以及y为具有回文序列的核苷酸区段；其中第一多核酸和第二多核酸在回文序列区形成双链体。
25.在一些实施例中，多聚体核酸复合物中的第一核酸、第二核酸、第三核酸、第四核酸或其组合可以为核酸适体(相同或不同)。在其它实施例中，第一核酸、第二核酸、第三核酸、第四核酸或其组合可以为反义寡核苷酸或sirna(相同或不同)。在又一些实施例中，第一核酸、第二核酸、第三核酸和第四核酸中的至少一个与治疗剂缀合，该治疗剂例如小分子药物、肽药物或蛋白质药物。
26.在一些实施例中，第一核酸、第二核酸、第三核酸和第四核酸中的至少两个对同一目的靶分子具有特异性。例如，第一核酸、第二核酸、第三核酸和第四核酸中的至少两个是相同的核酸适体。在一些实例中，第一核酸、第二核酸、第三核酸和第四核酸都是相同的核
酸适体。
27.在一些实施例中，第一核酸、第二核酸、第三核酸和第四核酸中的至少两个对不同的目的靶分子具有特异性。例如，第一核酸、第二核酸、第三核酸和第四核酸中的至少两个是不同的核酸适体。在一些情况下，第一核酸、第二核酸、第三核酸和第四核酸都是不同的核酸适体。在一些实例中，第一核酸、第二核酸、第三核酸和第四核酸中的至少一个为本文公开的抗lag3核酸适体。
28.在一些实例中，第一核酸、第二核酸、第三核酸和第四核酸中的至少一个为核酸适体，并且其它核酸中的至少一个为反义寡核苷酸、sirna或与治疗剂缀合。
29.在一些实施例中，本文公开的多聚体核酸复合物可进一步包括核酸组，其包括第五核酸、第六核酸、第七核酸、第八核酸或其组合，其中核酸组的每个核酸包括与第一核酸、第二核酸、第三核酸或第四核酸互补并与第一核酸、第二核酸、第三核酸或第四核酸形成双链体的部分。第五核酸、第六核酸、第七核酸、第八核酸或其组合可包括核酸适体、反义寡核苷酸或sirna。替代地，第五核酸、第六核酸、第七核酸和第八核酸中的至少一个与治疗剂缀合，该治疗剂例如，小分子药物、肽药物或蛋白质药物。
30.在一些情况下，第五核酸、第六核酸、第七核酸和第八核酸中的至少两个对同一目的靶分子具有特异性。例如，第五核酸、第六核酸、第七核酸和第八核酸中的至少两个(例如，全部)包括相同的核酸适体。在其他情况下，第五核酸、第六核酸、第七核酸和第八核酸中的至少两个(例如，全部)对不同的目的靶分子具有特异性。在一些实例中，第五核酸、第六核酸、第七核酸和第八核酸中的至少一个是本文公开的抗lag3核酸适体。
31.在一些实施例中，第五核酸、第六核酸、第七核酸和第八核酸中的至少一个包括核酸适体，并且其它核酸中的至少一个包括反义寡核苷酸、sirna或与治疗剂缀合。
32.在本文所述的任何多聚体核酸复合物(例如，适体)中，l1、l2、l1'和l2'中的一种或多种(如果适用)为接头，诸如polya或polyt区段，其可由4
‑
10个a或t核苷酸组成。替代地或另外，回文序列由8、10、12、14或16个核苷酸组成。在一些实例中，回文序列为(a/t)4(c/g)4(a/t)4。在一些实施例中，本文所述的多聚体核酸适体中的第一多核酸和第二多核酸中的x和x'，l1和l1'，l2和l2'，以及z和z'中的任一(如果适用)是相同的。
33.此外，本公开的特征在于一种用于调节免疫反应的方法，其包括向有此需要的受试者施用药物组合物，该药物组合物包括结合lag
‑
3的任何核酸适体(如本文所述的单体形式或多聚体形式)和药学上可接受的载体。可以配制用于静脉注射的这种药物组合物也在本公开的范围内。在一些实施例中，本文所述的任何抗lag3适体仅通过单次剂量施用于受试者。
34.在一些实施例中，受试者可为患有、疑似患有癌症或处于癌症风险中的人类患者。实例包含但不限于肺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、肾细胞癌、尿道上皮癌和霍奇金淋巴瘤。在一些实例中，药物组合物可以足以增强t细胞活性和/或抑制癌症生长的量给予患者。
35.此外，本公开的特征在于一种用于检测lag
‑
3阳性细胞的存在的方法，其包括：(i)使疑似表达lag
‑
3的细胞与本文所述的结合lag
‑
3的任何核酸适体(以单体形式或以多聚体形式)接触，其中核酸适体与检测剂缀合；以及(ii)测量从与结合至细胞的核酸适体缀合的检测剂释放的信号；其中信号强度指示lag
‑
3阳性细胞的存在或水平。在一些实施例中，接触步骤(i)通过向有此需要的受试者施用核酸适体或多聚体核酸适体进行。
36.在下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。本发明的其它特征或优点将从以下附图和若干实施例的详细描述以及所附权利要求中变得明显。
附图说明
37.图1a
‑
1e是显示候选lag
‑
3适体候选物的结合活性的图。1a：显示使用所示lag
‑
3适体候选物进行lag
‑
3/mhc
‑
ii生物测定的结果的图。1b：在示例性lag
‑
3适体中鉴定的保守基序(seq id no：1)的示意图。1c：显示lag
‑
3适体与连接于镍包被珠子的his标记的重组lag
‑
3的体外结合结果的图。1d：显示lag
‑
3适体与连接于板的镍包被孔的his标记的重组lag
‑
3的体外结合结果的图。1e：是显示截短形式的lag
‑
3适体b4与连接于镍包被珠子的his标记的重组lag
‑
3的体外结合结果的图。
38.图2a
‑
2e是显示使用尺寸排阻色谱法测定的在lag
‑
3四聚体中的骨架分子和lag
‑
3适体b4_fl的摩尔比的图。2a：骨架：骨架：适体的摩尔比为1:1:10。2b：骨架：骨架：适体的摩尔比为1:1:8。2c：骨架：骨架：适体的摩尔比为1:1:6。2d：骨架：骨架：适体的摩尔比为1:1:5。2e：骨架：骨架：适体的摩尔比为1:1:4。
39.图3a
‑
3j是显示使用尺寸排阻色谱法测定的lag
‑
3四聚体中骨架分子和各种lag
‑
3适体序列的摩尔比的图。3a：由此形成的lag
‑
3适体四聚体中骨架序列r1、r2和适体序列b4_fl的摩尔比。3b：由此形成的lag
‑
3适体四聚体中骨架序列r1_b10_p16和r2_b10_p16与适体序列b4_sl3_p16的摩尔比。3c：由此形成的lag
‑
3适体四聚体中骨架序列r1_b10_p16和r2_b10_p16与适体序列b4_sl8_p16的摩尔比。3d：由此形成的lag
‑
3适体四聚体中骨架序列r1_b10_p16和r2_b10_p16与适体序列b4_sl11_p16的摩尔比。3e：由此形成的lag
‑
3适体四聚体中骨架序列r1_b10_p10和r2_b10_p10与适体序列b4_sl3_p10的摩尔比。3f：由此形成的lag
‑
3适体四聚体中骨架序列r1_b10_p10和r2_b10_p10与适体序列b4_sl8_p10的摩尔比。3g：由此形成的lag
‑
3适体四聚体中骨架序列r1_b10_p10和r2_b10_p10与适体序列b4_sl11_p10的摩尔比。3h：由此形成的lag
‑
3适体四聚体中骨架序列r1_b18_p10和r2_b18_p10与适体序列b4_sl3_p10的摩尔比。3i：由此形成的lag
‑
3适体四聚体中骨架序列r1_b18_p10和r2_b18_p10与适体序列b4_sl8_p10的摩尔比。3j：由此形成的lag
‑
3适体四聚体中骨架序列r1_b18_p10和r2_b18_p10与适体序列b4_sl11_p10的摩尔比。
40.图4a
‑
4c是显示候选lag
‑
3适体候选物的结合活性的图。4a：显示使用用表4所示序列形成的lag
‑
3四聚体进行lag
‑
3/mhc
‑
ii生物测定的结果的图。4b：显示lag
‑
3四聚体与his标记的重组lag
‑
3体外结合结果的图。4c：显示lag
‑
3四聚体与来自不同物种诸如大鼠、小鼠和人的his标记的重组lag
‑
3的体外结合结果的图。
41.图5是显示由适体序列b4
‑
sl3形成的lag
‑
3四聚体的尺寸排阻色谱结果的图。
42.图6a
‑
6c是显示lag
‑
3适体四聚体用于治疗患有结肠肿瘤的异种移植小鼠的用途的图，该结肠肿瘤由皮下接种ct26结肠癌细胞诱导。6a：植入了ct26结肠癌细胞的小鼠的治疗区的图示。6b：显示小鼠植入ct26结肠癌细胞后不同时间点的肿瘤体积的图。6c：在植入ct 26结肠癌细胞后第21天从小鼠中提取的肿瘤的图片。
43.图7a
‑
7d是显示具有回文残基的各种骨架序列的琼脂糖凝胶分析图片。7a：显示具有8个回文残基的骨架序列的琼脂糖凝胶的图片。7b：显示具有10个回文残基的骨架序列的琼脂糖凝胶的图片。7c：显示具有12个回文残基的骨架序列的琼脂糖凝胶的图片。7d：显示
具有16个回文残基的骨架序列的琼脂糖凝胶的图片。
44.图8a
‑
8b是显示使用具有回文残基的骨架序列形成的lag
‑
3四聚体的尺寸排阻色谱结果的图。8a：显示使用具有12个回文残基的骨架序列形成的lag
‑
3四聚体的尺寸排阻色谱结果的图。8b：显示使用具有8个回文残基的骨架序列形成的lag
‑
3四聚体的尺寸排阻色谱结果的图。
45.图9是显示具有不同12个残基回文序列的骨架序列的琼脂糖凝胶的图片。b12p16：seq id no：17。b12p16_1：seq id no：18。b12p16_2：seq id no：19。b12p16_3：seq id no：20。b12p16_4：seq id no：21。b12p16_5：seq id no：22。b12p16_6：seq id no：23。
46.图10a
‑
10b包含显示在小鼠模型中观察到的抗lag3适体(四聚体)与抗pd
‑
l1抗体组合的治疗效果的图。图10a：示例性给药方案的示意图。图10b：显示在用抗lag3适体与抗pd
‑
l1抗体组合治疗的小鼠中肿瘤组的抑制的图。
47.图11是显示携带适体、sirna和/或治疗剂的多个示例性多聚体核酸复合物的示意图。
具体实施方式
48.淋巴细胞活化基因3(lag
‑
3，也称为cd223)是属于免疫球蛋白(ig)超家族的细胞表面分子。其为具有四个胞外ig样结构域的i型跨膜细胞表面蛋白。lag
‑
3通常在活化的t细胞、天然杀伤细胞、b细胞和/或树突细胞上表达。lag
‑
3的天然配体为mhc ii类分子，lag
‑
3与其的结合亲和力高于cd4。作为检查点受体，与ctla
‑
4和pd
‑
1相似，lag
‑
3可负调节t细胞增殖、活化和体内平衡。lag
‑
3在慢性病毒感染期间维持cd8
+
细胞的致耐受性状态和/或cd8
+
细胞耗竭中也可能发挥作用。此外，lag
‑
3还可在树突细胞的成熟和活化中起作用。在人类中，lag
‑
3由lag3基因编码。人lag
‑
3的示例性氨基酸序列可以在genbank登录号np_002277.4下找到。
49.本文提供了能够结合lag
‑
3并阻断其与mhc ii的相互作用，从而调节由lag
‑
3/mhc ii相互作用介导的免疫反应的核酸适体。如在动物模型中观察到的，本文所述的示例性抗lag
‑
3适体，无论是单体形式还是四聚体形式，都成功地抑制了肿瘤的生长。
50.因此，本文描述了抗lag
‑
3适体(单体或多聚体形式)、包括其的药物组合物，以及用本文公开的抗lag
‑
3适体增强免疫活性和/或治疗疾病(诸如癌症)的方法。本文还提供了多聚体核酸复合物的设计，其可用于递送各种治疗剂，包含基于核酸的药剂(例如，适体、反义寡核苷酸和/或干扰rna诸如sirna)、基于蛋白质的药剂(例如，肽药物或蛋白质药物)，或小分子药剂。
51.抗lag
‑
3适体
52.本文描述了核酸适体，其结合人lag
‑
3并干扰其与mhc ii类分子(作为lag
‑
3的天然配体)的相互作用，从而调节免疫反应，例如，由lag
‑
3和mhc ii类分子之间的相互作用介导的免疫反应。因此，本文公开的抗lag
‑
3适体将有效调节免疫反应，这可有益于治疗某些疾病和病症，诸如癌症和免疫病症(例如，自身免疫性病症)。
53.如本文所用的核酸适体是指对特定靶分子(例如，lag
‑
3)具有结合活性的核酸分子(dna或rna)。适体可与特定靶分子结合，从而通过例如阻断靶分子与其天然配体的结合，引起靶分子的构象变化和/或阻断靶分子的活性中心来抑制靶分子的活性。本公开的抗
lag
‑
3适体(呈线性或环状形式)可为rna、dna(例如，单链dna)、经修饰的核酸或其混合物。抗lag
‑
3适体可为非天然分子(例如，含有天然基因中不存在的核苷酸序列或含有天然基因中不存在的修饰核苷酸)。替代地或另外，抗lag
‑
3适体可不含有编码功能肽的核苷酸序列。在一些情况下，抗lag
‑
3适体可为单体的，即，包括靶分子的一个结合位点。替代地，抗lag3适体可以是多聚体的，即，包括一个或多个靶分子的2个或更多个结合位点。参见以下讨论。
54.本文公开的抗lag
‑
3核酸适体可包括富含g的区段(例如，其对于与lag
‑
3分子(例如，人lag
‑
3)结合并干扰其与mhc ii类配体的相互作用发挥重要作用)。在一些实施例中，抗lag
‑
3适体可包括核苷酸基序(a)：gx1gggx2ggtx3a(seq id no：1)，其中x1和x2各自可以独立地为g、c或不存在，和/或x3可以为t或c。在一些实例中，x3可以为t。替代地或另外，x1、x2或两者可以不存在。在其他实例中，x1、x2或两者可以为g或c。在特定实例中，x1、x2或两者均为g。例如，抗lag
‑
3适体可包括ggggggtta(seq id no：24)、gggggggtta(seq id no：25)、ggggggggtta(seq id no：2)或gggggggggtta(seq id no：26)的核苷酸基序。
55.在其他实施例中，抗lag
‑
3适体可包括核苷酸基序(b)：l
‑
(g)
n
‑
l'，其中n为5
‑
9的整数(包括5和9)(例如，5、6、7、8或9；分别为seq id no：3
‑
7)，l和l'为具有互补序列的核苷酸序列，使得抗lag
‑
3适体可以具有发夹结构，其中l/l'形成茎区，而polyg区段形成整个或部分环结构。在一些情况下，区段l的一部分与l'区段的全部或一部分互补。在其它情况下，区段l'的一部分与l区段的全部或一部分互补。
56.基序(a)和基序(b)都含有polyg区段，其预期在适体与lag
‑
3的结合中起重要作用。因此，预期包括任一基序的核酸分子是如本文所述的抗lag
‑
3适体。
57.在一些实例中，本文公开的抗lag
‑
3适体可包括与以下核苷酸序列具有至少85％(例如，90％、95％或98％)相同的核苷酸序列
58.(i)tggggggggttagttcaatacatgcgggcg(seq id no：8)；
59.(ii)tgggggggggttagacttacactcttattcg(seq id no：9)；
60.(iii)agaggggggggttagctgctttaactcatg(seq id no：10)；或
61.(iv)agggggggggttactgcgcatgtatctcag(seq id no：11)。
62.本文公开的此类抗pdl1核酸适体可包括上述(i)
‑
(iv)中的任一核苷酸序列或由上述(i)
‑
(iv)中的任一核苷酸序列组成。
63.两种核酸的“同一性百分比”使用karlin and altschul proc.natl.acad.sci.usa 87:2264
‑
68,1990的算法(如karlin and altschul proc.natl.acad.sci.usa 90:5873
‑
77,1993中进行了改进)测定。将这种算法并入altschul,et al.j.mol.biol.215:403
‑
10,1990的nblast和xblast程序(2.0版)中。blast核苷酸检索可以用nblast程序进行，得分＝100，字长
‑
12，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。当两个序列之间存在缺口时，可以如altschul et al.,nucleic acids res.25(17):3389
‑
3402,1997所述利用gapped blast。当利用blast和gapped blast程序时，可以使用相应程序(例如，xblast和nblast)的默认参数。
64.在其他实施例中，与参考序列(诸如核苷酸序列(i)
‑
(iv)中任一)相比，本文所述的抗pdl1适体可含有多达8个(例如，多达7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个)核苷酸变化。可引入这种变化的位置可基于，例如，可使用计算机算法(诸如mfold)预测的适体的二级结构来确定。例如，双链茎区中的碱基对可突变为不同的碱基对。这样的突变将在该位置保持双
链区中的碱基对，因此将对适体的总体二级结构没有显著影响。这类突变是本领域技术人员所熟知的。例如，a
‑
t对可突变为t
‑
a对。替代地，其可突变为g
‑
c或c
‑
g对。在另一个实例中，g
‑
c对可突变为c
‑
g对。替代地，其可突变成a
‑
t对或t
‑
a对。优选地，一个或多个变化位于核心序列ggggggttaa(seq id no：27)、gggggggtta(seq id no：28)或ggggggggtta(seq id no：29)之外的位置。
65.在一些实例中，抗lag
‑
3适体包括核苷酸序列tggggggggttagttcaatacatg(seq id no：12)。实例包含但不限于：
66.tccctacggcgctaactggggggggttagttcaatacatgcgggcggccaccgtgctacaac(seq id no：13)；
67.acggcgctaactggggggggttagttcaatacatg(seq id no：14)；
68.gctaactggggggggttagttcaatacatgcgggc(seq id no：15)；以及
69.ctggggggggttagttcaatacatgcgggcggcca(seq id no：16)。
70.抗lag
‑
3适体中的任一还可在5'端、3'端或两者处含有锚定区段。当适体在5'端和3'端均含有锚定区段时，两个锚定区段可相同或不同。锚定区段可作为引物结合位点，其可以用于扩增适体序列。替代地或另外地，锚定区段可用作结合位点，用于经由碱基配对将适体连接于骨架核酸以形成多聚体抗lag
‑
3适体。参见下面的讨论。示例性锚定序列包含5'
‑
tccctacggcgctaac
‑
3'(seq id no：30)和5'
‑
gccaccgtgctacaac
‑
3'(seq id no：31)。如本文所述的抗lag
‑
3适体可含有上述整个锚定序列或其部分。下面提供了含有锚定序列的示例性适体(锚定序列斜体；核心序列加粗表示)：
71.5'
‑
tccctacggcgctaactggggggggttagttcaatacatgcgggcggccaccgtgctacaac
‑
3'(seq id no：13)
72.5'
‑
tccctacggcgctaactgggggggggttagacttacactcttattcggccaccgtgctacaac
‑
3'(seq id no：32)
73.5'
‑
tccctacggcgctaacagaggggggggttagctgctttaactcatggccaccgtgctacaac
‑
3'(seq id no：33)
74.5'
‑
tccctacggcgctaacagggggggggttactgcgcatgtatctcaggccaccgtgctacaac
‑
3'(seq id no：34)
75.本文公开的任何抗pdl 1适体可含有约30
‑
100个核苷酸(nt)(例如，35
‑
100nt)的长度。在一些实施例中，包括核酸基序的核酸适体为约40
‑
80nt、40
‑
65nt、40
‑
62nt、50
‑
80nt、60
‑
80nt或70
‑
80nt。在一些实施例中，包括核酸基序的核酸适体为约30
‑
70nt、30
‑
65nt、30
‑
62nt、30
‑
60nt、30
‑
50nt或30
‑
40nt。在一些具体实例中，抗lag
‑
3适体的长度可以在约50nt至约60nt的范围内。
76.通常，术语“约(about、approximately)”意指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内。“约”可以意指小于给定值的
±
30％，优选小于
±
20％，更优选小于
±
10％，更优选小于
±
5％，且更优选小于
±
1％的范围。
77.在一些实施例中，本文所述的抗lag
‑
3适体可以低于20nm(例如，15nm、10nm、5nm、1nm或更低)的解离常数(kd)结合lag
‑
3(例如，人lag
‑
3)。抗lag
‑
3适体可特异性结合人lag
‑
3。替代地，该适体可结合来自不同物种(例如，人、小鼠或大鼠)的lag
‑
3分子。当与在细胞表面上表达的lag
‑
3分子结合时，这种适体可抑制lag
‑
3的活性(从而增加免疫细胞活性，诸如
t细胞活性)至少20％(例如，40％、50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、100倍或1000倍)。抗lag
‑
3适体对lag
‑
3的抑制活性(以及因此增强免疫细胞活性诸如t细胞活性的活化)可通过本领域已知的方法来测定，例如，t细胞增殖测定法，其先前已描述于诸如clay t.m.,et al.,assays for monitoring cellular immune responses to active immunotherapy of cancer,clin cancer res.,may 2001,7,1127；其相关教导通过引用并入本文。应当理解，本文提供的用于测量t细胞活性的方法是示例性的，并不意味着是限制性的。
78.在一些实施例中，本文所述的抗lag
‑
3适体中的任一可含有非天然存在的核碱基、糖或共价核苷间键(骨架)。这种修饰的寡核苷酸赋予期望的性质，例如，增强的细胞摄取、改善的对靶核酸的亲和力和增加的体内稳定性。
79.在一个实例中，本文所述的适体具有修饰的骨架，包含保留磷原子的那些(参见，例如，美国专利号3,687,808；4,469,863；5,321,131；5,399,676和5,625,050)以及不具有磷原子的那些(参见，例如，美国专利号5,034,506；5,166,315和5,792,608)。含磷修饰骨架的实例包含但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基
‑
磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包含3'
‑
亚烷基膦酸酯、5'
‑
亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、磷酰胺(包含3'
‑
氨基磷酰胺和氨基烷基磷酰胺、硫代磷酰胺)、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代氨基磷酸酯和硼酸基磷酸酯，其具有3'
‑
5'键或2'
‑
5'键。这种骨架还包含具有反向极性的那些，即，3'至3'，5'至5'或2'至2'键。不包含磷原子的修饰骨架由短链烷基或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键，或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成。这种骨架包含具有吗啉代键的那些(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲乙酰基和硫代甲乙酰基骨架；亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基骨架；核糖乙酰基骨架；含烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合的n、o、s和ch2组分部分的其它骨架。
80.在另一个实例中，本文所述的适体包含一个或多个取代的糖部分。这种取代的糖部分可以在其2'位包含以下基团之一：oh；f；o
‑
烷基、s
‑
烷基、n
‑
烷基、o
‑
烯基、s
‑
烯基、n
‑
烯基；o
‑
炔基、s
‑
炔基、n
‑
炔基和o
‑
烷基
‑
o
‑
烷基。在这些基团中，烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的c1至c10烷基或c2至c10烯基和炔基。它们还可以在其2'位包含杂环烷基、杂环烷基芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、rna裂解基团、报告基团、嵌入剂、用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团，或用于改善寡核苷酸的药效学性质的基团。优选的取代的糖部分包含具有2'
‑
甲氧基乙氧基、2'
‑
二甲基氨基氧基乙氧基和2'
‑
二甲基氨基乙氧基乙氧基的那些。参见martin et al.,helv.chim.acta,1995,78,486
‑
504。
81.替代地或另外地，本文所述的适体包含一种或多种修饰的天然核碱基(即，腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)。修饰的核碱基包含在美国专利号3,687,808，the concise encyclopedia of polymer science and engineering,pages 858
‑
859,kroschwitz,j.i.,ed.john wiley&sons,1990；englisch et al.,angewandte chemie,international edition,1991,30,613以及sanghvi,y.s.,chapter 15,antisense research and applications,pages 289
‑
302,crc press,1993中所述的那些。这些核碱基中的某些对于增加适体分子与其靶向位点的结合亲和力特别有用。这些包含5
‑
取代的嘧啶、6
‑
氮杂嘧啶和n
‑
2、n
‑
6和o
‑
6取代的嘌呤(例如，2
‑
氨基丙基
‑
腺嘌呤、5
‑
丙炔基尿嘧啶和
5
‑
丙炔基胞嘧啶)。参见sanghvi,et al.,eds.,antisense research and applications,crc press,boca raton,1993,pp.276
‑
278。
82.替代地或另外地，本文所述的抗pdl 1适体可包括一种或多种锁核酸(lna)。lna通常称为不易接近的rna，是修饰的rna核苷酸，其中核糖部分用连接2'氧和4'碳的额外桥修饰。该桥将核糖“锁定”为3'
‑
内(north)构象，这通常在a型双链体中发现。lna核苷酸可用于本文所述的任何抗pdl1适体中。在一些实例中，抗pdl1适体中至多50％(例如，40％、30％、20％或10％)的核苷酸是lna。在一些实例中，抗pdl1适体可包括10、8、6、5、4、3、2或1个lna。
83.本文所述的任何适体可通过常规方法(例如，化学合成或体外转录)制备。本文所述的其预期生物活性可以通过例如以下实例中描述的那些来验证。用于表达任何抗pdl1适体的载体也在本公开的范围内。
84.本文所述的任何适体可通过共价键、非共价键或两者与一个或多个聚醚部分(诸如聚乙二醇(peg)部分)缀合。因此，在一些实施例中，本文所述的适体是peg化的。对于特定分子量的peg部分，本公开并不意图是限制性的。在一些实施例中，聚乙二醇部分的分子量在5kda至100kda，10kda至80kda，20kda至70kda，20kda至60kda，20kda至50kda，或30kda至50kda的范围内。在一些实例中，peg部分具有40kda的分子量。与本文所述的抗pdl1适体缀合的peg部分可以是线性的或支化的。其可以缀合到核酸适体的5'端、适体的3'端或两者。当需要时，peg部分可以共价缀合至核酸适体的3'端。
85.将peg部分与核酸缀合的方法是本领域已知的，并且之前已经在例如pct公开号wo 2009/073820中进行了描述，其相关教导通过引用并入本文。应当理解，peg缀合的核酸适体和用于将peg缀合至本文所述的核酸适体的方法是示例性的而非限制性的。
86.多聚体核酸适体
87.本公开还提供了多聚体形式的核酸适体，即，其含有多于一个适体结合部分，用于结合相同或不同的目的靶分子。在一些情况下，多聚适体是含有四个适体结合部分的四聚体，其可对相同靶分子或不同靶分子具有特异性。相对于单体形式的相同适体结合部分，当多聚体适体含有与相同靶分子的多个结合部分时，预期其对靶分子显示出更高的结合活性。此外，当含有针对不同靶分子的多个结合部分时，多聚体适体将具有多种结合特异性，允许同时结合和调节多个靶标。
88.本文所述的多聚体核酸适体可包括骨架部分，其可共价地或通过碱基配对缀合到多个(例如，2、3或4个)适体部分。在一些实施例中，骨架部分含有两个核酸分子，在每个核酸分子的中间部分含有互补序列。如本文所用，互补序列(包含完全或部分互补序列)是指能够根据标准watson
‑
crick互补规则通过碱基配对形成双链双链体的序列。骨架部分的核酸分子还含有位于互补序列侧翼的核苷酸序列。每个侧翼序列可含有对接位点，其包括与适体序列的一部分(例如，以上部分中讨论的锚定位点)互补的序列，使得对接位点可以通过碱基配对缀合至适体。替代地，侧翼序列可包括适体部分。骨架部分的每个核酸分子中的侧翼序列和互补序列可直接共价连接，或通过接头(诸如polya或polyt区段)共价连接。
89.在一些实施例中，骨架部分可含有两种相同的核酸分子，其可含有如下所述的回文序列。回文序列(也称为反向
‑
反转序列)是指与5'到3'之间的互补序列读数匹配的核苷酸序列(从5'到3'正向)。回文序列倾向于自组装形成茎环(发夹)结构，这在构建多聚体适体复合物中可能存在问题。出乎意料的是，本公开报道了使用包括回文序列的骨架部分成
功构建四聚体适体。这类四聚体表现出所需生物活性，如以下实例所示。
90.在其它实施例中，骨架部分可含有两种不同的核酸分子。骨架部分可与2、3或4个适体部分缀合。在一些情况下，所有适体部分均能够结合相同的靶分子，例如相同的适体部分。在其他情况下，至少两种适体部分能够结合不同的靶分子，即，多特异性适体。
91.在一些实施例中，本文公开的多聚体适体(例如，四聚体)可包括第一多核酸、第一核酸适体和第二核酸适体，所有这些形成复合物。第一多核酸包括核苷酸序列式5'
‑
x
‑
l1‑
y
‑
l2‑
z
‑
3'。x和z各自独立地为含有分别与第一核酸适体和第二核酸适体的一部分互补的对接位点的核苷酸区段，使得第一核酸适体和第二核酸适体能够与第一多核酸中的x和z区段形成碱基对。在一些情况下，x和z是相同的。在其他情况下，x和z(例如，在长度和/或序列上)是不同的。l1和l2各自为接头，其可为polya或polyt区段(例如，含有4
‑
10个a或t残基)。在一些实例中，l1和l2是相同的接头。在其他实例中，l1和l2是不同的接头(例如，序列和/或长度不同)。在一些情况下，l1、l2或两者可以不存在。
92.y为回文序列，其可含有8、10、12、14和16个核苷酸。在一些情况下，回文序列含有(a/t)4(g/c)4(a/t)4的基序。示例性回文序列包含但不限于tcagctga(seq id no：35)、atcagctgat(seq id no：36)、atatcgcgatat(seq id no：37)或atatgacgcgtcatat(seq id no：38)。
93.上文公开的多聚体适体可进一步包括第二多核酸、第三核酸适体和第四核酸适体。第二多核酸可包括核苷酸序列式5'
‑
x'
‑
l1'
‑
y
‑
l2'
‑
z'
‑
3'。x'和z'各自独立地为含有分别与第三核酸适体和第四核酸适体的一部分互补的对接位点的核苷酸区段，使得第三核酸适体和第四核酸适体能够与第二多核酸中的x'和z'区段形成碱基对。在一些情况下，x'和z'是相同的。在其他情况下，x'和z'(例如，在长度和/或序列上)是不同的。在一些实例中，x和x'和/或z和z'是相同的。在其他实例中，x与x'不同和/或z与z'不同。l1'和l2'各自为接头，其可为polya或polyt区段(例如，含有4
‑
10个a或t残基)。在一些实例中，l1'和l2'是相同的接头。在其他实例中，l1'和l2'是不同的接头(例如，序列和/或长度不同)。
94.在一些实例中，上述多聚体适体中的第一多核酸和第二多核酸是相同的分子。在其它实例中，第一多核酸和第二多核酸在至少一个方面不同，例如，不同的对接位点和/或不同的接头。在一些情况下，多聚体适体复合物中的至少两种适体(2、3或4种)结合相同的靶分子。在一个实例中，适体(2、3或4种)是相同的适体分子。在其它情况下，多聚体适体复合物中的至少两种适体(2、3或4种)结合不同的靶分子。
95.本文所述的任何多聚体适体，例如四聚体，可含有一种或多种本文所述的抗lag
‑
3核酸适体。在一些实施例中，多聚体适体是含有1、2、3或4个如本文所述的抗lag
‑
3核酸适体的四聚体。当四聚体含有2个或更多个抗lag
‑
3适体时，抗lag
‑
3适体部分可相同或不同。在一些实例中，四聚体含有四个相同的抗lag
‑
3部分，其可以是本文所述的抗lag
‑
3适体中的任一个。
96.抗lag
‑
3适体可通过碱基配对与多聚体适体中的骨架部分缀合。或者，抗lag
‑
3适体可共价连接至骨架核酸以形成单个多核苷酸链。参见上述讨论。
97.多聚体核酸复合物
98.此外，本公开提供了使用回文序列的多聚体(例如，四聚体)核酸分子的通用设计。适用于制备多聚体核酸分子的回文序列可含有8、10、12、14或16个核苷酸。在一些情况下，
回文序列含有(a/t)4(g/c)4(a/t)4的基序。示例性回文序列包含但不限于tcagctga(seq id no：35)、atcagctgat(seq id no：36)、atatcgcgatat(seq id no：37)或atatgacgcgtcatat(seq id no：38)。
99.示例性四聚体核酸复合物可含有两个多核酸分子，每个多核酸分子包括侧翼为两个核酸区段的回文序列。目的核酸可直接与回文序列连接或通过接头(例如本文所述的那些)与回文序列连接。这两个多核酸分子通过回文序列形成双链体，从而产生本文公开的多聚体核酸复合物。
100.在一些实施例中，两个多核酸分子中回文序列侧翼的至少一个或全部核酸区段包括基于核酸的治疗剂，诸如核酸适体(例如，本文公开的抗lag3核酸适体)、反义寡核苷酸和/或干扰rna(诸如sirna)。替代地或另外地，两个多核酸分子中回文序列侧翼的至少一个或全部核酸区段与治疗剂缀合，该治疗剂可为肽药物、蛋白质药物或小分子药物。肽药物、蛋白质药物或小分子药物是指具有治疗活性的任何肽、蛋白质或小分子。
101.在其它实施例中，本文公开的多聚体核酸复合物可包括一种或多种核酸，每种核酸含有与两个多核酸分子中回文序列侧翼的一个核酸区段的一部分或全部互补的区段，使得另外的核酸与回文序列侧翼的核酸区段形成双链体。在一些情况下，一种或多种另外的核酸可包括基于核酸的治疗剂(相同或不同)，诸如核酸适体(例如，本文公开的任何抗lag3适体)、反义寡核苷酸和/或干扰rna(诸如sirna)。在其他情况下，一种或多种另外的核酸可与基于非核酸的治疗剂缀合，该治疗剂诸如肽药物、蛋白质药物或小分子药物。
102.在一些情况下，本文公开的多聚体核酸复合物可携带与本文所述的那些相同的治疗剂。在其它情况下，本文公开的多聚体核酸复合物可携带多种治疗剂。在一些实施例中，多聚体核酸复合物可含有相同类型的目的核酸(例如，能够与相同靶标结合的核酸适体、反义寡核苷酸或sirna)。替代地，本文所述的多聚体核酸复合物可含有不同类型的目的核酸(例如，结合不同靶标的核酸适体)。在其它实施例中，本文公开的多聚体核酸复合物可包括多种治疗剂，其可为不同类型的分子(例如，肽、蛋白质、核酸和/或小分子)。例如，多聚体核酸复合物可包括靶向与疾病相关的生物标志物的核酸适体和治疗剂，使得适体可将治疗剂引导至生物标志物呈现以发挥其治疗活性的位置。
103.药物组合物
104.可以将一种或多种抗lag
‑
3适体(如本文所述的单体形式或多聚体形式，和/或同样如本文所述的游离形式或peg缀合形式)与药学上可接受的载体(赋形剂)混合以形成用于治疗目标疾病的药物组合物。“可接受的”意指载体必须与组合物的活性成分相容(并且优选地，能够稳定活性成分)，并且对待治疗的受试者无害。药学上可接受的赋形剂(载体)，包含缓冲剂，其是本领域所熟知的。参见，例如，remington:the science and practice of pharmacy 20th ed.(2000)lippincott williams and wilkins,ed.k.e.hoover。
105.用于本发明方法的药物组合物可以包括冻干制剂或水溶液形式的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。参见，例如，remington:the science and practice of pharmacy 20th ed.(2000)lippincott williams and wilkins,ed.k.e.hoover。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且可包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯
甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3
‑
戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，诸如edta；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属复合物(例如，锌蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如tween
tm
、pluronics
tm
或聚乙二醇(peg)。
106.在一些实例中，本文所述的药物组合物包括脂质体，其含有任何lag
‑
3结合适体(以单体形式或多聚体形式，或用于产生适体的载体)，其可以通过本领域已知的方法制备，诸如epstein,et al.,proc.natl.acad.sci.usa 82:3688(1985)；hwang,et al.,proc.natl.acad.sci.usa 77:4030(1980)；以及美国专利号4,485,045和4,544,545中所述。具有延长的循环时间的脂质体公开于美国专利号5,013,556。特别有用的脂质体可以通过反相蒸发方法用包括磷脂酰胆碱、胆固醇和peg衍生的磷脂酰乙醇胺(peg
‑
pe)的脂质组合物生成。脂质体通过限定孔径的过滤器挤出以产生具有所需直径的脂质体。
107.本文所述的抗lag
‑
3适体还可包埋在微胶囊(例如通过凝聚技术或通过界面聚合分别制备，例如，羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳液中。这样的技术是本领域已知的，参见，例如，remington,the science and practice of pharmacy 20th ed.mack publishing(2000)。
108.在其它实例中，本文所述的药物组合物可以以缓释形式配制。缓释制剂的合适实例包含含有lag
‑
3结合适体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成型制品的形式，例如，薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包含聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2
‑
羟乙酯)，或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、l
‑
谷氨酸和l
‑
谷氨酸
‑7‑
乙酯的共聚物、不可降解的乙烯
‑
乙酸乙烯酯、可降解的乳酸
‑
羟基乙酸共聚物(诸如lupron depottm(由乳酸
‑
羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球))，蔗糖醋酸异丁酸酯和聚d
‑
(
‑
)
‑3‑
羟基丁酸。
109.用于体内给药的药物组合物必须是无菌的。这容易通过例如经由无菌过滤膜过滤来实现。可以将治疗性pdl1结合适体组合物置于具有无菌入口的容器中，例如，具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉输液袋或小瓶。
110.本文所述的药物组合物可以是单位剂型，诸如片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、溶液剂或混悬剂，或栓剂，用于口服、肠胃外或直肠施用，或通过吸入或吹入施用。
111.为了制备固体组合物，诸如片剂，可以将主要活性成分与药物载体(例如，常规压片成分，诸如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶)以及其它药物稀释剂(例如，水)混合以形成含有本发明化合物的均质混合物的固体预制剂组合物，或其无毒的药学上可接受的盐。当将这些预制剂组合物称为均质时，意指活性成分均匀地分散在整个组合物中，使得组合物可容易地细分成同等有效的单位剂型，诸如片剂、丸剂和胶囊剂。然后将该固体预制剂组合物细分成含有0.1mg至约500mg本发明活性成分的上述类型的单位剂型。该新组合物的片剂或丸剂可以被包衣或以其他方式复合以提供具有延长作用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可包括内部剂量和外部剂量组分，后者为在前者上
的包封形式。这两种组分可以通过肠溶层分开，该肠溶层用于抵抗在胃中崩解并允许内部组分完整地进入十二指肠或延迟释放。多种材料可用于此类肠溶层或包衣，此类材料包含多种聚合酸和聚合酸与诸如虫胶、鲸蜡醇和乙酸纤维素的材料的混合物。
112.合适的表面活性剂具体包含非离子药剂，诸如聚氧乙烯脱水山梨糖醇(例如，tween
tm 20、40、60、80或85)和其它脱水山梨糖醇(例如，span
tm 20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物将方便地包括0.05％至5％的表面活性剂，并且可以为0.1％至2.5％。应当理解，如果需要，可以添加其它成分，例如甘露醇或其它药学上可接受的溶媒。
113.合适的乳剂可使用市售的脂肪乳液(诸如，intralipid
tm
、liposyn
tm
、infonutrol
tm
、lipofundin
tm
和lipiphysan
tm
)制备。活性成分可溶于预混合的乳液组合物中，或者其可溶于油(例如，大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)和通过与磷脂(例如，卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合而形成的乳液中。应当理解，可以加入其它成分，例如甘油或葡萄糖，以调节乳液的张力。合适的乳液通常含有至多20％的油，例如5％至20％。脂肪乳剂可以包括具有合适尺寸的脂肪液滴，并且可以具有5.5至8.0范围内的ph。
114.乳液组合物可以是通过将抗lag
‑
3适体与intralipid
tm
或其组分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)混合而制备的那些。
115.用于吸入或吹入的药物组合物包含在药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液，以及粉末。液体或固体组合物可含有如上所述的合适的药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，为了局部或全身作用，通过口服或鼻呼吸途径施用组合物。
116.在优选无菌的药学上可接受的溶剂中的组合物可通过使用气体来雾化。雾化溶液可直接从雾化装置吸入，或者雾化装置可以连接到面罩、帐篷或间歇正压呼吸机。溶液、悬浮液或粉末组合物可从以适当方式递送制剂的装置施用，优选口服或经鼻施用。
117.治疗应用
118.单体形式或多聚体形式、游离形式或peg缀合形式的任何抗lag
‑
3适体(所有这些均已在本文中描述)可用于调节免疫活性，例如促进t细胞增殖，从而有效治疗可受益于调节免疫反应的疾病或病症，例如癌症或免疫病症。
119.为了实施本文公开的方法，可以通过合适的途径将有效量的本文所述的含有至少一种抗lag
‑
3适体的药物组合物施用于需要治疗的受试者(例如，人)，所述途径诸如静脉内施用，例如推注或在一段时间内连续输注，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、吸入或局部途径。用于液体制剂的市售喷雾器，包含喷射喷雾器和超声喷雾器可用于施用。液体制剂可直接雾化，而冻干粉可在重构后雾化。替代地，可使用碳氟化合物制剂和定量吸入器将本文所述的含抗lag
‑
3适体的组合物雾化，或作为冻干和研磨的粉末吸入。
120.如本文所用，“有效量”是指单独或与一种或多种其它活性剂组合给予受试者治疗效果所需的每种活性剂的量。在一些实施例中，治疗效果是减少肿瘤负荷、减少癌细胞或增加免疫活性。确定lag
‑
3结合适体的量是否达到治疗效果对本领域技术人员来说是显而易见的。如本领域技术人员所认识到的，有效量根据所治疗的具体病况、病况的严重程度、个体患者参数(包含年龄、身体状况、身材、性别和体重)、治疗的持续时间、同时疗法的性质(如果有的话)、具体的施用途径和保健医师的知识和专业知识内的类似因素而变化。这些
因素是本领域普通技术人员所熟知的，并且可以仅通过常规实验来解决。通常优选使用单个组分或其组合的最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。
121.经验性考虑因素(诸如半衰期)通常将有助于确定剂量。施用频率可在治疗过程中确定和调整，并且通常但不必须基于目标疾病/病症的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。替代地，lag
‑
3结合适体的持续连续释放制剂也是合适的。用于实现持续释放的各种制剂和装置是本领域已知的。
122.在一个实例中，如本文所述的抗lag
‑
3适体的剂量可在已经给予lag
‑
3结合适体的一次或多次施用的个体中根据经验确定。给予个体递增剂量的拮抗剂。为了评估拮抗剂的功效，可追踪疾病/病症的指标。
123.通常，对于本文所述的任何抗lag
‑
3适体的施用，初始候选剂量可以为约2mg/kg。为了本公开的目的，典型的日剂量可以在约0.1μg/kg至3μg/kg，至30μg/kg，至300μg/kg，至3mg/kg，至30mg/kg，至100mg/kg或更多的任何范围内，这取决于以上提及的因素。对于几天或更长时间的重复给药，根据病况，持续治疗直至出现所需的症状抑制或直至达到足以减轻目标疾病或病症或其症状的治疗水平。示例性的给药方案包括施用约2mg/kg的初始剂量，然后每周施用约1mg/kg的lag
‑
3结合适体的维持剂量，或者然后每隔一周施用约1mg/kg的维持剂量。然而，取决于医师希望实现的药代动力学衰减的模式，其它给药方案可能是有用的。例如，可以考虑每周一至四次给药。在一些实施例中，可以使用范围为约3μg/mg至约2mg/kg(诸如约3μg/mg、约10μg/mg、约30μg/mg、约100μg/mg、约300μg/mg、约1mg/kg和约2mg/kg)的剂量。在一些实施例中，给药频率为每一周、每2周、每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周或每10周一次；或每一个月、每2个月，或每3个月或更长时间一次。该疗法的进展通过常规技术和测定容易地监测。给药方案(包含使用的lag
‑
3结合适体)可以随时间变化。在一个具体实例中，可将本文所述的lag
‑
3结合适体以单次剂量给予需要治疗的受试者(例如，需要调节免疫反应的人类患者)。
124.在一些实施例中，对于正常体重的成年患者，可以施用范围为约0.3mg/kg至5.00mg/kg的剂量。具体的给药方案(即，剂量、时间和重复)将取决于具体的个体和该个体的病史，以及各药剂的性质(诸如药剂的半衰期以及本领域熟知的其它考虑因素)。
125.出于本公开的目的，本文所述的lag
‑
3结合适体的合适剂量将取决于具体的lag
‑
3结合适体、疾病/病症的类型和严重程度、施用lag
‑
3结合适体是为了预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床史和对拮抗剂的反应，以及主治医师的判断。临床医师可以施用lag
‑
3结合适体，直到达到实现所需结果的剂量为止。在一些实施例中，所需的结果是降低肿瘤负荷、减少癌细胞或提高免疫活性。确定剂量是否产生所需结果的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。施用一种或多种lag
‑
3结合适体可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况、施用的目的是治疗性的还是预防性的，以及本领域技术人员已知的其它因素。lag
‑
3结合适体的施用可为在预选的时间段内基本上连续的，或者可以一系列间隔剂量进行，例如，在出现目标疾病或病症之前、期间或之后。
126.如本文所用，术语“治疗”是指将包含一种或多种活性剂的组合物应用于或施用于患有目标疾病或病症、疾病/病症的症状或疾病/病症的诱因的受试者，目的是治愈、医治、减轻、缓解、改变、治疗、改良、改善或影响该病症、疾病的症状或疾病或病症的诱因。
127.减轻目标疾病/病症包含延迟疾病的发展或进展，或降低疾病严重程度。减轻疾病
不一定需要治愈的效果。如本文所用，“延迟”目标疾病或病症的发展意指延迟、阻碍、减缓、延迟、稳定和/或推迟疾病的进展。该延迟可以具有不同的时间长度，这取决于疾病的历史和/或被治疗的个体。“延迟”或减轻疾病发展或延迟疾病发作的方法是当与不使用该方法相比时降低在给定时间范围内发展疾病的一种或多种症状的可能性和/或降低在给定时间范围内症状的程度的方法。这种比较通常基于临床研究，使用足以给出统计上显著的结果的多个受试者。
128.疾病的“发展”或“进展”意指疾病的最初表现和/或随后的进展。可使用本领域熟知的标准临床技术检测和评估疾病的发展。然而，发展也指可能无法检测的进展。出于本公开的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包含发生、复发和发作。如本文所用，目标疾病或病症的“发作”或“发生”包含初始发作和/或复发。
129.在一些实施例中，本文所述的lag
‑
3结合适体以足以使肿瘤负荷或癌细胞生长在体内降低至少5％(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大)的量施用至需要治疗的受试者。在其他实施例中，lag
‑
3结合适体以将lag
‑
3活性水平有效降低至少5％(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的量施用。在其他实施例中，lag
‑
3结合适体以将免疫活性有效增加至少5％(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的量施用。
130.取决于待治疗的疾病的类型或疾病的部位，可以使用医学领域的普通技术人员已知的常规方法将药物组合物施用于受试者。该组合物还可以经由其它常规途径施用，例如，通过口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻、颊、阴道或经由植入的贮库施用。如本文所用，术语“肠胃外”包含皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。此外，其可以通过可注射贮库型施用途径施用于受试者，诸如使用1、3或6个月的贮库型可注射或可生物降解的材料和方法。在一些实例中，药物组合物通过眼内或玻璃体内施用。
131.可注射组合物可含有各种载体，诸如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉注射，可以通过滴注法施用水溶性lag
‑
3结合适体，从而输注含有lag
‑
3结合适体和生理学上可接受的赋形剂的药物制剂。生理学上可接受的赋形剂可包含，例如，5％右旋糖、0.9％盐水、林格氏溶液或其它合适的赋形剂。肌内制剂，例如pdl1结合适体的合适的可溶性盐形式的无菌制剂，可以溶于药用赋形剂(诸如注射用水、0.9％盐水或5％葡萄糖溶液)中并施用。
132.在一个实施例中，lag
‑
3结合适体通过位点特异性或靶向局部递送技术施用。位点特异性或靶向局部递送技术的实例包含各种lag
‑
3结合适体的可植入贮库源或局部递送导管(诸如输注导管、留置导管或针导管)、合成移植物、外膜包裹物、分流器和支架或其它可植入装置、位点特异性载体、直接注射或直接施用。参见，例如，pct公开号wo 00/53211和美国专利号5,981,568。
133.也可以使用含有反义多核苷酸、表达载体或亚基因组多核苷酸的治疗组合物的靶向递送。受体介导的dna递送技术描述于，例如，findeis et al.,trends biotechnol.(1993)11:202；chiou et al.,gene therapeutics:methods and applications of direct gene transfer(j.a.wolff,ed.)(1994)；wu et al.,j.biol.chem.(1988)263:
621；wu et al.,j.biol.chem.(1994)269:542；zenke et al.,proc.natl.acad.sci.usa(1990)87:3655；wu et al.,j.biol.chem.(1991)266:338。
134.在基因治疗方案中，在约100ng至约200mg dna范围内施用用于局部施用的含有多核苷酸(例如，本文所述的lag
‑
3结合适体或用于产生这种适体的载体)的治疗组合物。在一些实施例中，在基因治疗方案期间还可以使用约500ng至约50mg，约1μg至约2mg，约5μg至约500μg，以及约20μg至约100μg的dna或更多的浓度范围。
135.待通过本文所述的方法治疗的受试者可以是哺乳动物，例如农场动物、竞技动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。在一个实例中，受试者是人。含抗lag
‑
3适体的组合物可用于在需要治疗的受试者中增强免疫活性，例如t细胞活性。在一些实例中，受试者可以是患有、疑似患有癌症或处于癌症风险的人类患者，该癌症诸如肺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、肾细胞癌、尿道上皮癌或霍奇金淋巴瘤。此类患者也可以通过常规医疗实践来鉴定。
136.患有目标疾病或病症(例如，癌症或免疫病症)的受试者可通过常规医学检查(例如，实验室测试、器官功能测试、ct扫描或超声)来鉴定。疑似患有任何此类目标疾病/病症的受试者可能表现出该疾病病症的一种或多种症状。处于疾病/病症风险中的受试者可以是具有与该疾病/病症相关的一种或多种风险因素的受试者。此类受试者也可以通过常规医疗实践来鉴定。
137.在本文所述的方法中使用的特定给药方案(即，剂量、时间和重复)将取决于特定受试者(例如，人类患者)和该受试者的病史。
138.在一些实施例中，抗lag
‑
3适体可与另一种合适的治疗剂(例如，抗癌剂、抗病毒剂或抗细菌剂)共同使用。替代地或另外地，抗lag
‑
3适体还可与用于增强和/或补充该药剂效力的其它药剂联合使用。
139.对于目标疾病/病症的治疗功效可以通过例如以下实例中描述的方法来评估。
140.诊断应用及其他
141.任何抗lag
‑
3适体也可用于检测lag
‑
3分子和表达此分子的细胞的存在，或用于将治疗剂递送至lag
‑3+
细胞。抗lag
‑
3适体可以是化学合成的，并用官能团进行操纵以在体内或体外与用于诊断目的的治疗剂或可检测标记(例如，成像剂(诸如造影剂))缀合。如本文所用，“缀合的”或“连接的”意指两个实体缔合，优选地具有足够的亲和力，以实现两个实体之间的缔合的治疗/诊断益处。这两个实体之间的缔合可以是直接的或经由接头(诸如聚合物接头)。缀合的或连接的可包含共价或非共价键合以及其它形式的缔合，诸如例如将一个实体包封在另一个实体上或其内部，或将一个或两个实体包封在第三实体(诸如胶束)上或其内部。
142.在一个实例中，如本文所述的抗lag
‑
3适体可以连接于可检测标记，该可检测标记是能够直接或间接释放可检测信号的化合物，使得该适体可以在体外或体内检测、测量和/或鉴定。这种“可检测标记”的实例包含但不限于荧光标记、化学发光标记、比色标记、酶标记、放射性同位素和亲和标记(诸如生物素)。这种标记可以通过常规方法直接或间接缀合至适体。
143.在一些实施例中，可检测标记是适于成像由lag
‑
3/mhc ii相互作用介导的疾病的药剂，其可以是放射性分子、放射性药物或氧化铁颗粒。适用于体内成像的放射性分子包含但不限于
122
i、
123
i、
124
i、
125
i、
131
i、
18
f、
75
br、
76
br、
76
br、
77
br、
211
at、
225
ac、
177
lu、
153
sm、
186
re、
188
re、
67
cu、
213
bi、
212
bi、
212
pb和
67
ga。适用于体内成像的示例性放射性药物包含
111
in羟喹啉、
131
i碘化钠、
99m
tc美溴非林和
99m
tc红细胞、
123
i碘化钠、
99m
tc依沙美肟、
99m
tc大颗粒白蛋白、
99m
tc亚甲基二膦酸盐、
99m
tc巯替肽、
99m
tc奥昔膦酸盐、
99m
tc喷替酸盐、
99m
tc高锝酸盐、
99m
tc司他比锝、
99m
tc硫胶体、
99m
tc替曲膦、铊
‑
201和氙
‑
133。报告剂还可以是染料，例如，荧光团，其可用于检测组织样品中由lag
‑
3介导的疾病。
144.在一些实施例中，将如本文公开的与可检测标记(例如，成像剂)缀合的抗lag
‑
3适体施用于受试者以评估受试者中的lag
‑
3水平。lag
‑
3的这种检测可用于鉴定用于抗lag
‑
3治疗(例如，用本文公开的抗lag
‑
3药物组合物治疗或用抗lag
‑
3抗体治疗)的相关患者。
145.lag
‑
3或lag
‑3+
细胞可通过常规方法使用本文所述的任何适体在体外在样品(例如，疑似含有lag
‑
3的生物样品，包含但不限于血液样品和尿液样品)中检测。在一些情况下，适体可与可检测标记缀合，该可检测标记可直接或间接地释放指示样品中lag
‑
3的存在和/或水平的信号。替代地，抗lag
‑
3适体可用于受试者(例如，如本文所述的人类患者)中lag
‑
3或lag
‑3+
细胞的存在和定位的体内成像。从本文描述的任何诊断测定(体外或体内)获得的结果可指示与lag
‑
3相关的疾病的风险或状态。
146.含有抗lag
‑
3适体的诊断和治疗试剂盒
147.本公开还提供了用于调节(例如，增强)免疫活性(例如，t细胞活性)、减轻癌症(例如，肺癌、黑素瘤、结肠直肠癌或肾细胞癌)和/或治疗癌症或降低癌症风险的试剂盒。这种试剂盒可以包含一个或多个容器，其包括结合lag
‑
3的适体，例如，本文所述的任何适体。
148.在一些实施例中，试剂盒可以包括根据本文所述的任何方法使用的说明书。例如，所包含的说明书可以包括施用适体以治疗、延迟发作或减轻如本文所述的目标疾病的描述。该试剂盒可进一步包括基于鉴定个体是否患有目标疾病来选择适合于治疗的个体的描述。在其它实施例中，说明书包括将适体施用给处于目标疾病风险中的个体的描述。
149.涉及使用lag
‑
3结合适体的说明书通常包含关于预期治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可为单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本发明试剂盒中提供的说明书通常是标签或包装插页(例如，包含在试剂盒中的纸张)上的书面说明书，但是机器可读说明书(例如，磁性或光学存储盘上携带的说明书)也是可接受的。
150.标签或包装插页指示组合物用于治疗、延缓发作和/或减轻与癌症相关的疾病或病症，如本文所述的那些。可以提供用于实践本文描述的任何方法的说明书。
151.此外，本公开提供了用于检测或测量生物样品中lag
‑
3和/或lag
‑3+
细胞的水平或用于体内诊断目的的试剂盒。这种试剂盒可包括一种或多种本文所述的抗lag
‑
3适体，其可以与同样如本文所述的可检测标记缀合。该试剂盒可进一步包括一种或多种用于直接或间接地处理生物样品和/或用于产生或检测从该可检测标记释放的信号的试剂。该试剂盒可进一步包含使用试剂盒中包含的抗lag
‑
3适体进行检测或测量样品中lag
‑
3或lag
‑3+
细胞水平的测定的说明书。该试剂盒可包括如何处理生物样品以及如何进行合适的测定以测量样品中的lag
‑
3或lag
‑3+
细胞的描述。
152.本文所述的试剂盒处于合适的包装中。合适的包装包含但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、柔性包装(例如，密封的聚脂薄膜袋或塑料袋)等。还考虑了用于与特定装置(诸如吸入器、鼻施用装置(例如，雾化器)或输注装置(诸如微型泵))组合使用的包装。试剂盒可具有无菌入口(例如，容器可为静脉输液袋或具有可由皮下注射针穿刺的塞子的小瓶)。该容器
还可以具有无菌入口(例如，该容器可以是静脉输液袋或具有可由皮下注射针穿刺的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是如本文所述的lag
‑
3结合适体。
153.试剂盒可任选地提供其他组分(诸如缓冲液)和解释信息。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插页。在一些实施例中，本发明提供了包括上述试剂盒内容物的制品。
154.一般技术
155.除非另有说明，否则本发明的实施将使用分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。molecular cloning:a laboratory manual,second edition(sambrook,et al.,1989)cold spring harbor press；oligonucleotide synthesis(m.j.gait,ed.,1984)；methods in molecular biology,humana press；cell biology:a laboratory notebook(j.e.cellis,ed.,1998)academic press；animal cell culture(r.i.freshney,ed.,1987)；introduction to cell and tissue culture(j.p.mather and p.e.roberts,1998)plenum press；cell and tissue culture:laboratory procedures(a.doyle,j.b.griffiths,and d.g.newell,eds.,1993
‑
8)j.wiley and sons；methods in enzymology(academic press,inc.)；handbook of experimental immunology(d.m.weir and c.c.blackwell,eds.)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.m.miller and m.p.calos,eds.,1987)；current protocols in molecular biology(f.m.ausubel,et al.,eds.,1987)；pcr:the polymerase chain reaction,(mullis,et al.,eds.,1994)；current protocols in immunology(j.e.coligan et al.,eds.,1991)；short protocols in molecular biology(wiley and sons,1999)；immunobiology(c.a.janeway and p.travers,1997)；antibodies(p.finch,1997)；antibodies:a practical approach(d.catty.,ed.,irl press,1988
‑
1989)；monoclonal antibodies:a practical approach(p.shepherd and c.dean,eds.,oxford university press,2000)；using antibodies:a laboratory manual(e.harlow and d.lane(cold spring harbor laboratory press,1999)；the antibodies(m.zanetti and j.d.capra,eds.,harwood academic publishers,1995)。在没有进一步详细描述的情况下，相信本领域的技术人员可以基于上述描述最大程度地利用本发明。因此，以下具体实施例应被解释为仅仅是说明性的，而不以任何方式限制本公开的其余部分。为了本文引用的目的或主题，本文引用的所有出版物通过引用并入本文。
156.在没有进一步详细描述的情况下，相信本领域的技术人员可以基于上述描述最大程度地利用本发明。因此，以下具体实施例应被解释为仅仅是说明性的，而不以任何方式限制本公开的其余部分。为了本文引用的目的或主题，本文引用的所有出版物通过引用并入本文。
157.实例
158.为了可以更充分地理解本文所述的发明，阐述了以下实例。提供本申请中描述的实例以说明本文提供的系统和方法，并且不以任何方式解释为限制其范围。
159.实例1：lag
‑
3适体的鉴定与表征
160.以人重组lag
‑
3作为靶标，采用高通量的selex测定法，从合成的ssdna文库中鉴定
出候选淋巴细胞活化基因3(lag
‑
3)适体。对此类lag
‑
3适体候选物进行下一代测序，并使用lag
‑
3/mhc
‑
ii生物测定法测试其在破坏lag
‑
3与mhc
‑
ii的相互作用中的活性。发现几种lag
‑
3适体破坏lag
‑
3和mhc
‑
ii之间的相互作用，如荧光素酶报告基因的表达所示。在图1a中提供了示例性结果。用抗lag
‑
3抗体作为阳性对照。图1a。
161.lag
‑
3适体b4、b8、d9和f4在图1a中用箭头标记，这些适体的序列提供在下表1中。序列比对揭示了在鉴定的lag
‑
3适体中的保守基序，如图1b所示。预期包括该保守基序的适体结合lag
‑
3并破坏其与mhc
‑
ii的相互作用。
162.为了直接测试lag
‑
3适体与lag
‑
3的结合，使用连接于板的镍包被珠子或镍包被孔的his标记的重组lag
‑
3进行体外结合测定。将结合的lag
‑
3适体洗脱并通过qpcr检测。利用基于珠子的测定法，适体b4和b8与重组lag
‑
3的结合呈浓度依赖性增加。图1c。使用基于板的测定法，发现适体b4和生物素标记形式的适体b4(bio
‑
b4)以类似方式结合重组lag
‑
3。图1d。
163.表1.示例性lag
‑
3适体的序列。
[0164][0165]
*保守基序以粗体和下划线显示。
[0166]
为了鉴定结合lag
‑
3所涉及的适体b4的最小序列，制备了各种截短形式的适体b4，并在本文所述的结合测定中研究了其与lag
‑
3的结合活性，其中使用r9r作为阴性对照。表2显示了这些截短形式的适体b4的适体序列及其与重组lag
‑
3结合的解离常数(kd)。适体b4、b4
‑
sl2、b4
‑
sl3和b4
‑
sl4与重组lag
‑
3的结合呈浓度依赖性增加。图1e。截短形式的b4
‑
sl5和b4
‑
sl6显示最小至无结合；这两个截短的变体具有上述保守基序的一部分的缺失。图1e。
[0167]
表2.截短的适体b4序列和解离常数。
[0168][0169][0170]
*保守基序或其部分用粗体和下划线显示。
[0171]
这些结果表明，图1b中所示的保守基序对于结合重组lag
‑
3和破坏细胞培养物中的lag
‑
3与mch
‑
ii的相互作用是重要的。因此，预期包括该保守基序的适体具有结合lag
‑
3的活性并破坏其与mch
‑
ii的相互作用。
[0172]
实例2：四聚体形式的lag
‑
3适体的合成和表征
[0173]
使用具有互补区段的两个骨架序列构建四聚体形式的lag
‑
3适体，使得它们可以通过碱基配对一起退火。每个骨架序列可以在5'端和3'端与两个适体连接，从而形成适体四聚体。这种连接使用在每个末端具有与适体序列中的引物序列互补的引物序列的骨架序列实现，该适体序列允许适体与骨架序列的每个末端碱基配对。示例性适体序列和骨架序列示于表3中。
[0174]
表3.示例性骨架和适体序列。
[0175][0176]
*引物序列加下划线。p16表示16残基的引物，而p10表示10残基的引物。
[0177]
将骨架序列和适体序列以各种摩尔比混合，并通过尺寸排阻色谱法分离由此形成的四聚体。如图2a至2e所示，代表游离适体的峰随着适体的摩尔浓度的降低而降低。所得的骨架/适体复合物是含有与4个适体相关的两个骨架分子的四聚体形式。
[0178]
通过将10μm的每个骨架与60μm适体温育，形成不同骨架和适体序列的四聚体。骨架和适体组合以及温育条件示于表4中。使用尺寸排阻色谱法检测由各种骨架和适体序列形成的四聚体中骨架和适体的摩尔比，结果显示在图3a
‑
3j中。在几种四聚体组合的色谱图中检测到多个峰，表明这些组合形成部分结构(例如，图3b
‑
3c)。部分结构包含除所需四聚体之外的结构，例如三聚体或二聚体。检测到对应于四聚体的峰和对应于游离适体的第二个峰，表明形成了所需适体四聚体。图3a和3h。
[0179]
表4.示例性lag
‑
3适体四聚体合成总结。
[0180][0181][0182]
接下来，使用lag
‑
3/mhc
‑
ii生物测定法测试由此形成的lag
‑
3四聚体破坏lag
‑
3与
mhc
‑
ii的相互作用的活性，其中通过荧光素酶报告基因的表达指示lag
‑
3与mhc
‑
ii的相互作用的破坏。如图4a所示，荧光素酶报告基因的表达通常随着四聚体浓度的增加而增加。即使在相对于抗lag
‑
3抗体(333nm)在测定中使用更少的lag
‑
3四聚体(250nm)的条件下，几种lag
‑
3适体四聚体比抗lag
‑
3抗体诱导更多的荧光素酶表达。图4a。这些结果表明，与抗lag
‑
3抗体相比，lag
‑
3四聚体对lag
‑
3与mhc
‑
ii的结合显示出更高的阻断活性。
[0183]
为了验证lag
‑
3四聚体与lag
‑
3结合，使用重组lag
‑
3和lag
‑
3四聚体进行体外结合测定。观察到lag
‑
3四聚体以剂量依赖性方式与lag
‑
3结合。图4b。cd4结构上类似于lag
‑
3，也与mhc
‑
ii结合。然而，未检测到lag
‑
3四聚体与cd4的结合，表明lag
‑
3适体四聚体和lag
‑
3之间的结合是特异性的。图4b。
[0184]
还使用本文所述的体外结合测定法测试了lag
‑
3适体(游离或四聚体形式)与不同物种(例如，大鼠、小鼠和人)的lag
‑
3的结合。结果表明，lag
‑
3适体可与大鼠、小鼠和人的lag
‑
3发生交叉反应。图4c。
[0185]
总之，这些结果表明，游离或四聚体形式的lag
‑
3适体与各种物种的lag
‑
3结合，并且lag
‑
3适体与lag
‑
3的结合抑制了lag
‑
3与mhc
‑
ii的相互作用。
[0186]
实例3：lag
‑
3四聚体防止小鼠形成肿瘤
[0187]
如下研究四聚体形式的lag
‑
3适体的抗肿瘤活性。向小鼠皮下接种ct26结肠癌细胞以允许形成肿瘤异种移植物。然后给小鼠单独施用抗pd
‑
l1抗体或与四聚体形式的lag
‑
3适体或溶媒对照组合施用该抗体。使用骨架和b4
‑
sl3适体序列形成lag
‑
3四聚体。使用尺寸排阻色谱法测定的骨架与适体的摩尔比证实形成了具有b4
‑
sl3适体的lag
‑
3四聚体(图5)。
[0188]
在第3天向小鼠施用1剂lag
‑
3四聚体，或在第3
‑
12天连续施用10剂lag
‑
3四聚体，每天一次。图6a提供了治疗方案的说明。与用单独的pd
‑
l1抗体或溶媒对照处理的小鼠相比，用lag
‑
3四聚体和pd
‑
l1抗体处理的小鼠显示出肿瘤生长显著降低。图6b。与用10剂lag
‑
3适体治疗的小鼠相比，在用1剂lag
‑
3适体治疗的小鼠中观察到肿瘤生长降低，并且与用10mg/kg lag
‑
3四聚体给药相比，使用1mg/kg lag
‑
3四聚体观察到更大的降低。图6c显示了从给予不同治疗的小鼠手术切除的肿瘤。
[0189]
在相关研究中，给小鼠皮下接种ct26结肠癌细胞以允许形成肿瘤异种移植物。将小鼠随机分成5组(每组包含6只小鼠)，每组接受以下处理：(a)溶媒对照(以3天间隔注射6次，然后进行最后一次注射)，(b)抗pd
‑
l1抗体(10mg/kg；以3天间隔注射6次)，(c)lag
‑
3适体(1mg/kg，单剂量)，(d)抗pd
‑
l1抗体(10mg/kg；以3天间隔注射6次)+lag3四聚体(1mg/kg；单剂量)，以及(e)抗pd
‑
l1抗体(10mg/kg；以3天间隔注射6次)和lag3四聚体(1mg/kg；单剂量)；按照图10a中所示的施用方案。如图10b中所示，与溶媒对照相比，抗pd
‑
l1抗体和lag3四聚体的共同施用显著降低异种移植小鼠中的肿瘤体积。出乎意料的是，单剂量的lag3四聚体足以实现抗肿瘤效果。
[0190]
总之，这些结果表明lag
‑
3四聚体可防止ct26结肠癌细胞的肿瘤形成。
[0191]
实例4：利用回文序列退火的相同骨架序列构建lag
‑
3四聚体
[0192]
使用具有回文残基的骨架序列构建lag
‑
3四聚体，该回文残基允许两个相同的骨架序列通过回文残基的碱基配对而退火。通过琼脂糖凝胶分析和尺寸排阻色谱法测试具有8个残基、10个残基、12个残基和16个回文残基的骨架序列的四聚体形成。具有回文残基的适体序列和骨架序列以粗体和下划线显示在表5中。
[0193]
表5.示例性适体和桥序列。
[0194][0195]
*回文残基以粗体和下划线显示。
[0196]
具有8个回文残基(图7a)和12个回文残基(图7c)的骨架序列在仅骨架的泳道中显示单一条带，表明由两个相同的骨架序列退火形成的双链体。相反，具有10个回文残基(图7b)和16个回文残基(图7d)的骨架序列在仅骨架的泳道中显示两个条带，表明对于这些序列没有形成相同骨架序列的双链体。
[0197]
使用尺寸排阻色谱证实了上述结果。观察到在使用具有12个回文残基的骨架序列形成的lag
‑
3四聚体色谱中占优势的单峰(图8a)，表明形成了单一的四聚体结构。在使用具有8个回文残基的骨架序列形成的lag
‑
3四聚体的色谱中观察到两个类似大小的峰(图8b)，表明没有形成相同骨架序列的双链体。这些结果表明使用经12个回文残基退火的相同骨架序列形成了lag
‑
3四聚体。
[0198]
然后，通过琼脂糖凝胶和自由能分析来分析具有不同12残基回文序列的骨架序列的退火。检查具有通式(a/t)4(c/g)4(a/t)4的回文序列的各种组合。
[0199]
如图9和表6所示，回文序列atatcgcgatat(seq id no：17)和atatccggatat(seq id no：18)通过琼脂糖凝胶分析显示超过90％的二聚体形成，其在测试序列中最高。通过琼脂糖凝胶分析检测的回文序列和二聚体百分比和/或单体形成百分比示于下表6中。
[0200]
表6.示例性回文序列和琼脂糖凝胶分析结果。
[0201][0202]
通过回文序列的自由能分析获得了类似的结果。如下表7所示，基于自由能计算，回文序列atatcgcgatat(seq id no：17)和atatccggatat(seq id no：18)有利于在分析的
序列中形成二聚体。
[0203]
表7.示例性回文序列的自由能分析。
[0204][0205]
总之，这些结果证明了使用通过12个回文残基退火的相同骨架序列形成lag
‑
3四聚体，该回文残基具有通式(a/t)4(c/g)4(a/t)4。
[0206]
其它实施例
[0207]
本说明书中公开的所有特征可以任何组合方式组合。本说明书中公开的每个特征可以由用于相同、等同或类似目的的可选特征代替。因此，除非另有明确说明，所公开的每个特征仅仅是等同或类似特征的一般系列的示例。
[0208]
根据以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，其它实施例也在权利要求的范围内。
[0209]
等效物
[0210]
虽然本文已经描述和示出了若干发明实施例，但是本领域的普通技术人员将容易想到用于执行本文描述的功能和/或获得结果和/或一个或多个优点的多种其他装置和/或结构，并且这些变化和/或修改中的每一个被认为是在本文描述的发明实施例的范围内。更一般来说，所属领域的技术人员将容易了解，本文中所描述的所有参数、尺寸、材料和配置意图为示例性的，且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于使用本发明教导的特定应用。所属领域的技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文中所描述的特定发明实施
例的许多等效物。因此，应理解，前述实施例仅以示例的方式呈现，且在随附权利要求书及其等效物的范围内，发明实施例可以不同于具体描述和要求保护的方式实践。本公开的发明实施例涉及本文所述的每个单独的特征、系统、制品、材料、套件和/或方法。另外，两个或更多个这样的特征、系统、物品、材料、套件和/或方法的任何组合，如果这样的特征、系统、物品、材料、套件和/或方法不相互不一致，则包含在本公开的发明范围内。
[0211]
如本文所定义和使用的所有定义应理解为控制字典定义、以引用方式并入的文献中的定义和/或所定义术语的一般含义。
[0212]
本文所公开的所有参考文献、专利和专利申请均以引用的方式并入本文，就其引用的主题而言，其在一些情况下可涵盖整个文献。
[0213]
如本文在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一(a、an)”应理解为意指“至少一”，除非清楚地相反指示。
[0214]
本文在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为是指“任一或两者”这样结合的要素，即在一些情况下联合存在而在其它情况下分离存在的要素。用“和/或”列出的多个要素应当以相同的方式解释，即“一个或多个”这样结合的要素。除了由“和/或”子句具体指明的要素之外，其他要素可任选地存在，无论与具体指明的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，当与开放性语言诸如“包括”结合使用时，对“a和/或b”的提及在一个实施例中可仅指a(任选地包含除b以外的要素)；在另一个实施例中，仅指b(任选地包含除a以外的要素)；在又一个实施例中，指a和b两者(任选地包含其他要素)；等。
[0215]
如本文说明书和权利要求书中所用，“或”应理解为具有与上文定义的“和/或”相同的含义。例如，当将列表中的项目分开时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即，包含多个要素或要素列表中的至少一个，但也包含多于一个，以及任选地，另外的未列出的项目。仅有清楚地相反指示的术语，诸如“仅一”或“恰好一”或，当在权利要求中使用时，“由
……
组成”将指的是包含多个要素或要素列表中的恰好一个要素。通常，当在本文中使用的术语“或”之前有排他性术语，诸如“任一”、“一”、“仅一”或“恰好一”时，应当仅解释为指示排他的替换物(即“一个或另一个但不是两个”)。当在权利要求中使用时，“基本上由
……
组成”应当具有其在专利法领域中使用的普通含义。
[0216]
如本文说明书和权利要求书中所用，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一”应理解为意指选自要素列表中的任何一个或多个要素的至少一个要素，但不必包含在要素列表内具体列出的每个要素和每个要素中的至少一个，并且不排除在要素列表中的要素的任何组合。该定义还允许除了短语“至少一”所涉及的要素列表中具体指明的要素之外的要素可任选地存在，无论与具体指明的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，“a和b中的至少一个”(或，等效地，“a或b中的至少一个”，或，等效地，“a和/或b中的至少一个”)在一个实施例中可以是指至少一个，可任选地包含多于一个，a，其中不存在b(并且可任选地包含除b以外的要素)；在另一个实施例中，至少一个，任选地包含多于一个，b，其中不存在a(并且任选地包含除a以外的要素)；在又一个实施例中，至少一个，任选地包含多于一个，a，和至少一个，任选地包含多于一个，b(并且可任选地包含其他要素)；等。
[0217]
还应当理解，除非清楚地相反指示，否则在本文要求保护的包含多于一个步骤或动作的任何方法中，该方法的步骤或动作的顺序不必限于叙述该方法的步骤或动作的顺序。