抗纤维蛋白-2抗体序列、四肽链分子及免疫球蛋白分子

文档序号:26050388发布日期:2021-07-27 15:25阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2抗体序列,其特征在于,所述抗体序列包括:

所述重链可变区的氨基酸序列为seqidno:1,所述核苷酸序列为seqidno:3;所述轻链可变区的氨基酸序列为seqidno:2,所述核苷酸序列seqidno:4。

2.一种由权利要求1所述抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2抗体序列的重链和轻链通过二硫键连接形成的四肽链分子。

3.一种包含如权利要求2所述四肽链分子的免疫球蛋白分子。

4.一种血清4型禽腺病毒的检测方法,其特征在于,所述血清4型禽腺病毒的检测方法使用权利要求1所述血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2抗体序列。

5.一种治疗血清4型禽腺病毒感染的单抗制备方法,其特征在于,所述治疗血清4型禽腺病毒感染的单抗制备方法使用权利要求1所述血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2抗体序列。

6.一种应用如权利要求1所述抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2抗体对的筛选方法,其特征在于,所述抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2抗体序列对的筛选方法包括以下步骤:

步骤一,噬菌体抗体的制备;

步骤二,噬菌体抗体文库的淘筛;

步骤三,phageelisa方法鉴定抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2鸡源噬菌体单链抗体;

步骤四,将phageelisa鉴定结果为阳性的scfv菌液送测序公司测序,得到鸡源化的抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2的基因工程抗体的重链、轻链可变区序列。

7.如权利要求6所述抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2抗体序列对的筛选方法,其特征在于,步骤一中,所述噬菌体抗体的制备,包括:

将1ml的噬菌体初级抗体库加入到3mlod600=0.5的xli-blue菌液,37℃放置45min,加入6ml含amp+100μg/ml的lb液体培养基,并按1:1000加入葡萄糖1mol/l继续培养,待菌液od600=0.5时,加入辅助噬菌体m13k07,放置37℃温箱感染30min后,220rpm/min,37℃培养1h,将菌液3500rpm离心10min,弃上清,用等体积含有amp+100μg/ml、kana50μg/ml的lb液体培养基,以1:1000加入1mol/l的iptg,220rpm/min,37℃,摇菌6h;将培养基12000rpm,离心10-20min,收集上清;以1:4-1:5的比例加入peg8000,颠倒混匀,此时会出现云雾状沉淀,至4℃冰箱过夜;12000rpm离心10min后收集沉淀,用1.5ml1×pbs重悬沉淀,按1:4-1:5的比例再次加入peg8000,颠倒均匀,至4℃冰箱2-3h,12000rpm离心10min,收集沉淀,用300μl1×pbs重悬沉淀,计算输入淘筛的噬菌体量后,待淘选。

8.如权利要求6所述抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2抗体序列对的筛选方法,其特征在于,步骤二中,所述噬菌体抗体文库的淘筛,包括:

(1)包被:用0.1mnahco3将纯化后的血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2稀释成2μg/ml、4μg/ml和8μg/ml的不同浓度包被96孔酶标板,每孔100μl,放置4℃冰箱过夜;包被完毕后,将96孔酶标板内液体弃掉,每孔加入100μl洗涤缓冲液pbst,清洗3遍;

(2)封闭:每孔加入250μl的封闭液,放入37℃温箱2h进行封闭;

(3)洗涤:每孔加入100μlpbst,共洗涤3次;每次洗涤,用摇板仪以400rpm摇1min,并将酶标板竖立转动一圈,浸润管壁;

(4)加入噬菌体抗体:每孔100μl加入噬菌体抗体,先用摇板仪400rpm/min摇5min,室温孵育1h;

(5)洗涤:重复步骤(3);

(6)洗脱:每孔50μl加入终止液,摇板仪以1000rpm摇5min;每400μl洗脱液加入75μltris-hcl进行中和;将20μl此液体加入到180μlod600=0.5的感受态细胞中,感染20min,将20μl菌液涂在含amp+100μg/ml的lb平板上,37℃培养过夜,计算输出的噬菌体库量,并挑取单克隆菌落摇菌,进行pcr鉴定,并送测序;

(7)取上一级噬菌体抗体库总量的90%,加入3mlod600=0.5的感受态细胞中,感染30min后,加入6mllb液体,并加入终浓度为100μg/ml的氨苄西林和以1:1000加入葡萄糖;待菌液od600=0.5时加入4×1010辅助噬菌体m13k07,静置孵育30min后,以220rpm/min振荡培养1h,3500rpm/min离心6min,弃去上清,用等体积含amp+100μg/ml、50μg/mlkana的lb液体培养基重悬沉淀,37℃,220rpm/min振荡培养过夜;将培养基12000rpm,离心10-20min,收集上清;以1:4-1:5的比例加入peg8000,颠倒混匀,此时会出现云雾状沉淀,至4℃冰箱过夜;12000rpm离心10min后收集沉淀,用1.5ml1×pbs重悬沉淀,按1:4-1:5的比例再次加入peg8000,颠倒均匀,至4℃冰箱2-3h,12000rpm离心10min,收集沉淀,用300μl1×pbs重悬沉淀,得到第一轮单链抗体文库;

(8)进行3-4轮噬菌体淘筛,并每次计算输入及输出的噬菌体库量;并将最后一轮噬菌体库加入50%甘油储存在-80℃冰箱。

9.如权利要求6所述抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2抗体序列对的筛选方法,其特征在于,步骤三中,所述phageelisa方法鉴定抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2鸡源噬菌体单链抗体,包括:

(1)包被:将纯化后血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2用0.1mnahco3稀释成8μg/ml包被96孔酶标板,将bsa设为空白对照,m13k07为阴性对照;

(2)封闭:弃去96孔酶标板中的包被液,每孔200μl封闭液,37℃孵育2h;

(3)洗涤:每孔加入200μlpbst,洗3次,拍干;

(4)加入噬菌体单链抗体:将噬菌体单链抗体与pbst进行1:1混合,每孔200μl加入到96孔酶标板中,室温孵育2h;

(5)洗涤:重复步骤(3);

(6)敷二抗:按1:5000稀释hrp标记抗m13抗体,37℃孵育1h;

(7)洗涤:重复步骤(3);

(8)显色:每孔加入50μltmb显色液,用锡箔纸覆盖,37℃反应10min;

(9)终止:每孔加入50μl2mol/l的h2so4终止反应,酶标仪检测od450数值。

10.如权利要求6所述抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2抗体序列对的筛选方法,其特征在于,所述抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白-2抗体序列对的筛选方法,还包括鸡源抗血清4型禽腺病毒单链抗体文库的构建,包括:

(1)鸡外周血淋巴细胞的分离,对5只实验鸡进行血清4型禽腺病毒灭活疫苗免疫;每次免疫间隔2周,共免疫3次,3次免疫后2周,采集新鲜血液5-10ml与全血及组织稀释液混合均匀,比例为1:1-1:2,在15ml的离心管中加入细胞分离液,并轻轻地沿管壁加入等体积的稀释后的抗凝血;水平离心机以转速400g-800g,时间15-25min进行离心,离心后,离心管内液体应分为四层,由上至下分别为:第一层:血浆层;第二层:淋巴细胞层;第三层:分离液和第四层:红细胞层;用吸管小心吸取第二层乳白色的淋巴细胞至另一15ml离心管中,加入10ml的清洗液进行混匀,以250g,10min离心;重复2-3次,弃上清;将管底的淋巴细胞用含有90%胎牛血清、10%dmso和1%双抗的冻存液进行重悬,分装到2ml的冻存管中,4℃冰箱放置30min,-20℃冰箱放置2h,-80℃冰箱过夜,第二天移至液氮的顺序冻存淋巴细胞;

(2)鸡外周血淋巴细胞总rna的提取,将冻存管中的pbmc移至1.5ml离心管中以1800rpm,离心5min,弃掉上清;留有50-100μl的上清在离心管底部,重悬管底细胞;加入1mltrizol,用移液枪反复吹打均匀,至室温孵育5min;加入0.2ml氯仿,用手剧烈震荡15s,至室温孵育2-3min,冷冻离心机以12000rpm,4℃离心15min,此时液体可分为下层含有dna和蛋白质的有机相,和上层含有rna的透明层;离心管倾斜45度,将透明层移至另一1.5ml离心管中;加入0.5ml异丙醇混匀,室温孵育10min后12000rpm离心10min,弃去上清;加入1ml75%乙醇用漩涡振荡器洗涤,7500rpm,4℃,离心5min,弃上清;将离心管放置超净工作台静置干燥5-10min,用至少30μldepc水重悬溶解,超微量分光光度计测定浓度及a260与a280比值,-80℃保存;

(3)鸡重链可变区vh和轻链可变区vl的扩增,以提取的总rna为模板,采用primescripttmii1ststrandcdnasynthesiskit试剂盒使总rna反转录成cdna,以其为模板,pcr扩增vh基因和vl基因;配制1.5%的琼脂糖凝胶,进行核酸电泳检测鉴定,在凝胶成像仪观察结果,进行胶回收,纯化vh和vl片段;用linker接头的引物通过soe-pcr基因工程方法将重链可变区基因vh分别与轻链可变区基因vl、轻链可变区基因vl组装成scfv基因,形成vl-linker-vh的形式,配制1.0%琼脂糖凝胶,在凝胶成像仪观察结果,进行胶回收,纯化scfv基因片段,将纯化后的scfv基因产物与噬菌体载体pcomb3xss进行酶切与连接;

(4)单链抗体文库的构建,将20μl的的连接产物与80μl电转感受态xli-blue在2.5kv,800ω的条件下进行电击转化,电转杯用1mlsoc培养基进行冲洗,将液体吸至50ml离心管中,220rpm/min,37℃,摇菌45min;分别将10μl、50μl和100μl的菌液涂在含有amp+100μg/ml的平板,鉴定电转效果;在离心管中加入9ml含有amp+100μg/mllb液体培养基,以1:1000加入葡萄糖,220rpm/min,37℃,摇菌至od600=0.5;加入20μl辅助噬菌体m13k07进行拯救,感染30min后摇菌1h;将菌液3000rpm,离心6min,弃上清,用等体积含有amp+100μg/ml、kana的lb液体培养基,以1:1000加入iptg,220rpm/min,37℃,摇菌6h;将培养基12000rpm/min,离心10-20min,收集上清;以1:4-1:5的比例加入peg8000,颠倒混匀,此时会出现云雾状沉淀,至4℃冰箱过夜,12000rpm离心10min后收集沉淀,用1.5ml1×pbs重悬沉淀,按1:4-1:5的比例再次加入peg8000,颠倒均匀,至4℃冰箱2-3h,12000rpm,离心10min,收集沉淀,用300μl1×pbs重悬沉淀,加入50%甘油混匀,放置-20℃保存,按此方法多次建库,建立scfv噬菌体抗体原始文库。


技术总结
本发明属于病毒蛋白抗体技术领域,公开了一种抗纤维蛋白‑2抗体序列、四肽链分子及免疫球蛋白分子,所述病毒蛋白抗体序列包括:所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1,所述核苷酸序列为SEQ ID NO:3;所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2,所述核苷酸序列SEQ ID NO:4。本发明提供的鸡源化抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白‑2抗体的重链、轻链的可变区氨基酸序列和核苷酸序列,为构建高亲和力、低免疫原性的鸡源化抗血清4型禽腺病毒纤维蛋白‑2的基因工程抗体提供支持,对推动血清4型禽腺病毒感染的诊断和鸡源化抗体药物的发展具有重要意义。

技术研发人员:王建琳;尹燕博;徐守振;曲雪婷;高倩文
受保护的技术使用者:青岛农业大学
技术研发日:2021.05.07
技术公布日:2021.07.27
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