一种洗脱介孔硅材料表面吸附的多肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种多肽洗脱方法，具体地说，是一种将吸附在介孔硅材料表面的多肽与介孔硅材料分离的方法。
【背景技术】
[0002]血浆中的内源性肽大多是生物体内组织或细胞微环境中的酶解反应产物，反映了机体的生理和病理状态，是一类潜在的疾病标志物，在疾病诊断和临床治疗等方向具有重要的意义。然而绝大部分的内源性肽在血浆中的含量极低，如白细胞介素6的浓度为05pg/mL (Mol.Cell Proteomics, 2002，1，845),远远超出了目前质谱的检测能力。此外,血衆中高含量的大蛋白(如血清白蛋白，浓度为35-50mg/mL)和盐会对液相分离系统产生损害，对低含量多肽的直接质谱检测产生严重的干扰。因此，对血浆样品进行前处理是必要的步骤，此过程必须同时具备富集低分子量多肽和排除蛋白及盐的能力。
[0003]介孔材料孔径分布在2_50nm，具有比表面积大、孔径均一可调节、多样的孔形貌等独特的性质，自出现以来就受到广泛关注。将介孔材料应用于多肽萃取时，其均一的孔结构可以将蛋白排除在孔外，而通过疏水、静电或亲和等作用将多肽保留在孔内，实现对低含量肽的富集。Tian等首次将介孔材料MCM-41用于血浆中内源性肽的选择性萃取，认为MCM-41对多肽的吸附是基于硅氧桥键与多肽之间的疏水作用(Angew.Chem.，2007，119，980)。后来该组相关工作通过将血浆的PH值调节到2.5，来抑制表面硅羟基的解离，从而增强材料与多肽之间的疏水作用(J.Sep.Sc1.，2007，30，2204)。在上述两种萃取条件下，均依次用IMNaCl溶液和50%ACN来洗脱吸附在材料表面的多肽。实践表明，这两种洗脱液对多肽的洗脱效果都很差。因此发展一种简单、高效的多肽洗脱方法，对提高多肽的回收率及检测灵敏度十分重要。
【发明内容】
[0004]为解决现有技术中多肽洗脱效果差的问题，本发明提供一种洗脱介孔硅材料表面吸附的多肽的方法，以有机溶剂与盐溶液的混合溶液对吸附在介孔硅材料上的多肽进行洗脱。方法简单可靠，有效解决了介孔硅材料萃取多肽时回收率低的问题。
[0005]本发明的技术方案是:
[0006]一种洗脱介孔硅材料表面吸附的多肽的方法，其特征在于:以有机溶剂与盐溶液的混合溶液对吸附在介孔硅材料上的多肽进行洗脱，其中，盐溶液的PH值大于7，且不低于碱性最强多肽的等电点2个pH单位。
[0007]所述盐溶液的浓度为0.05-1M，其中，阳离子为Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Al3+、NH4+和N(CH3)4+ 中的一种或两种以上，阴离子为 0H_、F_、CUr_、N03_、S042_、P043_、HC03_ 和 CH3C00_ 中的一种或两种以上。
[0008]所述有机溶剂能与所述盐溶液混溶，优选碳数1-5的一元或二元醇、丙酮、丁酮、乙腈、丙腈、乙酸甲酯和乙酸乙酯中的一种或两种以上。
[0009]所述一元或二元醇为甲醇、乙醇、异丙醇、丁二醇。
[0010]所述有机溶剂与盐溶液的体积比为1:50-10:1。
[0011]所述多肽的分子量不闻于lOKDa。
[0012]所述介孔硅材料为纳米、微米颗粒或薄膜。
[0013]现有技术中采用50%ACN和NaCl溶液依次洗脱时，分别削弱了多肽与介孔硅材料之间的疏水或静电相互作用。实践表明，多肽分子与介孔硅材料表面同时存在上述两种相互作用，本技术方案以有机溶剂与碱性盐溶液的混合液为洗脱液，可同时削弱两种相互作用，对吸附在介孔硅材料表面的多肽具有很强的洗脱能力。与现有技术相比，本技术方案的主要区别在于:
[0014]I)现有技术(Angew.Chem.，2007，119，980 ；J.Sep.Sc1.，2007，30，2204)采用有机溶剂和NaCl溶液交替洗脱的方法，操作步骤多，且洗脱效果差；而本发明以有机溶剂和碱性盐溶液的混合液一步洗脱，大大缩短了处理时间，节省了成本，提高了效率，并且洗脱过程中有机溶剂与碱性盐溶液协同作用，更有利于多肽的洗脱，显著优于现有技术的洗脱效果O
[0015]2)现有技术中采用的盐溶液为中性NaCl溶液，而本发明中的盐溶液为碱性盐溶液，其可改变介孔硅材料表面与多肽分子的带电状态，更有利于削弱静电相互作用，大大提高了洗脱效率。
[0016]本发明具有如下优点:
[0017]1、通过以有机溶剂与碱性盐溶液的混合液为洗脱液，有效改善了对吸附在介孔硅材料表面多肽的洗脱效果，提高了多肽的回收率，有利于提高检测灵敏度。
[0018]2、一次洗脱即可获得好的洗脱效果，避免了多次交替洗脱时操作繁琐、耗时等问题，节省了成本，提高了效率。
[0019]3、适用范围宽，对分子量不高于1KDa的多肽均有很好的洗脱效果。4、所采用的洗脱液中盐浓度较低，无需除盐处理即可进行质谱检测，兼容性好。
[0020]5、对生物样品中的内源性多肽进行萃取时，由于洗脱效果好，能够大大增加鉴定到的多肽数目，非常有利于疾病标志物的发现及多肽组学的研究。
【附图说明】
[0021]图1介孔硅材料MCM-41对pH=3的多肽标准样品萃取后，采用不同洗脱液时目标多肽的回收率。
[0022]图2介孔硅材料MCM-41对pH=7的多肽标准样品萃取后，采用不同洗脱液时目标多肽的回收率。
[0023]图3介孔硅材料SBA-15对pH=3的多肽标准样品萃取后，以ACN/100mMNH4HCO3 (1:1, v/v)为洗脱液时目标多肽的回收率。
【具体实施方式】
[0024]实施例1:MCM_41萃取酸性多肽样品的洗脱方法
[0025]I)pH=3的多肽标准样品制备:将8种多肽(pepl_8)的混合标样用20mM的磷酸缓冲溶液(pH=3)溶解，得到浓度为1.125pmol/yL的标准样品。
[0026]2)多肽萃取:取500yL10mg/mL介孔硅材料MCM-41 (孔径:3.5nm,比表面积:800m2/g)的悬浮液于离心管中，离心后，去上清液。加入500 μ L上述多肽标准样品，振摇后离心。然后将材料用500 μ L纯水清洗两次。
[0027]3 )负载多肽的洗脱:将吸附了多肽的材料分别用500 μ L50%ACN、IM NaCl、ACN/10mM NaCl (1:1, v/v)和 ACN/100mM NH4HCO3 (1:1, v/v) (10mM NH4HCO3 的 pH值为 8.0)
进行洗脱。洗脱液经氮气吹干后复溶，进行LC-MS/MS分析。
[0028]4)分析结果:MCM_41对pH=3的多肽标准样品萃取后，采用不同洗脱液时目标多肽的回收率如图1所示。结果表明，50%ACN和IM NaCl的洗脱效果都很差，ACN/1OOmMNaCl (1:1, v/v)的效果较好，而ACN/100mM NH4HCO3 (1:1, v/v)效果最好，对3种分子量较低的多肽 P印3 (P1: 8.22;MW: 758)、pep6(P1:6.74;MW: 897.9)和 pep8(P1:8.59;MW: 1142.7)和 5 种分子量较高的多肽 P印I (P1: 5.99;MW: 1522.4)、pep2(P1:8.75;MW: 1639.4)、P印7 (P1: 6 ;MW: 1773.4)、pep4(P1:4.66;MW:1902.4)和 pep5(P1:4.28;MW:3511.6)的回收率均最高。
[0029]实施例2:MCM-41萃取中性多肽样品的洗脱方法
[0030]I) pH=7的多肽标准样品制备:将以上8种多肽的混标用20mM的磷酸缓冲溶液(pH=7)溶解，得到浓度为1.125pmol/yL的标准样品。
[0031]2)多肽萃取:取500 μ L10mg/mL介孔娃材料MCM-41 (孔径:3.5nm，比表面积:800m2/g)的悬浮液于离心管中，离心后，去上清液。加入500 μ L上述多肽标准样品，振摇后离心。然后将材料用500 μ L纯水清洗两次。
[0032]3 )负载多肽的洗脱:将吸附了多肽的材料分别用500 μ L50%ACN、IM NaCl、ACN/10mM NaCl (1:1, v/v)和 ACN/100mM NH4HCO3 (1:1, v/v)进行洗脱。洗脱液经氮气吹干后复溶，进行LC-MS/MS分析。
[0033]4)分析结果:MCM_41对pH=7的多肽标准样品萃取后，采用不同洗脱液时目标多肽的回收率如图2所示。结果表明，IM NaCl的洗脱效果最差，50%ACN和ACN/100mMNaCl (1:1, v/v)的效果较好，ACN/1OOmM NH4HCO3(1:1, v/v)效果最好，对5种酸性多肽p印5、pep4、pepl、pep7和pep6和3种碱性多肽pep3、pep8和pep2的回收率均最高。
[0034]实施例3 =SBA-15萃取酸性多肽样品的洗脱方法
[0035]I) pH=3的多肽标准样品的制备:将以上8种多肽的混标用20mM的磷酸缓冲溶液(pH=3)溶解，得到浓度为1.125pmol/yL的标准样品。
[0036]2)多肽萃取:取500 μ L10mg/mL介孔娃材料SBA-15 (孔径:8nm,比表面积:650m2/g)的悬浮液于离心管中，离心后，去上清液。加入500 μ L上述多肽标准样品，振摇后离心。然后将材料用500 μ L纯水清洗两次。
[0037]3)负载多肽的洗脱:将吸附了多肽的材料用ACN/100mM NH4HCO3 (1:1, v/v)进行洗脱。洗脱液经氮气吹干后复溶，进行LC-MS/MS分析。
[0038]4)分析结果:SBA_15对pH=3的多肽标准样品萃取后，以ACN/100mMNH4HCO3 (1:1, v/v)为洗脱液时目标多肽的回收率如图3所示。结果表明，7种目标多肽的回收率都大于80%。由于P印6在上清液中有残留(59.7%，RSD=5.2%)，所以回收率较低，但该洗脱液对吸附在材料上的部分接近完全洗脱。
【主权项】
1.一种洗脱介孔硅材料表面吸附的多肽的方法，其特征在于:以有机溶剂与盐溶液的混合溶液对吸附在介孔硅材料上的多肽进行洗脱，其中，盐溶液的PH值大于7，且不低于碱性最强的多肽的等电点2个pH单位。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述盐溶液的浓度为0.05-lmol/L，其中，阳离子为Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Al3+、NH4+和N(CH3)4+中的一种或两种以上，阴离子为0H_、F_、Cl' Br' NO3' SO42' PO43' HCO3^ 和 CH3COCT 中的一种或两种以上。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述有机溶剂能与盐溶液混溶，有机溶剂为碳数1-5的一元或二元醇、丙酮、丁酮、乙腈、丙腈、乙酸甲酯和乙酸乙酯中的一种或两种以上。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述一元或二元醇为甲醇、乙醇、异丙醇、丁二醇。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:有机溶剂与盐溶液的体积比为1:50-10:1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述多肽的分子量不高于lOKDa。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述介孔硅材料为纳米、微米颗粒或薄膜。
【专利摘要】本发明涉及一种洗脱介孔硅材料表面吸附的多肽的方法，其特征在于：以有机溶剂与盐溶液的混合溶液对吸附在介孔硅材料上的多肽进行洗脱，其中，盐溶液的pH值大于7，且不低于碱性最强多肽的等电点2个pH单位。方法简单可靠，有效解决了介孔硅材料萃取多肽时回收率低的问题。
【IPC分类】C07K1-14
【公开号】CN104693268
【申请号】CN201310667460
【发明人】杜燕, 吴大朋, 关亚风
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2013年12月10日