性连锁矮小鸡的分子诊断及其在矮小鸡育种中的应用的制作方法

专利名称:性连锁矮小鸡的分子诊断及其在矮小鸡育种中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种分子标记辅助育种的方法，具体地说涉及性连锁矮小鸡的分子诊断及其在矮小鸡育种中的应用。
背景技术：
矮小鸡成年体重只有正常鸡的60～70％，与正常鸡交配的后代杂合子鸡的成年体重也有正常鸡的90％，但矮小鸡产蛋性能并不低于正常鸡。由于矮小鸡体型小，因此用于维持矮小鸡需要的营养物质就低，而矮小鸡的饲料转化率比正常同胞高，因此可节省大量饲料。并且由于其体型小，占用房舍的面积亦比正常型鸡减少40％。单位面积的饲养数和提供的禽产品数较多，降低了饲养成本，提高了经济效益。在肉鸡和蛋鸡的配套系生产中，在其母系中均成功引入矮小(dw)基因，在我国的优质鸡生产中也基本上引入了dw基因，合理利用矮小型鸡不仅可以降低成本，而且可以丰富商品代的种类，因此可以看出，dw基因在鸡育种中起着重要的作用。
现已证明，鸡的性连锁矮小是由于其生长激素受体基因GHR(其编码序列如序列表SEQ ID NO.7所示)突变导致的，不同的矮小型鸡其GHR基因突变的位点并不相同，现已发现至少存在4种以上的不同突变会导致矮小鸡的产生，不同原因导致的矮小鸡其GH与GHR的结合活性不一样，并因此会导致矮小型鸡群在体重和胫长上表现不一致。一个品种内不同个体间如果是由不同原因导致的矮小，则会严重影响其体重和胫长的均匀度，运用其进行杂交时，其后代生产性能也极为不整齐，这使得在利用矮小鸡进行育种时，后代的整齐度受到一定程度的影响。不同的矮小鸡群是由不同突变所导致，有的矮小鸡群内存在多个导致性连锁的突变，目前并未系统地建立检测这些突变的方法，也未研究不同突变对体重及胫长的影响及其互作效应。

发明内容本发明的目的在于提供一种性连锁矮小鸡的分子诊断方法及其在矮小鸡育种中的应用。
如表1所示，导致性连锁矮小鸡是由GHR基因的四个突变所引起，本发明通过检测目的鸡群在这四个位点的基因型，判断目的鸡群是否是由GHR的同种突变产生的矮小鸡，并且可以根据基因型进行筛选，使群体内的GHR基因型具备一致性，从而达到提高目的鸡群体重和胫长的均匀度。
表1鸡生长激素受体基因突变和性连锁矮小鸡表型关系
注a表示将正常鸡的GH结合活性和体重设定为100，矮小型鸡与其比较得到其它数据。
本发明具体建立了检测以上四个突变的方法，包括引物设计、PCR扩增条件、基因型的判断等。以下是检测上述四种基因型的具体技术方案1、II型突变的检测II型突变是在GHR的1744到3516缺失1773bp。因此，可以根据缺失序列的两端序列设计引物，通过PCR扩增并检测。优选地，采用下面引物(参考序列GeneBank登录号AC187590)进行扩增引物5’-GGCAGAAACCCCAAGTTATG-3’5’-TCGGGACAGATCAAAGACAAT-3’PCR扩增条件由于片段较长，其PCR扩增条件有所不同，变性、退火及延伸时间均较长，PCR反应程序94℃3min，35个循环(94℃45s，56℃45s，72℃延伸2min)，延伸10min，4℃保存。
将扩增产物采用1.0％琼脂糖凝胶电泳，缺失后形成的片段大小为253bp，而没有缺失的片段大小为2026bp，所以其基因型可直接根据产物片段大小进行判断。
2、I和IV型突变的检测I和IV型突变仅发生一个碱基的变异，因此，可以考虑通过PCR-SSCP方法检测。
引物C(参考序列GeneBank登录号AC187590)5’-ACACATCCTACACCTCGATTTGG-3’5’-CGAAAGCTTACAGAATCACAC-3’PCR反应程序94℃3min，35个循环(94℃30s，58℃30s，72℃延伸30s)，延伸7min，4℃保存。
将PCR产物变性后电泳，染色，显影。由于碱基的差异，I和IV型突变的单链分子折叠不同，使得其在电泳时的移动速率亦不同，选择不同基因型进行测序，确定是I突变或是IV突变。当然，本发明亦可通过已知的样品作对照，进行扩增并通过SSCP分析，来判断待测样品的突变型。
3、III突变的检测III型突变也只发生了一个碱基的取代，因此亦可通过PCR-SSCP方法检测，优选的引物(参考序列GeneBank登录号AC187590)是引物5’-CCCAGGCTCTCAACAGTG-3’5’-TGAGTAAAGGAAACATAGAGG-3’PCR反应程序95℃5min，35个循环(94℃30s，58℃30s，72℃延伸2min)，延伸7min，4℃保存。
反应体系及基因型判断同I和IV型突变的检测。
本发明的有益效果是，通过以上四个突变的检测，可以知道目的性连锁矮小鸡群是由于哪个突变产生的性连锁矮小鸡，是由单个突变产生还是存在多个突变，从而有目的地进行纯化目的鸡群，提高其体重及胫长的均匀度。并且，本发明所使用的检测方法效率高、准确性高、成本低。
图1是II型突变的检测结果，其中1、6、7定为AA型，即没有缺失片，表现为正常鸡，2、3、4定为BB型，即缺失了1773bp的碱基，表现为矮小鸡，M表示Mark。
图2是I型和IV型突变SSCP检测结果，其中1、2、3、4、5、9、10、11的带型命名为BB型(正常鸡)，7、8的带型命名为AA型，6的带型命名为AB型。
图3是III型突变SSCP检测结果。
具体实施方式下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 II型突变的检测引物(参考序列GeneBank登录号 AC187590)5’-GGCAGAAACCCCAAGTTATG-3’5’-TCGGGACAGATCAAAGACAAT-3’PCR扩增条件由于片段较长，其PCR扩增条件有所不同，变性、退火及延伸时间均较长，PCR反应程序94℃3min，35个循环(94℃45s，56℃45s，72℃延伸2min)，延伸10min，4℃保存。表2是PCR的反应体系。
表2 PCR反应混合体系
将扩增产物采用1.0％琼脂糖凝胶电泳，缺失后形成的片段大小为253bp，而没有缺失的片段大小为2026bp，所以其基因型可直接根据产物片段大小进行判断。检测结果如图1所示，将正常鸡(未发生缺失突变)定为AA型(图1中的2、3、4、5，鸡种有N301和N305)，发生突变的纯合子定为BB型(图1中的1、6、7，鸡种有N309、N308、N303、GF24、GF26和江西矮脚鸡)。
实施例2 I和IV型突变的检测引物C5’-ACACATCCTACACCTCGATTTGG-3’5’-CGAAAGCTTACAGAATCACAC-3’PCR反应程序94℃3min，35个循环(94℃30s，58℃30s，72℃延伸30s)，延伸7min，4℃保存。表3是PCR的反应体系。
表3 PCR反应混合体系
取5μL的PCR扩增产物与2μL的溴酚蓝混合点样，并以DNAMarker作为参照，琼脂糖凝胶的浓度为1.0％(含0.5ug/mL EB染色剂)，1×TAE作为缓冲液，电泳45min左右，电压4-5V/cm，电泳结束后，在紫外透射仪中观察是否有符合大小的扩增产物。
采用单链构像多态性(SSCP)方法本方法采用的是12％的聚丙烯酰胺凝胶，其配制方法如表4所示。
表4 12％的聚丙烯酰胺胶的配备
注TEMED的添加量可随气温略为改变，气温高，可少加一点。
操作过程是4μL上样缓冲液(98％甲酰胺，20mmol/L EDTA，少量二甲苯青及溴酚蓝)与3μL PCR扩增产物在95～100℃之间变性10min，冰水中骤冷5min后上样到聚丙烯酰胺凝胶上电泳。电泳条件150V，8℃，12h。
染色过程蒸馏水冲洗凝胶。
染色用0.1％AgNO3(用前加少许37％甲醛，200μL37％甲醛/100mL 0.1％AgNO3)染色10分钟。
再用蒸馏水冲洗凝胶。
显影加适量显影液(15g NaOH，0.19g四硼酸钠，加dH2O至1000mL.用前加少许37％甲醛，用前加少许37％甲醛，400μL37％甲醛/100mL显影液)显影，时间约20-30分钟。此步骤应十分注意，染色时间过长或过短都会影响染色的效果，时间过长则造成底色过深而不利于条带的分辨，时间过短则造成有些条带还没显影，所以此步骤需仔细观察，看到各条带已出现时再过1至2min就需立刻固定。检测结果如图2所示，(图2是I型和IV型突变SSCP检测结果，其中1、2、3、4、5、9、10、11的带型命名为BB型(不含该突变的鸡，鸡种有江西矮脚鸡、GF24、GF26、N308、N309)，7、8的带型命名为AA型(含该突变的鸡，鸡种有N301、N305、部分N303)，6的带型命名为AB型(杂合型，在N303出现)。
固定用0.75％碳酸钠溶液固定10分钟，聚丙烯酰胺胶若要长期保存则需固定1到2小时。
选择不同基因型进行测序，结果表明AA型为IV型突变，BB型为非突变表型。AB型是杂合型。当然，也可以通过已知样品作对照，进行PCR-SSCP分析，来判断未知样品的基因型。
实施例3 III型突变的检测引物5’-CCCAGGCTCTCAACAGTG-3’5’-TGAGTAAAGGAAACATAGAGG-3’扩增条件、反应体系及基因型判断同I和IV突变的检测。
检测结果如图3所示，只出现一种基因型，送测序后未发现该突变存在，说明各鸡种在该位点没有发生突变。
实施例4本例中收集了国内外8种矮小鸡，分别是江西矮小鸡、GF24、GF26、N308、N301、N305、 N303及N309。样本来源江西矮小鸡血样采自江西省万载县畜牧良种场，其它鸡种来自广东温氏南方家禽育种有限公司。按照实施例1～3的方法分别对上述各鸡种进行检测。检测结果如表5所示。
表5四个性连锁矮小突变位点的分布
*注表中数字是表示鸡的只数，三种基因型之和为该品种所检测的样本含量从上表可以看出，导致以上8个性连锁矮小鸡的原因有三个，一个是缺失引起的性连锁矮小，江西矮小鸡种、GF24、GF26、N308、N309等属于这一原因；二是外显子5-335处(T-C)突变，N305和N301属于这一原因；N303所有个体都存在缺失现象，但在部份个体中也有点突变的情况，这使得该鸡群体重和胫长均匀度差，通过本发明方法，可以筛选出仅含缺失的N303矮小鸡，以提高该鸡群的一致性。
由于不同原因的突变会使其GH与GHR的结合活性不一样，这样会导致不同突变对鸡矮小和体重的影响不一，从而表现出对生产性能的影响不一致，如果以正常鸡表型体重作为100，I类突变只有正常体重的57％，II类突变只有正常体重的70％，III类突变只有正常体重的61％，IV类突变则没有报道(见表1)。这说明不同原因导致的矮小鸡在生产性能上有较大差异，一个矮小群体中如果存在多个矮小突变，就会使其均匀度较差。表6是N303
×N301♀系的体重和胫长情况，从表6中可以看出，在公鸡中表现出体重与胫长的差异，在生长后期(自13周龄)同时含有点突变和缺失的情况下比仅含有点突变的情况下有更高的体重，同时也有更长的胫长，但更长的胫长表现在6-10周龄。在母鸡中二者差异不显著，但也体现出同时含有点突变和缺失的情况下有更高的体重。
表6在N303♂×N301♀系中不同矮小突变位点对矮脚鸡体重胫长及均匀度的影响
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序列表<110>华南农业大学<120>性连锁矮小鸡的分子诊断及其在矮小鸡育种中的应用<130>
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<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>6tgagtaaagg aaacatagag g 21<210>7<211>1827<212>DNA<213>Gallus gallus<220>
<221>CDS<222>(1)..(1827)<400>7atg gat ctt cgg cat ctg ctg ttt act ttg gca ctg gtg tgt gca aat 48Met Asp Leu Arg His Leu Leu Phe Thr Leu Ala Leu Val Cys Ala Asn1 5 10 15gac tca ctt tct gca agt gat gat ctt ctg cag tgg cca caa atc agc 96Asp Ser Leu Ser Ala Ser Asp Asp Leu Leu Gln Trp Pro Gln Ile Ser20 25 30aag tgc agg tca cct gag ctg gag aca ttt tcg tgt tat tgg act gat 144Lys Cys Arg Ser Pro Glu Leu Glu Thr Phe Ser Cys Tyr Trp Thr Asp35 40 45gga aag gtc act act tca gga aca ata caa ctg ttg tat atg aaa agg 192Gly Lys Val Thr Thr Ser Gly Thr Ile Gln Leu Leu Tyr Met Lys Arg50 55 60agt gat gaa gac tgg aaa gaa tgt ccg gat tat atc act gca gga gaa 240Ser Asp Glu Asp Trp Lys Glu Cys Pro Asp Tyr Ile Thr Ala Gly Glu65 70 75 80aat agc tgt tac ttc aac aca tcc tac acc tcg att tgg ata cca tat 288Asn Ser Cys Tyr Phe Asn Thr Ser Tyr Thr Ser Ile Trp Ile Pro Tyr85 90 95tgt gtt aag ctt gcc aat aaa gat gaa gta ttt gac gaa aag tgt ttc 336Cys Val Lys Leu Ala Asn Lys Asp Glu Val Phe Asp Glu Lys Cys Phe100 105 110agt gtt gat gaa ata gta cta cct gat ccc cct gtg cac ctt aac tgg 384Ser Val Asp Glu Ile Val Leu Pro Asp Pro Pro Val His Leu Asn Trp115 120 125act ctg cta aat act agt caa act ggg atc cat ggg gat att caa gta 432Thr Leu Leu Asn Thr Ser Gln Thr Gly Ile His Gly Asp Ile Gln Val130 135 140
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权利要求
1.一种选育矮小鸡的方法，其包括如下步骤a)检测矮小鸡生长激素受体基因GHR的四个突变位点突变型I是编码序列352后2个碱基的T→C的突变，突变型II是编码序列1773开始在外显子10和3’UTR区共缺失1773个碱基，突变型III是编码区644处G→T的突变，突变型IV是编码区335处T→C的突变；b)根据步骤a)的检测结果，将矮小鸡按照基因型分类，筛选出GHR基因型具备一致性的矮小鸡。
2.如权利要求
1所述的方法，其中II型突变的检测方法是用SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，进行PCR扩增，凝胶电泳检测，片段大小为253bp的是突变型，片段大小为2026bp为正常型。
3.如权利要求
1所述的方法，其中I和IV型突变的检测方法是用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物，进行PCR扩增，SSCP检测，将不同基因型的个体送测序，根据测序结果判断是否存在I和IV型突变。
4.如权利要求
1所述的方法，其中III型突变的检测方法是用SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物，进行PCR扩增，SSCP检测，结果送测序，判断是否存在III型突变。
专利摘要
本发明提供了一种性连锁矮小鸡的分子诊断方法及其在矮小鸡育种中的应用。本发明通过检测矮小鸡生长激素受体基因GHR的四个突变位点从而可以判断目的鸡群是由于什么原因导致的性连锁矮小，是否存在多个突变，以此达到纯化矮小鸡群、提高其体重和胫长均匀度的目的。
文档编号C12Q1/68GK1995395SQ200610170713
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月26日
发明者张细权, 欧阳建华, 曾华 申请人:华南农业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan