专利名称：与水稻粒重相关的蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种提高水稻粒重的蛋白及其编码基因与它们的应用。
背景技术：
水稻是重要的粮食作物，世界上接近50%的人口以水稻为食，不断提高水稻产量是人类不断追求的目标。研究表明影响水稻产量的构成要素主要有三个分蘖数、穗粒数和粒重。粒重作为影响水稻产量的重要因素之一渐渐受到人们的广泛重视。水稻在自然演化及人工驯化的过程中，不断满足了人类粮食需求的同时，等位基因的数目也在不断减少，近年来，随着水稻分子设计育种技术的完善，迫切需要根据目前的水稻资源的情况，有效地从中选育出有增加粒重潜力的品种加以遗传改良，或对其控制粒重的基因进行分离和克隆， 具有十分重要的理论意义和实践价值，也是解决当前水稻育种难题的一条行之有效的途径。我国水稻遗传资源丰富，从这些丰富的资源中发掘、定位提高水稻粒重的新基因， 不仅为培育高产水稻新品种提供理论支持，而且对加强我国水稻基因资源的保护，将资源优势变成经济优势具有重要意义。
发明创造内容本发明的目的是提供一种提高水稻粒重的蛋白及其编码基因与它们的应用。本发明提供的提高水稻粒重的蛋白，名称为GS6_t，来源于稻属普通栽培稻 (0. sativa.)籼稻93-11的突变体，是下述1)或2)所述的蛋白质1)序列表中的SEQ ID Na 1的氨基酸残基序列；幻将序列表中的SEQ ID N2 :1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有SEQ ID No 1的氨基酸残基序列相同活性的蛋白质。序列表中序列SEQ ID No 1氨基酸残基序列是由115个氨基酸残基组成的蛋白质。本发明提供的提高水稻粒重的蛋白的编码基因(gs6_t)，其核苷酸序列是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID Na 2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID Na 1蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与1)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。4)与1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。所述高严谨条件为在0. IX SSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。序列表中序列SEQ ID N2 :2的DNA序列由348个核苷酸组成，为该基因的读码框或翻译从ATG起始至TGA终止密码子结束，氨基酸产物即序列表中序列SEQID N2 :1。含有本发明基因的表达载体、细胞系及工程菌均属于本发明的保护范围。扩增
3gs6_t中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。上述gs6_t基因在培育颗粒重提高的转基因水稻中的应用也是本发明的保护内容。本发明还提供一种提高水稻粒重的方法，该方法，是以水稻(Oryza sativa) gs6CGMCC No . 4458作为供体亲本，以待提高粒重水稻品种为受体亲本，通过杂交或回交纯合，筛选隐性纯合植株，即得到粒重高于所述待提高粒重水稻品种的水稻植株。水稻(Oryza sativa) gs6于2010年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号分别为CGMCC Na . 4458。使用gs6_t构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、泛生素基因WDiquitin启动子(ρ^ )等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。携带有本发明编码提高水稻籽粒宽度的基因gs6_t的植物表达载体可通过使用 Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化水稻细胞或组织，并将转化的水稻细胞或组织培育成植株。本发明的发明人在利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变籼稻93-11选择突变体育种材料时发现，当一个原始水稻基因(L0C_0s06g03710)编码区+348位点处碱基G突变为碱基A 后(G348A)，造成原始基因翻译的提前终止和功能的丧失，并引起粒重的显著增加，从而产生了本发明的可以提高水稻粒重的基因gs6-t。实验证明，将含有该突变基因gs6-t的编码框的水稻突变体gs6通过回交方式转入水稻后，可以显著提高水稻粒宽和粒重。该基因对于水稻籽粒宽度分子机制的研究，水稻高产新品种的选育具有重要的理论及实际意义，并为改良作物的千粒重提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
图1为籼稻93-11与突变体gs6籽粒在抽穗期(a)、成熟后(b)和成熟后去壳籽粒 (c)的比较；图2为籼稻93-11与突变体gs6籽粒成熟后粒宽、粒长、粒厚和千粒重的比较；图3将突变体gs6与籼稻93-11、籼稻特青通过回交自交的方法获得隐性纯合植株的粒重的比较。
图4为突变体gs6与籼稻93-11的杂交。图5为突变体gs6与籼稻特青的回交。
具体实施例方式实施例1、提高水稻粒重的基因gs6_t的获得及其功能验证一、提高水稻粒重的基因gs6_t的获得1、水稻(Oryza sativa)突变体gs6的获得及其表型鉴定我们首先利用化学诱变剂EMS对籼稻93-11 (购自国家种质资源库)的种子进行诱变处理，对种子(M0)进行无毒化处理后，然后按常规田间管理方式播种、施肥和防治病虫害，成熟后分单株收获，突变体gs6 (M1)的表型得到初步鉴定粒重较野生型对照(即籼稻 93-11)显著增加约19%。经过仏和礼代重复鉴定，突变体gs6粒型表现为稳定遗传，如图 1展示了籼稻93-11和突变体gs6开花前和成熟后籽粒表型特征。同时选取20株成熟后的籼稻93-11和突变体gs6的籽粒进行表型鉴定(粒宽、粒长、粒厚和千粒重)，如图2所示。水稻(Oryza sativa) gs6于2010年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号分别为CGMCC No . 4458。2、提高水稻粒重的新基因gs6_t的获得构建水稻(Oryza sativa)突变体gs6与籼稻特青(购自国家种质资源库)的F2 分离群体，利用图位克隆的方法进行基因定位，经过对15. 7kb候选区域的测序得知突变体 gs6这种表型的获得是由于籼稻93-11中一个原始水稻基因(LOC 0s06g03710)编码区+348 位点处碱基G突变为碱基A后(G348A)(自序列表中序列2的5'端第348位核苷酸)，造成原始基因翻译的提前终止和功能的丧失(GRAS基因家族保守结构域的完全丧失)，并引起粒重的显著增加。因此，通过上述实验表明，上述通过突变形成的一个新的编码框编码一个提高水稻粒重的新蛋白。利用引物序列为GS6TF 和 GS6TR(GS6TF:5' ATGTTGGCGGGTTGCTCGTT 3 ‘ , GS6TR 5' CCATACCTCATCGCCGTCG 3')可以扩增上述突变后获得的新基因gs6_t编码序列，具体方法如下所述以突变体gs6基因组DNA为模板，以GS6TF和GS6TR为引物，进行PCR扩增，扩增得到348bp的基因片段，测序表明，该片段具有序列表中序列2的核苷酸序列。该片段编码序列表中序列1所示的蛋白，即本发明提高水稻粒重的蛋白，名称为GS6-t。二、提高水稻粒重的基因gs6_t的功能验证1、突变体gs6与诱变亲本籼稻93-11的回交验证我们以水稻(Oryza sativa)突变体gs6为父本(供体)，以诱变亲本籼稻93-11 为母本(受体)进行杂交(F1),在110株&分离群体中得到观个纯合隐性单株(F2，粒型等其它农艺性状均与突变体gs6相同)，野生型与突变型的分离比为3 Kx2 = 0.0121), 说明造成水稻突变体gs6粒宽粒重较诱变亲本籼稻93-11增加的表型变异是由单个隐性基因控制的，即突变基因gs6-t。抽穗期将观个纯合隐性单株套袋自交后分单株收获后(F3) 进行F3代种植，每个F3家系粒型无分离，具体过程如图4所示。植株成熟后对每个隐性纯合F3家系混合收获，选取100粒种子，利用电子天平称其重量，并重复3次，取3次平均值后换算成千粒重。结果如图所示3，各家系与突变体gs6 在粒重无显著差异，但与93-11相比较粒重平均增加19%。2、突变体gs6与籼稻特青的回交验证我们以水稻(Oryza sativa)突变体gs6为父本(供体)，以籼稻特青(受体)为母本进行杂交(F1)，在600株分离群体中选取粒型与突变体gs6完全相同的10株纯合隐性单株(BC1F1),再与籼稻特青进行回交(BC2F1),在各个F2分离群体中(每个F2群体规模在 100株-120之间)，再选取所有粒型与突变体gs6相同的共约150个纯合隐性单株(BC2F2)， 扬花期套袋自交后分单株收获后进行BC2F3代种植，田间观察发现每个BC2F3家系粒型均无分离，具体过程如图5所示。植株成熟后对每个隐性纯合BC2F3家系混合收获，选取100粒种子，利用电子天平称其重量，并重复3次，取3次平均值后换算成千粒重。结果如图3所示，结果表明隐性纯合植株的千粒重不仅显著高于回交亲本籼稻特青，而且显著高于诱变亲本籼稻93-11，增加可达11. 6%。
权利要求
1.一种蛋白，是下述1)和幻所述的蛋白质1)由序列表中的SEQID No 1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的SEQID N2 :1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有SEQ ID N2 :1的氨基酸残基序列相同活性的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述编码基因，其核苷酸序列是下列核苷酸序列之一1)自序列表中SEQID Na 2的DNA序列；2)编码序列表中SEQID No 1蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与1)或2)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。4)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、重组工程菌或转基因细胞系。
5.权利要求2或3所述基因在培育粒重提高的植物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述植物为水稻。
7.一种提高水稻粒重的方法，是以水稻(Oryza sativa)gs6 CGMCC Ns. 4458作为供体亲本，以待提高粒重水稻品种为受体亲本，通过杂交或回交纯合，筛选隐性纯合植株，即得到粒重高于所述待提高粒重水稻品种的水稻植株。
全文摘要
本发明公开了一种提高水稻粒重的蛋白及其编码基因与应用。该蛋白，是下述1)或2)所述的蛋白质1)由序列表中的SEQ ID №.1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的SEQ ID №.1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有SEQ ID №.1的氨基酸残基序列相同活性的蛋白质。本发明的基因可用于培育粒重增加的水稻新品种，具有重要意义。
文档编号C12N15/29GK102532289SQ20101061632
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者付永彩, 刘凤霞, 孙传清, 孙连军, 朱作峰, 李晓娇, 谢道昕, 谭禄宾 申请人:中国农业大学