[0042] 蜂乳蛋白多肽的制备：
[0043] 1)取100g蜂王浆，加入1000g饱和氯化钠溶液，静置2h，5200rpm条件下离心 8min，取上清液；用盐酸将上清液pH值调至4. 2,静置2h，8200rpm条件下离心12min，弃上 清；用pH4. 2的盐酸洗绦沉淀物5次，每次洗绦后，在8200rpm条件下离心12min，弃上清， 即得蜂乳蛋白；
[0044] 2)在步骤1)所得述蜂乳蛋白中，加入20倍体积的浓度0. 4%的稀盐酸溶液，得蜂 乳蛋白溶液；
[0045] 3)将步骤2)所述蜂乳蛋白溶液置于38°C水浴中，加入比活为4000U/g的胃蛋白 酶，使胃蛋白酶的终浓度为〇. 4g/ml，充分酶解，得胃蛋白酶酶解液；
[0046] 4)将步骤3)所得胃蛋白酶酶解液的pH调至8.0,将水浴温度调节至52°C，加入比 活为60000U/g的中性蛋白酶，使终浓度为0. 5g/ml，反应5h;将水浴温度调节至57°C，加入 比活为800000U/g的菠萝蛋白酶，使其终浓度为1. 2g/ml，反应5h，即得酶解液；
[0047] 5)取步骤4)所得酶解液，在73°C的水浴中放置20min;依次使用0. 5ym的滤膜 和截留分子量为5kD的超滤膜过滤，加入活性炭，室温低速搅拌3h后，过滤除去活性炭，真 空浓缩，喷雾干燥，即得蜂乳蛋白多肽。
[0048] 对比例1
[0049] 与实施例1相比，区别仅在于，不进行步骤3)的胃蛋白酶水解，步骤2)后即为步 骤4)。
[0050] 对比例2
[0051] 与实施例1相比，区别仅在于，不进行步骤4)的中性白酶和菠萝蛋白酶水解，步骤 3)后即为步骤5)。
[0052] 实验例1 :多肽分子量的测定
[0053] 检测方法：用0.lmol/L的Tris-HCl洗脱液平衡处理SPhedexG-25凝胶柱， 在220nm的波长下，检测浓度为2mg/ml的标准物质：还原性谷胱甘肽（307Da)、缩宫素 (1007Da)、胰高血糖素（348?a)、和胰岛素（5808Da)，根据标准物质分子量对数和洗脱体 积，拟合得回归方程为：y= -39. 958x+196. 77(R2= 0. 9902);其中，y为洗脱体积，x为相 应分子量的对数值。
[0054] 将各实施例和对比例所得多肽分别配置为浓度为5mg/ml，在上述条件下分别进样 洗脱，将出峰体积带入标准曲线，即可得样品分子量及其分布范围，通过峰面积归一法，确 定不同分子量蛋白肽的相对百分含量，所得结果如表1所示。
[0055] 表1 :多肽分子量分布
[0056]
【主权项】
1. 一种蜂乳蛋白多肽，其特征在于，所述蜂乳蛋白多肽由包括以下步骤的方法制备而 成： 1) 取蜂王浆，加入饱和氯化钠溶液，静置，离心后取上清液；用盐酸将上清液pH值调至 3. 8?4. 2,静置，离心后弃上清，用pH3. 8?4. 2的盐酸洗涤沉淀物，即得蜂乳蛋白； 2) 在步骤1)所得述蜂乳蛋白中，以体积比1:10?20加入浓度0. 3?0. 4%的稀盐酸 溶液，得蜂乳蛋白溶液； 3) 将步骤2)所述蜂乳蛋白溶液置于36?38 °C水浴中，加入胃蛋白酶，充分酶解，得胃 蛋白酶酶解液； 4) 将步骤3)所得胃蛋白酶酶解液的pH调至6. 0?8. 0,将水浴温度调节至48?52 °C， 加入中性蛋白酶，反应3?5h ;将水浴温度调节至53?57 °C，加入菠萝蛋白酶，反应3? 5h，即得酶解液； 5) 取步骤4)所得酶解液，在70?73°C的水浴中放置10?20min ;依次使用0. 4? 0. 5 y m的滤膜和截留分子量为4?5kD的超滤膜过滤，加入活性炭脱苦脱色，真空浓缩，干 燥，即得蜂乳蛋白多肽。
2. 根据权利要求1所述的蜂乳蛋白多肽，其特征在于，所述步骤1)具体为：取蜂王浆， 按重量比1:5?10加入饱和氯化钠溶液，静置1?2h，4800?5200rpm条件下离心3? 8min，取上清液；用盐酸将上清液pH值调至3. 8?4. 2,静置1?2h，7800?8200rpm条件 下离心8?12min，弃上清；用pH3. 8?4. 2的盐酸洗绦沉淀物，即得蜂乳蛋白。
3. 根据权利要求2所述的蜂乳蛋白多肽，其特征在于，所述用pH3. 8?4. 2的盐酸洗涤 沉淀物共洗绦3?5次，每次洗绦后，在7800?8200rpm条件下离心8?12min，弃上清。
4. 根据权利要求1所述的蜂乳蛋白多肽，其特征在于，步骤3)所述胃蛋白酶的加入量 为0? 2?0? 4g/ml，所述胃蛋白酶的比活为2500?4000U/g。
5. 根据权利要求1所述的蜂乳蛋白多肽，其特征在于，步骤4)所述中性蛋白酶的加入 量为0. 3?0. 5g/ml，所述中性蛋白酶的比活为30000?60000U/g。
6. 根据权利要求1所述的蜂乳蛋白多肽，其特征在于，步骤4)所述菠萝蛋白酶的加入 量为0. 8?1. 2g/ml，所述菠萝蛋白酶的比活为400000?800000U/g。
7. 根据权利要求1所述的蜂乳蛋白多肽，其特征在于，步骤5)所述脱苦脱色具体为： 加入活性炭，室温低速搅拌1?3h后，过滤除去活性炭。
8. 根据权利要求1所述的蜂乳蛋白多肽，其特征在于，所述蜂乳蛋白多肽由包括以下 步骤的方法制备而成： 1) 取蜂王浆，按重量比1:5?10加入饱和氯化钠溶液，静置1?2h，4800?5200rpm条 件下离心3?8min，取上清液；用盐酸将上清液pH值调至3. 8?4. 2,静置1?2h，7800? 8200rpm条件下离心8?12min，弃上清；用pH3. 8?4. 2的盐酸洗绦沉淀物3?5次，每次 洗绦后，在7800?8200rpm条件下离心8?12min，弃上清，即得蜂乳蛋白； 2) 在步骤1)所得述蜂乳蛋白中，以体积比1:10?20加入浓度0. 3?0. 4%的稀盐酸 溶液，得蜂乳蛋白溶液； 3) 将步骤2)所述蜂乳蛋白溶液置于36?38 °C水浴中，以浓度0. 2?0. 4g/ml加入比 活为2500?4000U/g的胃蛋白酶，充分酶解，得胃蛋白酶酶解液； 4) 将步骤3)所得胃蛋白酶酶解液的pH调至6. 0?8. 0,将水浴温度调节至48?52 °C， 以浓度0. 3?0. 5g/ml加入比活为30000?60000U/g的中性蛋白酶，反应3?5h ;将水浴 温度调节至53?57°C，以浓度0. 8?1. 2g/ml加入比活为400000?800000U/g的菠萝蛋 白酶，反应3?5h，即得酶解液； 5)取步骤4)所得酶解液，在70?73°C的水浴中放置10?20min ;依次使用0. 4? 0. 5 y m的滤膜和截留分子量为4?5kD的超滤膜过滤，加入活性炭，室温低速搅拌1?3h 后，过滤除去活性炭，真空浓缩，喷雾干燥，即得蜂乳蛋白多肽。
9. 根据权利要求1所述的蜂乳蛋白多肽，其特征在于，所述蜂乳蛋白多肽由包括以下 步骤的方法制备而成： 1) 取蜂王浆，按重量比1:8加入饱和氯化钠溶液，静置1.5h，5000rpm条件下离心 5min，取上清液；用盐酸将上清液pH值调至4. 0,静置1. 5h，8000rpm条件下离心lOmin，弃 上清；用PH4. 0的盐酸洗涤沉淀物4次，每次洗涤后，在8000rpm条件下离心lOmin，弃上清， 即得蜂乳蛋白； 2) 在步骤1)所得述蜂乳蛋白中，以体积比1:15加入浓度0. 35 %的稀盐酸溶液，得蜂 乳蛋白溶液； 3) 将步骤2)所述蜂乳蛋白溶液置于37°C水浴中，以浓度0. 3g/ml加入比活为3000U/ g的胃蛋白酶，充分酶解，得胃蛋白酶酶解液； 4) 将步骤3)所得胃蛋白酶酶解液的pH调至7.0,将水浴温度调节至50°C，以浓度 0. 4g/ml加入比活为50000U/g的中性蛋白酶，反应4h ;将水浴温度调节至55°C，以浓度 1. Og/ml加入比活为600000U/g的菠萝蛋白酶，反应4h，即得酶解液； 5) 取步骤4)所得酶解液，在72°C的水浴中放置15min ;依次使用0. 44 y m的滤膜和截 留分子量为4kD的超滤膜过滤，加入活性炭，室温低速搅拌2h后，过滤除去活性炭，真空浓 缩，喷雾干燥，即得蜂乳蛋白多肽。
10. 权利要求1?9任意一项所述蜂乳蛋白多肽在制备化妆品、食品、保健品或药品中 的应用。
【专利摘要】本发明涉及了一种蜂乳蛋白多肽。蜂乳蛋白具有多重护肤功效，被广泛应用于护肤品中，然而，大分子的蜂乳蛋白难以通过皮肤直接被机体吸收，使其功效难以充分发挥。为了克服现有技术中的缺陷，本发明从蜂王浆中提取出富含营养物质的蜂乳蛋白，依次使用胃蛋白酶、中性蛋白酶和菠萝蛋白酶在适宜的pH值条件下对蜂乳蛋白进行酶解，获得酶解液后，再依次使用0.4～0.5μm的滤膜和截留分子量为4～5kD的超滤膜过滤，从而获得分子量小于1000Da的蜂乳蛋白多肽。本发明将蜂乳蛋白以小分子量多肽的形式进行应用，促使其功效的充分发挥，经检测，本发明提供的蜂乳蛋白多肽的DPPH清除率可达80％以上，具有优异的清除自由基效果，并且可以促进皮肤弹性的改善，具有抗衰老功效。
【IPC分类】C07K1-34, C12P21-06
【公开号】CN104593460
【申请号】CN201410842666
【发明人】陈 光, 刘洁, 赵云霞
【申请人】唯美度科技（北京）有限公司
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年12月30日